短鏈脂肪酸鹽對小鼠腹腔巨噬細胞的抗炎功能研究

劉鵬,姚夢,李志恒,潘萬龍

(1.川北醫學院基礎醫學與法醫學院;2.南充市中心醫院檢驗科,四川 南充 637000)

短鏈脂肪酸鹽(short-chain fatty acid salt,SCFAs)為主要由結腸內有益菌群酵解糖類形成揮發性酸的鹽形態,包括乙酸鈉、丙酸鈉(natrium propionicum,NaP)和丁酸鈉(natrium butyrate,NaB)等。短鏈脂肪酸鹽具有維持腸道營養與穩態、調節糖脂代謝與宿主免疫反應等多重生理功能[1]。SCFAs通過激活G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor,GPR)和抑制組蛋白脫乙?；?histone deacetylase,HDAC),保護腸道免受致病菌的感染和炎癥的侵襲[2]。丁酸鹽可通過降低NADPH氧化酶相關的氧化應激而減輕動脈粥樣硬化的發展[3]。此外,SCFAs在膿毒血癥、潰瘍性結腸炎與纖維肌痛等疾病中通過抑制NF-κB的活化,減少炎癥介質的釋放而減輕炎癥反應[4-6]。因此,SCFAs可作為一種抗炎劑在多種炎癥性疾病中發揮抗炎作用。

在沙門菌的感染免疫中,巨噬細胞(macrophage,MΦ)是發揮抗沙門菌感染的主要因素。鼠傷寒沙門菌(salmonellatyphimurium,STM)作為胞內寄生菌被MΦ吞噬后可分泌多種分子抵抗MΦ的殺傷作用,而MΦ作為STM的主要宿主細胞,活化后產生的炎性細胞因子(IL-6、TNF-α)在清除細菌方面發揮重要作用,MΦ活性降低也可能使STM殺滅不徹底而造成慢性菌血癥或腸熱癥復發。因此其活化與吞噬殺菌功能的強弱將直接影響到疾病的發生與發展。目前已有研究[7]表明,SCFAs可在一定程度上誘導MΦ凋亡,減輕來源于肺泡巨噬細胞系NR8383的炎癥反應。但關于SCFAs能否通過降低MΦ的活性,減輕炎癥介質釋放,從而影響其吞噬與殺菌功能的研究較少。本研究擬用NaP與NaB干預經LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞,通過Griess法與熒光探針檢測細胞內外NO的含量,ELISA法檢測炎性細胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α,評價NaP與NaB對MΦ的抗炎作用;使用NaP與NaB干預巨噬細胞殺滅STM的過程,分別在不同時間點檢測細菌存活數,評價SCFAs對殺菌功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級昆明小鼠(6～8周齡,體重20～22 g)由川北醫學動物中心培育。NaP、NaB與細胞因子檢測試劑盒購至上海生工生物,CCK-8、LPS、NO熒光探針購至碧云天公司,Griess試劑購至上海酶聯生物,STM購至北京萬佳首化,RPMI 1640、胎牛血清與雙抗購至美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的制備 使用含10%牛肉浸膏的肉湯1.5 mL腹腔注射昆明小鼠,3～4 d后脫頸處死小鼠,腹腔注射4 mL PBS。輕柔腹部后,用滅菌的吸管吸取腹腔液體,2 000 r/min離心10 min。PBS洗滌后用含10% FBS與雙抗的PRMI1640培養基重懸細胞,計數并調整細胞濃度為1×107/L,以0.5 mL量接種于24孔板。37 ℃、5% CO2培養1 h后用預溫的培養液輕柔洗滌兩次,繼續培養6 h后,200×鏡下觀察細胞形態。計數100個細胞,計算巨噬細胞所占百分比。

1.2.2 SCFAs對巨噬細胞代謝活性的影響 設置空白組、NaB組(0.02%、0.04%)、NaP組(0.04%、0.08%)、LPS組(50 μg/mL)、NaB+LPS組與NaP+LPS組(濃度同上)。按照分組,制備含上述試劑的PRMI1640培養液并重懸MΦ。每組100μL量接種3復孔(細胞約104個/孔),培養12 h后加入10 μL CCK-8繼續培養1 h。酶標儀檢測OD 462 nm值,減去空白孔的吸光度值后,計算實驗組細胞的相對代謝活性。

