白細胞介素1受體頡頏劑抑制脂多糖促奶牛外周血單個核細胞氧化應激損傷作用的研究

■ 郭詠梅 齊敬宇 閆素梅 趙艷麗 郭曉宇

（內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

機體內低濃度的自由基對于維持動物正常生理功能至關重要，而自由基的過度積累會導致氧化應激發生并發展為炎癥性疾病[1-2]。處于氧化應激狀態的奶牛，通常免疫功能較低，還伴隨著生產性能的下降。因此，深入研究氧化應激的發生機制是改善奶?？寡趸庖吖δ?，探索減緩氧化應激措施的重要前提。在奶牛生產中，革蘭氏陰性菌感染是導致嚴重氧化損傷和炎癥的主要因素之一，這會提高牛的發病率和死亡率，影響生長速度，從而給經濟帶來損失。因此，研究革蘭氏陰性菌引起的氧化損傷對預防或減少疾病具有重要意義。脂多糖（LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，越來越多的證據表明，LPS 會導致編碼各種促炎細胞因子的基因表達增加，用于研究細胞氧化損傷的發生及其減緩作用，但其誘導氧化應激發生的確切機制尚不明確。

LPS 是白細胞介素1β（IL-1β）等炎癥因子的誘導劑[3]，促炎細胞因子IL-1β是由巨噬細胞產生，可以介導機體多種器官炎癥和組織損傷。一氧化氮（NO）是機體內起到重要作用的活性氮（RNS）自由基，具有抗菌、抗病毒、免疫等作用；但是過量的NO 會損害細胞結構、引發氧化應激[4]。炎癥因子如IL-1β等可以通過活化一氧化氮合酶（iNOS）導致NO 過量生成，從而引發氧化應激和細胞凋亡[5]。因此，LPS 誘導細胞產生氧化應激可能是通過IL-1β等炎癥因子誘發大量NO 產生介導發生的。白細胞介素1 受體頡頏劑（IL-1Ra）是一種能夠抑制IL-1β信號傳導的炎性細胞因子受體頡頏劑，主要通過調控IL-1β的生成來治療由氧化應激引起的炎癥疾病[6]。研究表明，在氧化應激狀態下，IL-1Ra有效抑制了小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的升高、丙二醛（MDA)和脂質過氧化物含量的降低，IL-1Ra 通過抑制氧化應激損傷和炎癥反應，減少了小鼠腸細胞凋亡[7]。人小膠質細胞相關的研究中也發現，注射IL-1Ra可以顯著降低IL-1β和白細胞介素-6（IL-6）含量，有效地下調IL-1β的基因表達，減緩由LPS誘導的炎癥和疾病反應[8-9]。上述研究結果提示，IL-1Ra 可能通過阻斷IL-1β過量釋放，抑制信號傳導，進而對細胞氧化損傷發揮保護作用。然而，目前關于PBMCs 的相關研究很有限。外周血單個核細胞（PBMCs）是免疫系統中抗感染的關鍵細胞，主要包括B 淋巴細胞、單核細胞等，這些細胞是機體免疫中不可或缺的一部分，可以反映機體感染和疾病的發生程度、評估機體免疫功能的強弱[10]。PBMCs 的氧化應激與多種疾病的發生發展密切相關。課題組前期以奶牛PBMCs 為模型，研究建立了LPS 誘導的PBMCs 細胞氧化損傷模型，確定了適宜的LPS劑量和時間（10 μg/mL 作用24 h）[11]，但其是否與IL-1β的釋放有關尚不清楚?；谇捌谘芯?，為更好地了解奶牛的生理和免疫特點，試驗以PBMCs 為體外研究模型，LPS 為應激源，利用IL-1Ra 抑制IL-1β的活性，探究LPS 誘發PBMCs 氧化損傷是否與IL-1β的過量釋放有關，并篩選可以對LPS 誘導氧化損傷發揮最佳保護作用的IL-1Ra 劑量，為后續深入探討奶牛PBMCs 氧化應激的發生機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

