烏司他丁通過抑制鐵死亡減輕重癥急性胰腺炎模型的急性腎損傷

周少英, 王玉梅, 劉 博, 楊 珍, 李歡歡, 陳志飛, 蘇 靜

(1.河北省邯鄲市中心醫院, 河北 邯鄲 056008 2.河北省邯鄲市第一醫院中西醫結合科, 河北 邯鄲 056002)

【關鍵字】 胰腺炎; 烏司他丁; 鐵死亡; 腎損傷

急性胰腺炎(AP)是胃腸道疾病住院的主要原因,由于生活習慣改變和飲酒增加,其發病率逐年增加[1]。AP的嚴重程度分為輕度、中度和重度,輕度急性胰腺炎不會危及生命,但中度至重度病例可導致高死亡率,且重度 AP(SAP)其發病率和死亡率明顯高于中度SAP,同時,持續超過48h的持續性器官衰竭的死亡率約為50%[2]。急性腎損傷(AKI)是急性胰腺炎患者一種常見且顯著的并發癥,發病率在10%～42%,死亡率高達約80%[3]。急性腎損傷的組織學特征為腎小管細胞死亡和炎癥,被認為是誘發因素,鐵死亡是一種鐵和ROS依賴的調節細胞死亡形式,它涉及一系列獨特的形態學、生化和遺傳特征,不同于其他類型的調節細胞死亡,鐵死亡與多種生理和病理過程有關,包括癌癥、AKI、神經退行性疾病、缺血/再灌注損傷和T細胞免疫[4]。值得注意的是,在所有組織中,腎臟似乎對鐵依賴性鐵死亡最敏感。鐵死亡調節劑谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)失活通過觸發小鼠腎小管細胞的鐵死亡來誘導急性腎衰竭。烏司他丁(Ulinastatin,UTI)是一種來源于人尿液的糖蛋白,分子量為67kDa,可作為多種蛋白酶的抑制劑,包括胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,彈性蛋白酶和各種胰腺酶[5]。多項臨床研究和動物實驗報道,烏司他丁的應用在預防感染性休克、強化胰腺炎、缺血再灌注器官損傷和多器官功能障礙方面可發揮重要作用,這種保護與烏司他丁的抗炎作用有關[6]。烏司他丁對重癥急性胰腺炎誘導的鐵死亡引起的急性腎損傷的影響機制尚不清楚。因此,本研究評估烏司他丁對重癥急性胰腺炎誘導的鐵死亡引起的急性腎損傷的保護作用,探討了烏司他丁抑制鐵死亡誘導的過氧化脂積累的分子機制。

1 資料與方法

1.1動物:從鄭州大學動物中心購買24只成熟的Wistar雄性大鼠(體重220～250g)。將大鼠飼養在受控的氣候環境中,光照/黑暗循環為12h/12h,并被允許自由進食和飲水。所有實驗均經鄭州大學機構動物護理和使用委員會批準,符合美國國立衛生研究院實驗動物使用標準。

1.2重癥急性胰腺炎大鼠模型的建立及分組:大鼠經3%戊巴比妥鈉(20mg/kg)腹腔麻醉后,將5%?；悄懰徕c(1mL/kg)逐漸引入膽管,建立SAP大鼠模型[7]。對照組大鼠給予等量生理鹽水,SAP誘導后6h,通過腹膜內注射烏司他丁,劑量分別為50000U/kg和100000U/kg。將24只Wistar雄性大鼠隨機分為4組,每組6只:對照組(Control),重癥急性胰腺炎組(SAP),重癥急性胰腺炎組+低劑量烏司他丁組(SAP+UTI-L),重癥急性胰腺炎組+高劑量烏司他丁組(SAP+UTI-H)。各組大鼠在建模成功后24h后再次麻醉,通過穿刺后腔收集血液樣品,并通過離心分離血清并在-80℃下冷凍直至實驗。使用多聚甲醛(4%)快速固定腎臟,將多余的組織儲存在-80℃以進行進一步分析。

1.3蘇木精和伊紅(H&E)染色:將福爾馬林固定的腎組織嵌入石蠟中并切成2μm厚的切片,這些切片用H&E溶液染色。使用光學顯微鏡在×400的原始放大倍率下捕獲圖像,包括上皮簡化、刷緣缺失、根尖起泡、上皮細胞脫落、腎小管擴張和管型形成。以對損傷腎小管的百分比進行分級:所有正常小管為“0”;“1”表示<10%損傷小管;“2”表示10～25%損傷小管;“3”表示26～75%損傷小管;4%表示>75%損傷小管。

