瑞馬唑侖對顱腦損傷大鼠腦組織損傷及TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

王東亞, 喬 丹, 陳煒佳, 張懿蘭, 范艷霞, 劉博峰

(河北省保定市第二醫院, 河北 保定 071000)

顱腦損傷是神經外科常見的一種神經系統損傷性疾病,主要是由于鈍性創傷或機械力創傷導致腦功能、神經功能暫時或永久性損害,其主要病理特征為神經炎癥、氧化應激、細胞凋亡、線粒體障礙等[1]。隨著經濟發展,其發病率逐年上升,由于顱腦損傷具有高致殘率和高病死率,嚴重影響患者生存健康,給患者家庭及社會帶來沉重的經濟負擔。目前主要通過手術顱內血腫清除術+去骨瓣減壓術,擴大顱內空間,降低顱內壓以控制病情發展,但術后易出現腦積水、硬膜下積液、骨窗腦組織疝等并發癥,甚至導致病情惡化[2]。尋求新的治療方法減輕顱腦損傷迫在眉睫。TLR4/MyD88/NF-κB通路參與顱腦損傷引起的神經炎癥、細胞凋亡等過程并發揮重要調控作用,研究顯示,抑制TLR4/MyD88/NF-KB通路,可以減少下游炎癥因子的釋放,減輕神經炎癥反應,保護腦組織損傷[3]。瑞馬唑侖是重癥患者常用的一種可誘導和維持全身麻醉的新型苯二氮卓類鎮靜藥物,瑞馬唑侖聯合右美托咪定能夠改善患者的血流動力學,降低炎癥因子水平,保護創傷性顱腦損傷[4]。但是關于瑞馬唑侖是否可以通過調控TLR4/MyD88/NF-KB通路減輕顱腦損傷大鼠腦組織損傷尚不清楚,本文主要探索瑞馬唑侖對顱腦損傷大鼠腦組織損傷及LR4/MyD88/NF-KB通路的影響,以期為顱腦損傷治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1主要材料:質量200±20g SPF級SD大鼠購于濱州醫學院(生產許可SCXK:(魯)2021-0005);瑞馬唑侖(200814AK)購于江蘇恒瑞醫藥公司;LPS(511219ps)購于美國Invivogen公司;TUNEL染色試劑盒(C1091)及TNF-α(PT516)、IL-1β(PI303)、IL-6(PI328)ELISA試劑盒購自上海碧云天生物公司;Bax(5023)購于CST公司;TLR4(ab22048)、MyD88(ab219413)、NF-κB(ab32360)、p-NF-κB p65(ab239882)、Bcl-2(ab185002)購于英國abcam公司。

1.2方 法

1.2.1造模與分組處理:將大鼠分為Control組、BI組、Rem-L、Rem-M、Rem-H組、Rem-H+LPS組;Control組:僅暴露腦硬膜,不進行顱腦打擊;BI組:麻醉大鼠后將其大腦固定,剃毛備皮、消毒,無菌環境下打開頭部,剝離骨膜,中線顱頂骨暴露出來,然后在冠狀縫后、中線旁區域用牙科鉆鉆打骨窗,并用40g的圓柱形擊錘在20cm高度自由落體擊打骨窗,最終導致大鼠顱腦損傷,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮,飼養籠正常飼養[5];造模成功后,Rem-L、Rem-M、Rem-H組分別腹腔注射5、10、20mg·kg-1·d-1瑞馬唑侖(注射劑量由大小鼠之間劑量換算而得)[6];Rem-H+LPS組腹腔注射20mg·kg-1·d-1瑞馬唑侖及腹腔注射0.4mg·kg-1·d-1LPS[7]。對照組和模型組腹腔注射與Rem-L、Rem-M、Rem-H組等量的生理鹽水;連續14d。