IL-1Ra（AF-480-SP）購自RD 公司；LPS（L2880）購自美國Sigma 公司；牛外周血單個核細胞分離液（LDS1084）購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；RPMI-1640 基礎培養基、胎牛血清均購自美國Gibco 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司；PBS緩沖液購自美國HyClone公司；MDA、GPx、T-SOD和CAT的活性及T-AOC測定使用的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；IL-1β、IL-6、NO 濃度和TrxR、iNOS 活性測定使用的ELISA試劑盒均購自睿信生物科技有限公司。

1.2 試劑配制

1.2.1 LPS細胞工作液的配制

用超純水將LPS 粉末溶解，經逐級稀釋依次配制成濃度為1 mg/mL、100 μg/mL 的一級、二級母液。LPS二級母液與基礎培養基以1∶9進行溶解混勻，配制成LPS工作液，濃度為10 μg/mL。工作液經0.22 μm的過濾器過濾后避光保存。

1.2.2 IL-1Ra細胞工作液的配制

IL-1Ra 粉末與超純水以1∶10 混合溶解，配制成100 μg/mL 的IL-1Ra 一級母液，進一步依據試驗要求用基礎培養基稀釋，配制成IL-1Ra 工作液，終濃度為1 ng/mL。工作液經0.22 μm 的過濾器過濾后避光保存。

1.3 PBMCs的分離與培養

參照鄭亞光等[11]報道的方法，PBMCs采用單次密度梯度離心分離法培養。尾靜脈采血后12 h 內進行PBMCs 的分離處理。將血樣與PBMCs 分離液以1∶1的比例緩慢混合于離心管中，1 300 r/min離心40 min，為保證較高的細胞獲得率，離心溫度控制在25 ℃以下，離心后從上至下依次為血漿層、白色云霧狀PBMCs 層、透明分離液層和紅細胞層，吸取PBMCs層。經PBS 清洗重懸后的PBMCs 接種于25 cm2培養瓶中于培養箱中培養（37 ℃、5%CO2），68 h 后離心收集細胞進行后續試驗（1 000 r/min離心15 min）。

1.4 試驗設計

采用單因子完全隨機設計，分別給予PBMCs 不同的處理：第1組是陰性對照組（Neg 組），完全培養基培養30 h；第2組損傷組（Dam組），是在完全培養基中培養6 h 后，再經10 μg/mL 的LPS 工作液培養24 h；第3 至7 組（R0.25、R0.5、R1、R5 組和R10 組）細胞分別經濃度為0.25、0.5、1、5、10 ng/mL 的IL-1Ra 培養6 h，接著經10 μg/mL的LPS工作液培養24 h。每個處理組6個重復。

1.5 樣品采集與處理

細胞活力：將PBMCs接種于96孔板中（接種密度6×106個/mL，200 μL/孔），用于細胞活力的測定。

細胞培養液：將PBMCs接種于24孔板中（接種密度6×106個/mL，1.5 mL/孔），處理結束后離心收集細胞培養液上清液（4 ℃、1 000 r/min離心10 min），用于炎癥因子的測定。

細胞酶活樣品：將PBMCs接種于24孔板中（接種密度6×106個/mL，1.5 mL/孔），處理結束后收集細胞懸浮液，PBS清洗后加入細胞裂解液，4 ℃條件下裂解30 min，后離心收集上清液（1 000 r/min離心10 min），用于細胞酶活測定。

1.6 測定指標與方法

采用CCK-8 法測定細胞活力[12]。采用黃嘌呤氧化酶法測定細胞培養液中的T-SOD 活性；比色法測定細胞培養液中的CAT活性；鉬酸銨顯色法測定細胞培養液中的T-AOC；二硫代二硝基苯甲酸法測定細胞中GPx 活性；采用酶聯免疫法（ELISA）測定細胞中TrxR 含量[13]。細胞培養液中的NO、IL-1β、IL-6 和iNOS 含量均采用酶聯免疫法（ELISA）測定[12]。硫代巴比妥酸法測定細胞中MDA 含量[13]。操作步驟按照試劑盒說明書進行，使用BioTekman Synergy H1 酶標儀進行檢測。