1.4腎功能評估:將血液樣品在4℃下以3000rpm離心10min,收集血清并儲存在-80℃。分別使用尿素氮檢測試劑盒和血清肌酐檢測試劑盒檢測血液樣品中尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)含量。

1.5ELISA:使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測量腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6),超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS),谷胱甘肽過氧化酶4活性的水平。

1.6鐵測量:腎臟組織用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)勻漿,離心后收集上清。根據說明書使用鐵含量檢測試劑盒測定鐵水平。

1.7Western blot:從大鼠腎臟中提取總蛋白,并使用BCA蛋白測定試劑盒,使用8～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(50μg),并轉移到聚偏氟乙烯膜上。將膜與一抗(ACSL4,GPx4,FTH1和GAPDH)在4℃孵育過夜,然后在37℃下與HRP偶聯的二抗孵育2h,使用增強型化學發光試劑觀察蛋白質條帶。使用Image J軟件檢查相對于GAPDH的蛋白質水平。

1.8qRT-PCR:使用TRIzol和RNeasy試劑盒和DNaseI消化分離總RNA。使用PrimeScriptTM RT試劑盒進行逆轉錄反應,并使用SYBR預混料Ex Taq Ⅱ試劑盒,使用補充表S2中列出的適當引物進行稀釋的互補DNA(cDNA)進行qRT-PCR分析。對于microRNA,進行莖環逆轉錄反應,并將2-ΔΔCt采用該方法計算RNA基因與GAPDH和U6表達的相對豐度。見表1。

表1 引物序列表

2 結 果

2.1烏司他丁減輕SAP誘導的AKI中的腎功能不全和腎小管損傷:H&E染色結果顯示,烏司他丁可以減輕SAP誘導后大鼠腎組織的病理損傷,如圖1A所示,為評估腎小管的組織學變化,我們分析大鼠腎組織學染色的損傷評分。圖1B損傷評分結果顯示,與Control組相比,SAP組的腎組織損傷評分明顯升高,且SCr和BUN水平顯著增加,經烏司他丁治療后,與SAP組相比,SAP+UTI-L(P<0.01)和SAP+UTI-H(P<0.01)組腎組織損傷評分顯著降低,Cr(P<0.05)和BUN(P<0.01)水平有明顯下降,且差異具有統計學意義。

圖1 烏司他丁減輕SAP誘導的AKI大鼠腎臟的病理損傷和腎功能障礙

2.2烏司他丁降低SAP誘導的AKI大鼠血清中炎癥反應:研究表明腎損傷常伴炎癥反應激活,圖2結果表明,與Control組相比,SAP組中TNF-α和IL-6水平顯著增加(P<0.01),差異具有統計學意義。然而,烏司他丁的治療有效地平衡了炎癥反應,特別是在高劑量下。炎癥因子TNF-α和IL-6表達水平顯著降低。

圖2 烏司他丁降低SAP誘導的AKI大鼠血清炎癥反應

2.3烏司他丁降低SAP誘導的AKI大鼠血清中氧化應激:氧自由基可以攻擊多不飽和脂肪酸,然后觸發細胞內脂質過氧化,誘導細胞死亡和損傷。MDA的量可以反映細胞內脂質過氧化的程度,間接反映細胞損傷的程度。圖3結果表明,與Control組相比,SAP組中MDA,H2O2和ROS的水平顯著增加(P<0.01),SOD水平明顯下降(P<0.01),差異具有統計學意義。烏司他丁的治療后MDA,H2O2和ROS顯著降低,而SOD水平增加。

圖3 烏司他丁降低SAP誘導的AKI大鼠血清氧化應激

2.4烏司他丁對SAP誘導的AKI大鼠鐵死亡的影響:鐵在急性腎損傷和鐵死亡的啟動過程中起關鍵作用,因此,我們研究了鐵水平的變化,圖4A結果發現,與Control組相比,SAP組中腎鐵濃度顯著增加(P<0.01),GPX4活性顯著降低(P<0.01),然而,烏司他丁治療逆轉了這種效果。鐵穩態受到鐵代謝相關蛋白質的嚴格調節,ACSL4、GPX4和FTH1被認為是關鍵的鐵死亡調節蛋白,圖4B為使用Western blot檢測ACSL4、GPX4和FTH1蛋白的表達水平,結果表明,與Control相比,SAP組中GPX4和FTH1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01),ACSL4的蛋白表達水平明顯升高(P<0.01),差異具有統計學意義,與SPA相比,SAP+UTI-L和SAP+UTI-L組中GPX4和FTH1蛋白表達水平明顯升高,ACSL4的蛋白表達水平顯著降低,且與烏司他丁的劑量濃度相關。ACSL4、GPX4和FTH1的mRNA水平變化與蛋白水平變化保持一致,如圖4C-I所示。