1.2.3 SCFAs對LPS刺激的巨噬細胞產NO的影響 設置對照組(LPS 50 μg/mL)、NaB組(0.02%NaB+LPS、0.04%NaB+LPS)、NaP組(0.04%NaP+LPS、0.08%NaP+LPS)。使用含上述濃度SCFAs與LPS的PRMI1640重懸MΦ,每孔0.5mL量加入24孔板中,每組各3個復孔。37 ℃、5%CO2培養12 h后分離上清備用。向每孔加入1∶1 000稀釋后的NO熒光探針100 μL,37 ℃、5%CO2處理20 min后,熒光顯微鏡下參照FITC的參數設置進行觀察。取保存的各組上清液100 μL,分別加入50 μL Griess試劑A與試劑B,靜止15 min后檢測OD 550 nm值。按照試劑盒提供的公式計算各組的NO量。

1.2.4 SCFAs對LPS刺激巨噬細胞產細胞因子的影響 將1.2.3收集的上清液分別進行4倍、20倍稀釋后,分別經加樣或標準品孵育90 min,生物素標記TNF-α、IL-1β與IL-6抗體孵育60 min,HRP-鏈霉素孵育30 min,顯色劑15 min后終止反應,酶標儀測定450 nm吸光度值并通過標準曲線計算每孔細胞因子濃度。

1.2.5 SCFAs對巨噬細胞殺傷STM的影響 設置對照、0.02%NaB、0.04%NaB、0.04%NaP與0.08%NaP共5個組。將MΦ按照1∶10吞噬比加入到用PRMI1640制備的STM菌液中?；靹蚝笠?00 μL量接種96孔板,培養40 min后,用預熱的PBS洗滌3次。加入含相應濃度NaP與NaB的PRMI1640后繼續培養,并分別在0、5、10 h棄上清,每孔加入200 μL滅菌水,37 ℃處理30 min后吹打混勻,經10倍稀釋后平板接種計數。另重復上述操作,收集培養10 h后的細胞與上清。細胞經瑞士染色后觀察胞漿內是否有完整結構的細菌,上清液使用Griess試劑檢測各組NO量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離

經1.5 mL肉湯誘導小鼠腹腔無菌性炎癥后,每只分離獲得腹腔細胞約3～7×106個。經培養后MΦ呈現典型形態：長梭形,有明顯偽足,部分MΦ為大圓細胞形態;計數100個細胞后計算巨噬細胞百分比>80%,所得巨噬細胞純度較高。見圖1。

2.2 SCFAs對巨噬細胞形態與代謝活性的影響

光鏡下觀察空白組典型的巨噬細胞形態較收攏,偽足長度較實驗組短,NaB、NaP干預后的MΦ有較長的偽足,經Image J圖像分析空白組典型細胞長度約為NaB與NaP組的3/4。見圖1。CCK-8法檢測細胞相對活性,與空白組相比,不同濃度的SCFAs干預巨噬細胞后,其相對代謝活性均降低(P<0.05)。經LPS刺激后各組細胞代謝活性均增高。(P<0.05)。

表1 SCFAs干預經LPS刺激與未受LPS刺激的MΦ12 h后細胞相對活性

2.3 SCFAs對LPS刺激巨噬細胞產NO的影響

NaB/NaP與LPS共刺激12 h后的MΦ經DAF-FM DA熒光探針染色后,可見各處理組細胞內的熒光信號較LPS對照組有一定程度的降低;經Griess試劑檢測發現LPS對照組、0.02%NaB組、0.04%NaB組、0.04%NaP組與0.08%NaP組上清液中NO量分別為：39.33±0.93 μmol/L、36.17±0.18 μmol/L、28.28±0.14 μmol/L、31.85±0.15 μmol/L、17.59±0.19 μmol/L。各組與LPS組比較NO均降低(P<0.05)。見圖2。

2.4 SCFAs對LPS刺激巨噬細胞產炎性細胞因子TNF-α、IL-6與IL-1β的影響

采用ELISA法檢測不同濃度NaB、NaP與LPS共處理的MΦ上清中的TNF-α、IL-6與IL-1β,結果發現,LPS對照組的MΦ產TNF-α、IL-6明顯增高,不同濃度NaP、NaB組的TNF-α、IL-6水平較LPS對照組均降低(P<0.05)。各實驗組IL-1β的水平與LPS對照組無統計學差異(P>0.05)。見圖3。

2.5 SCFAs對巨噬細胞殺傷STM的影響

MΦ吞噬STM后加入相應濃度SCFAs干預0、5與10 h,經瑞士染色觀察MΦ吞噬STM 10 h后的胞漿內仍有完整結構的細菌。平板計數法檢測各組MΦ內細菌存活數,發現0 h各組細菌數無統計學差異,(P>0.05)5 h與10 h后各組細菌數量均較0 h降低。與LPS對照組相比,5 h時不同濃度SCFAs處理后的MΦ內活菌數均增高(P<0.01)。10 h時0.04%NaB與0.08%NaP組MΦ內活菌數均增高(P<0.05)。各干預組MΦ吞噬STM 10 h上清液中NO量較LPS對照組均降低(P<0.05)。且SCFAs濃度越高,NO量減少的越明顯。見圖4。