1.7 數據統計

整理后的數據采用SAS 9.0統計軟件的單因素方差分析（ANOVA）程序對所有處理進行顯著性檢驗和Duncan’s 多重比較。統計結果P≤0.05 表示組間差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 IL-1Ra 對LPS 誘導損傷的PBMCs 細胞活力與抗氧化指標的影響

如表1所示，與Neg組相比，Dam 組細胞活力顯著降低（P≤0.05）；與Dam 組相比，R0.25、R0.5、R1、R5 組和R10 組的細胞活力均顯著升高（P≤0.05）；隨著IL-1Ra 劑量的增加PBMCs 的細胞活力呈現先升高后降低的趨勢，且R1和R5組顯著高于其他IL-1Ra添加組（P≤0.05）。

表1 IL-1Ra對LPS誘導損傷的PBMCs的細胞活力和抗氧化酶活性的影響

表1 中，抗氧化酶活性與細胞活力的變化趨勢相似。與Neg 組相比，Dam 組TrxR、GPx、CAT 和T-SOD活性和T-AOC 顯著降低（P≤0.05）；而與Dam 組相比，R0.5、R1、R5組中上述指標均顯著升高（P≤0.05），且隨著IL-1Ra劑量的增加均呈現先升高后下降趨勢；其中R1 和R5 組的GPx、CAT 活性和T-AOC 顯著高于其他IL-1Ra 保護組（P≤0.05）；R1 組的TrxR 活性顯著高于其他IL-1Ra 保護組（P≤0.05）；R0.5、R1 和R5 組的TSOD活性顯著高于其他IL-1Ra保護組（P≤0.05）。

2.2 IL-1Ra 對LPS 誘導損傷的PBMCs 炎癥因子、NO濃度與iNOS活性的影響

由表2 可知，與Neg 組相比，Dam 組的MDA 含量顯著升高，IL-1β、IL-6和NO 含量及iNOS活性呈現相似的變化（P≤0.05）。與Dam組相比，不同劑量IL-1Ra添加組的MDA、IL-6 和NO 含量及iNOS 活性均顯著降低（P≤0.05），只是變化程度不同；其中R1 組的IL-6含量及iNOS 活性顯著低于其他IL-1Ra 保護組（P≤0.05）；R1 和R5 組的MDA、NO 含量顯著低于其他IL-1Ra 添加組（P≤0.05）；與Dam 組相比，R0.5、R1、R5 和R10 組的IL-1β的含量顯著降低（P≤0.05），但R0.5、R1和R5三組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 IL-1Ra對LPS誘導損傷的PBMCs的炎癥因子和NO濃度的影響

3 討論

LPS 是先天免疫系統的有效激活劑，可以通過Toll 樣受體4（TLR4）信號誘導巨噬細胞/單核細胞激活和炎癥細胞因子的產生。LPS 會引起炎癥因子的釋放，導致一連串的信號傳導與反應，對細胞的損害比LPS 本身要嚴重得多，特別是炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-6。在一定范圍內增加炎癥細胞因子的濃度可以改善免疫功能，而過度增加則表現為免疫功能紊亂和炎癥反應加劇。在一項關于小鼠軟骨細胞的研究中發現LPS 誘發了細胞的氧化損傷，導致細胞增殖率明顯下降，同時炎癥細胞因子的水平IL-6、白細胞介素-8（IL-8）和TNF-α等及其基因表達水平顯著上調[14]。還有人研究發現，LPS 誘導NO 過量釋放和iNOS 基因表達過度。當活性氧（ROS）和NO 等自由基產生過量并超過自身的清除能力時，過量的自由基會破壞體內的氧化還原平衡，導致細胞的氧化應激，進而導致更多炎癥細胞因子釋放，如IL-1、IL-6 和TNF-α。因此，氧化應激與炎癥反應密切相關。SOD、CAT、過氧化物酶和GPx等屬于酶促脫毒系統，能有效清除過量的ROS 自由基，并通過阻止自由基鏈式反應而發揮細胞保護系統的作用，從而減少組織損傷的程度[15]。有報道發現氧化應激與抗氧化酶活性及含量的改變息息相關，且其細胞內氧化應激相關的調控因子參與調控疾病的發生發展[16]，因此，炎癥因子濃度和抗氧化酶活性的變化可作為成功建立細胞氧化應激模型的判別標準。PBMCs是一組重要的免疫效應細胞，在先天和后天免疫中發揮著重要作用，介導炎癥和病原體清除，監測體內感染和疾病的發展；由單核細胞組成的單核吞噬系統不僅是先天免疫的重要組成部分，而且還通過呈遞激活淋巴細胞的抗原來觸發獲得性免疫；主要是由淋巴細胞介導的體液和細胞免疫反應。Bastin等[17]研究發現，10 ng/mL 的LPS 處理PBMCs 22 h 后，使GPx和SOD 活性顯著下降，而炎癥因子IL-1β、IL-6、MDA和NO 含量顯著升高，誘發細胞產生氧化應激和炎癥反應；這與本研究結果一致，與Neg 組相比，Dam 組中抗氧化酶、炎癥因子呈現與上述結果相似的變化，說明本研究中LPS 導致細胞內氧化還原平衡遭到破壞，誘導PBMCs發生了氧化應激。