圖4 烏司他丁抑制SAP誘導的AKI大鼠鐵死亡

3 討 論

SAP是一種特殊類型的胰腺炎,發病機制復雜,可導致胰腺腫脹、出血和壞死,促進大量炎性細胞因子的釋放,引發免疫紊亂并誘發多種并發癥,如不及時有效治療,最終可導致多器官衰竭甚至死亡,因此,對于SAP的治療,減少炎癥,改善免疫系統和降低器官衰竭的發生率至關重要[8]。AKI是急性胰腺炎的常見并發癥,通常在其他器官衰竭后發生,烏利那他汀是治療急性胰腺炎的常用藥物[9],因此,我們開展本研究,旨在探討烏利那他汀治療SAP誘導急性腎損傷的臨床療效,為今后的臨床治療提供可靠的理論依據。

除腎小管細胞死亡外,炎癥也是AKI的重要特征,與腎功能不全的組織病理學相關。眾所周知,垂死的細胞會釋放炎癥因子,從而放大組織損傷,細胞因子可能有助于AKI的發病機制。TNF-α直接作用于腎小球和腎小管毛細血管,導致缺血和腎小管壞死。它還刺激其他細胞因子的釋放,例如IL-1β,IL-8和IL-6,它們作用于內皮細胞,導致腎缺血,血栓形成和氧自由基的釋放,氧自由基可能與蛋白質和酶反應,導致細胞和細胞膜脂質過氧化,蛋白質變性和毛細血管通透性增加,缺血和直接腎細胞膜損傷[10]。鐵死亡的跡象之一是膜氧化損傷,鐵死亡與其他類型的調節性壞死一起被認為是免疫原性的,并且極易促炎,鐵是不可或缺的成分,被腎小球過濾并在腎小管中重新吸收。全身和細胞鐵代謝由鐵的攝入、儲存、利用和外排介導,并由多種蛋白質調節。鐵穩態的畸變與腎臟疾病有關,在急性腎損傷的動物模型中,腎臟中催化鐵的濃度顯著增加,并與順鉑、缺血再灌注、氨基糖苷類、橫紋肌溶解和血紅蛋白尿等因素引起的廣泛損傷相關[11]。在人類中,已經發現催化鐵水平升高與急性腎損傷進展之間存在很強的關聯。較高的催化鐵血漿水平和較低濃度的鐵調素都與急性腎損傷患者的死亡率增加有關,更重要的是,鐵對于鐵死亡的發生至關重要。本文研究表明,烏司他丁減少了通過SAP誘導的AKI大鼠鐵積累。但是烏司他丁不能直接結合鐵,因此它通過調節關鍵的鐵代謝相關蛋白的表達來恢復腎鐵穩態,如ACSL4、GPX4和FTH1。GPX4是一種抗氧化劑防御酶,可修復脂質的氧化損傷,作為鐵死亡的中樞調節因子。根據我們的結果,烏司他丁減輕了鐵死亡相關蛋白水平的下降,包括GPX4和SLC7A11。ACSL4和GPX4主要在腎小管中表達上皮細胞,我們推測鐵死亡主要發生在腎小管上皮。這些發現表明鐵死亡發生在大鼠腎損傷模型的研究是SAP誘導AKI的治療靶點。

烏利那他汀是一種從新鮮尿液中提取的廣譜蛋白酶抑制劑,在既往研究中已被證明可阻斷炎性細胞因子與白細胞之間的相互作用,并能顯著改善炎癥反應[12]。在本研究中,發現TNF-α和IL-6的水平在大鼠SAP模型中明顯增加,反映了炎癥反應的程度。此外,ROS和H2O2的水平增加,表示氧化損傷的激活,而MDA水平的增加表明脂質過氧化的程度。這些氧化和炎癥介質已被證明參與由各種致病引起的腎臟損傷,烏司他丁的應用有利于預防AKI。為了研究烏司他丁保護作用的可能機制,建立了大鼠SAP模型,發現烏司他丁通過抑制氧化應激和炎癥反應來減少腎臟病理損傷。

總之,本研究發現烏司他丁通過抑制炎癥過程和氧化應激,抑制鐵死亡保護重癥急性胰腺炎誘導的急性腎損傷。因此,烏利司他汀可能是重癥急性胰腺炎誘導的急性腎損傷的有價值的臨床候選藥物。因此,在未來的研究中,應使用增加的樣本量,以進一步了解烏司他丁的保護機制。