1.2.2神經功能評分:給藥結束后,通過對各組大鼠進行運動、感覺和平衡訓練,從運動、感覺、平衡、反射4個方面進行神經功能綜合評估,記錄其mNSS評分[8]。評分與神經功能損傷呈正比,0分代表完全正常,總分18分。

1.2.3腦組織含水量檢測:完成神經功能評分后,各組隨機選擇6只麻醉處死,取出腦組織稱量濕重,隨后將其放入60℃烤箱烘干48h,稱其干重,腦組織含水量%=(腦組織濕重-干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.4炎癥因子水平檢測:各組隨機選擇6只大鼠斷頭處死并于冰上分離出大腦組織,加入PBS,冰上研磨,3000r/min離心15min,取上清,ELISA試劑盒檢測腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.5腦組織形態學觀察:從各組剩余大鼠中隨機選擇6只處死,取腦組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,脫蠟、蘇木精染色,水洗后伊紅染色,水洗、脫水、二甲苯透明,中性樹脂密封,光學顯微鏡下觀察腦組織形態學變化。

1.2.6細胞凋亡檢測:取1.2.5制作的石蠟切片,脫蠟后加入不含DNase的蛋白酶K,37℃反應30min,洗滌3次,3%過氧化氫溶液室溫孵育20min,加入生物素標記液,37℃避光孵育60min,洗滌后滴加標記反應終止液,室溫孵育10min,加Streptavidin-HRP工作液,室溫孵育30min,滴加DAB顯色液,室溫孵育5～30min,蘇木素染色液進行細胞核染色,再次洗滌3次,脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.7蛋白免疫印跡檢測TLR4、MyD88、NF-κB、P-NF-κB p65、Bax、Bcl-2蛋白:取各組剩余6只大鼠腦組織,提取其總蛋白測定蛋白濃度,隨后進行電泳分離、轉PVDF膜,封閉液室溫封閉,加入TLR4、MyD88、NF-κB、P-NF-κB p65、Bax、Bcl-2一抗過夜孵育,洗膜后加入二抗室溫孵育,清洗后加入ECL顯色液顯色并照相,Image J軟件分析各蛋白表達水平。

2 結 果

2.1瑞馬唑侖對BI大鼠神經功能評分的影響:與Control組相比,BI組大鼠神經功能評分上升(P<0.05);與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠神經功能評分依次下降(P<0.05);與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠神經功能評分上升(P<0.05);見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分

2.2瑞馬唑侖對BI大鼠腦組織含水量的影響:與Control組相比,BI組大鼠腦組織含水量上升(P<0.05);與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠腦組織含水量依次下降(P<0.05);與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠腦組織含水量上升(P<0.05);見表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量

2.3瑞馬唑侖對BI大鼠炎癥因子水平的影響:與Control組相比,BI組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05);與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次下降(P<0.05);與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05);見表3。

表3 各組大鼠炎癥因子TNF-α IL-1β IL-6水平

2.4瑞馬唑侖對BI大鼠腦組織形態學變化的影響:Control組大鼠腦組織神經元細胞分布均勻、結構清晰,核仁大且圓;與Control組相比,BI組大鼠腦組織神經元變性壞死,數量減少,體積縮小,腦皮質厚度變薄,細胞核結構模糊,核仁消失;與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠腦組織神經元細胞損傷逐漸減少,細胞結構相對較清晰;與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠腦組織神經元細胞數量減少、體積縮小,腦皮質厚度變薄,核結構模糊;見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織形態學變化(HE,×200)

2.5瑞馬唑侖對BI大鼠腦組織神經凋亡的影響:與Control組相比,BI組大鼠腦組織神經元凋亡率、Bax表達上升,Bcl-2表達下降(P<0.05);與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠腦組織神經元凋亡率、Bax表達依次下降,Bcl-2表達依次上升(P<0.05);與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠腦組織神經元凋亡率、Bax表達上升,Bcl-2表達下降(P<0.05);見圖2、圖3、表4。