IL-1Ra 是IL-1 的天然抑制劑，阻斷IL-1 介導的信號通路[18]。IL-1是早期全身炎癥反應的重要因子，主要包括IL-1α和IL-1β，兩者發揮生物學功能需要與細胞膜上的受體結合，進而介導激活相關信號通路。IL-1α和IL-1β作為促炎性細胞因子可以被IL-1Ra 頡頏，進而減緩IL-1α和IL-1β活性。作為一種典型的促炎癥細胞因子，IL-1一方面通過促進其他促炎癥細胞因子的表達和刺激中性粒細胞浸潤來啟動實現擴大炎癥反應。另一方面，它們促進巨噬細胞和中性粒細胞的活化和脫顆粒，促進炎癥細胞釋放生物活性物質，如前列腺素和血小板活化因子，并增加內皮細胞和上皮細胞的滲透性[19]，進而引發慢性炎癥疾病，故IL-1Ra 在臨床醫學中被廣泛應用。研究發現，IL-1Ra 能有效減少LPS 誘導的人類牙髓細胞中IL-1β的過量合成，這表明IL-1Ra 能減緩炎癥反應[20]。關于小鼠的研究也進一步佐證了IL-1Ra 緩解LPS 誘發氧化應激和炎癥反應的作用[21]。在本試驗中，以LPS 為應激誘導劑誘導PBMCs 氧化損傷，并加入IL-1Ra 以探究其對氧化應激的緩解作用。結果顯示，當IL-1Ra 濃度為0.25 ng/mL 時，PBMCs 中MDA 含量、炎癥細胞因子IL-6、NO 含量和iNOS 活性顯著降低，IL-1β含量也減少，而抗氧化酶TrxR、GPx 和T-SOD 的活性明顯提高，緩解了PBMCs 的氧化損傷。IL-1Ra 濃度達到1 ng/mL 時，對減輕PBMCs 的氧化應激作用最明顯；炎癥因子濃度、iNOS 活性達到最低水平，而除GPx 外其他抗氧化酶活性達到最高水平LPS 誘導的NO 過量釋放和PBMCs 中的氧化應激是由IL-1β產生的，而IL-1Ra 通過抑制IL-1β的活性而減緩了LPS 誘導的氧化應激，這種調節作用有一個閾值，適宜濃度的IL-1Ra 可以減輕LPS 誘導的氧化損傷和PBMCs 中的炎癥反應，但當超過這個閾值時，緩解效果就會下降。在本研究條件下，1 ng/mL 濃度的IL-1Ra 表現出良好的緩解作用。課題組前期[22]研究表明，在奶牛乳腺上皮細胞的氧化應激損傷模型中，添加10 μg/L 的IL-1Ra 對奶牛乳腺上皮細胞的氧化損傷和炎癥反應起到保護作用且效果最好。這說明IL-1Ra 盡管對不同種類的動物細胞產生的氧化應激具有減緩作用，但劑量不完全相同。

4 結論

IL-1Ra通過抑制IL-1β的活性，降低了iNOS活性和NO的過量釋放，對LPS引起的PBMCs氧化損傷的減緩作用具有劑量依賴效應，以添加水平1 ng/mL為宜。