3 討論

絕大多數短鏈脂肪酸被吸收后是以離子形式存在[8]。SCFAs被腸道吸收后除可直接做為能量物質給腸道上皮細胞提供能量外,還可經門靜脈系統被轉移至肝臟參與機體的能量代謝[9-10],如乙酸可做為膽固醇、脂肪酸的合成底物,丙酸鹽參與糖異生。進入血液循環系統的SCFAs還能發揮更廣泛的作用,例如可通過促進免疫細胞的分化與成熟而增強機體免疫能力;通過腸-腦軸進入中樞神經系統的SCFAs可影響神經心理性疾病的發生與發展[11]。因此,SCFAs對宿主代謝和免疫系統等有多種有益作用[12]。

最近研究[13-15]發現,NaP與NaB可通過與細胞膜上GPR結合后,負向調節HDAC的水平,從而對炎癥信號通路如NF-κB、MAPK等信號通路產生負向調節,其表現出的抗炎作用預示其在臨床治療與疾病預防方面的潛力。STM做為一種人畜共患病的病原體,經腸道M細胞提呈給MΦ后可分泌多種分子抵抗MΦ的殺傷作用,本研究中,在巨噬細胞吞噬STM 10h后仍有一定數量的細菌存活。MΦ作為STM的主要宿主細胞,其活化與吞噬殺菌功能的強弱將直接影響到疾病的發生與發展[16]。研究[17]發現,短鏈脂肪酸可促進CD4+T細胞和ILCs產生IL-22,從而使腸道抗感染與炎癥的能力增強。STM既可產生腸毒素引起食物中毒,也可因內毒素入血引起免疫低下者嚴重的敗血癥。內毒素又稱LPS,是G-細菌細胞壁外膜的特殊結構。大量內毒素入血可引起包括MΦ在內的大量炎癥細胞活化與炎性細胞因子的產生,因此減少由內毒素引起的MΦ等炎性細胞的活化、調節促炎性細胞因子的分泌是對抗G-細菌感染的措施之一[18]。

本研究采用傳統的小鼠腹腔巨噬細胞分離方法,所獲得的原代巨噬細胞經培養后可見形態多樣,具有明顯偽足的典型細胞形態,且純度較高。相較于常用的炎癥模型RAM264.7腫瘤細胞[19],生物學形狀與原體內細胞相似,可保證實驗體內外的一致性。分別使用NaP與NaB單獨干預巨噬細胞12 h后,細胞相對代謝活性降低,且NaB表現出更明顯的抑制細胞代謝活性的能力。這與劉婷婷等[20]研究一致。但在LPS刺激下,NaB與NaP未表現出明顯地抑制巨噬細胞代謝活性的能力,表明兩者減輕由LPS誘導巨噬細胞的炎癥反應并非是由其抑制巨噬細胞代謝活性而引起。LPS作為強有力的免疫刺激物,能誘導巨噬細胞向M1型極化,促進細胞表面特征性分子、NO與炎性細胞因子的表達[21]。M1型巨噬細胞在感染性疾病的早期發揮重要作用,在早期炎癥部位富集,并被LPS,TNF-ɑ與IFN-γ等促炎因子激活,隨后通過分泌多種炎癥因子的方式促進炎癥的發生發展[22]。在本實驗中將NaP、NaB與LPS共同處理巨噬細胞后,上清液的NO、IL-6與TNF-ɑ的表達量均較LPS組降低(P<0.05),表明SCFAs可在一定程度上減少炎癥介質的釋放,減弱巨噬細胞向M1型極化而起到抗炎作用。

Kurtz等[23]報道,巨噬細胞分泌炎性因子如TNF-α、IL-6的能力減弱,導致體內小鼠攻毒STM后,其肝、脾和腸系膜淋巴結等免疫組織中的細菌載量有明顯的增加,與本研究中的體外實驗結果一致。SCFA對免疫系統可通過促進B細胞發育、Treg的分化與擴增、促進IL-22的產生等方式調節粘膜免疫,從而提高腸道的免疫屏障功能的作用[2],說明在體內感染STM后,短鏈脂肪酸鹽調節免疫功能的機制更加復雜。

綜上,丙酸鈉與丁酸鈉能降低由LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應,增加鼠傷寒沙門菌在巨噬細胞內的存活機率,機制有待進一步探討。