圖2 各組大鼠腦組織神經元凋亡情況(TUNEL染色,顯色法)(×100)

圖3 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

表4 各組大鼠腦組織神經元凋亡情況

2.6瑞馬唑侖對BI大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響:與Control組相比,BI組大鼠腦組織TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65表達上升(P<0.05);與BI組相比,Rem-L、Rem-M、Rem-H組大鼠腦組織TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65表達依次下降(P<0.05);與Rem-H組相比,Rem-H+LPS組大鼠腦組織TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65表達上升(P<0.05);見圖4、表5。

圖4 Western blot檢測TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表達

表5 各組大鼠TLR4 MyD88 NF-κB p-NF-κB p65表達水平比較

3 討 論

顱腦損傷根據時間發展又分為原發性和繼發性顱腦損傷,其中原發性顱腦損傷指當下外力直接作用于頭部引發的腦組織損傷,繼發性顱腦損傷是在原發性顱腦損傷基礎上,引起腦組織缺氧缺血、腦水腫、炎癥反應、氧化應激損傷、細胞凋亡、線粒體功能障礙等,導致顱腦損傷加重。瑞馬唑侖作為一種鎮靜藥物可以抑制神經炎癥、減少神經元凋亡,發揮神經保護作用[9]。

在顱腦損傷時,各種刺激信號可以促進炎癥介質的表達,從而促進下游炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的大量釋放及聚集,細胞凋亡關鍵基因Bax、Bcl-2被激發,誘導細胞凋亡,加重顱腦損傷。其中,TNF-α是中樞神經系統細胞分泌的炎性因子,可以促進自由基生成和腦水腫發生,導致腦神經元壞死,顱腦損傷加重。IL-1β在引發局部炎癥反應的同時可誘導凋亡基因Bcl-2/bax的表達,促進神經元細胞的凋亡。IL-6是由IL-1β活化后誘導產生和釋放,主要通過誘導單核巨噬細胞產生和釋放更多的免疫炎癥介質,擴大炎癥的級聯反應,誘發繼發性腦損傷[10]。研究顯示,下調損傷大腦組織及血清TNF-α、IL-1β和IL-6的表達,可以減輕損傷大腦組織的炎癥反應,改善腦水腫,進而改善創傷型顱腦損傷大鼠的神經功能[11]。抑制Bax蛋白表達,可以減少神經元細胞凋亡,減輕神經功能缺損,保護顱腦損傷大鼠的損傷神經元[12]。另外瑞馬唑侖預先給藥可以下調Bax表達,上調Bcl-2表達,抑制神經元凋亡,減輕小鼠丘腦出血性腦損傷[13]。本文研究顯示,瑞馬唑侖可以降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平,下調Bax表達,上調Bcl-2表達,減輕神經炎癥反應,抑制神經元凋亡,說明瑞馬唑侖可以改善顱腦損傷大鼠的腦組織損傷。

TLR4/MyD88/NF-κB通路在顱腦損傷的發病過程中發揮重要作用,當模式識別受體TLR4被激活后可以通過其關鍵銜接蛋白MyD88依賴性途徑傳遞信號,激活不同的轉錄因子如NF-κB,使其磷酸化促進炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產生,調控Bcl-2、Bax蛋白表達促進細胞凋亡,加重顱腦損傷[14]。研究顯示,抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,可以減輕炎癥反應,減輕顱腦損傷大鼠的神經炎性損傷,發揮神經元保護作用[15]。本文研究顯示,瑞馬唑侖可以降低TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65表達水平,而TLR4激活劑可以部分逆轉瑞馬唑侖對TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用,說明瑞馬唑侖可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,改善顱腦損傷大鼠的腦組織損傷。

綜上所述,瑞馬唑侖可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路改善顱腦損傷大鼠的腦組織損傷。本研究仍存在局限性,瑞馬唑侖對于TLR4/MyD88/NF-κB通路的作用機制尚不清楚,需要進一步實驗驗證。