頭孢克肟膠囊溶出曲線一致性評價研究*

葉偉文,高琳,蔡國偉,賴燁才,秦飛

(廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠/廣東省化學藥原料與制劑關鍵技術研究重點實驗室,廣州 510515)

頭孢克肟是首個第3代口服頭孢菌素[1],為低溶解、低滲透藥物[2],由藤澤制藥株式會社研發,于1987年在日本上市,白云山制藥總廠最早于1993年獲得頭孢克肟膠囊的全國首仿藥品注冊證書。溶出曲線研究可預測藥物在體內的溶解情況,提高生物等效性(bioequivalence,BE)實驗的成功率,已成為評價藥品質量差異的重要手段[3-5]。

2020年版《中華人民共和國藥典》[6]收載的頭孢克肟膠囊溶出度測定方法為紫外-可見分光光度法,溶出液需要稀釋后才能測定,而《醫療用醫藥品品質情報集》[7]推薦方法為高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,但后者檢測時間長,效率低,不利于高通量樣品檢測。核殼型色譜填料由實心硅膠核和外層多孔硅膠殼組成,該類型填料的色譜柱具有快速、高分辨率和低背壓的特點,在藥品領域的快速分析中已被廣泛應用[8-10]。筆者在本實驗優選核殼型色譜柱建立快速測定頭孢克肟膠囊溶出度的HPLC法,考察頭孢克肟膠囊在多種介質的溶出行為,并結合BE實驗結果,以期為其一致性評價提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo公司,DAD檢測器);FADT-1202RC型自動溶出度儀(上海富科思分析儀器有限公司);CPA225D電子天平(德國Sartorius公司,感量:0.01 mg);TDL-50B離心機(上海安亭科學儀器廠);E300H超聲波清洗器(德國Elmassonic)。

1.2試藥 頭孢克肟膠囊仿制制劑(白云山制藥總廠,規格:0.1 g,批號:02180401、02180501、02180502);頭孢克肟膠囊參比制劑(長生堂制藥株式會社,規格:0.1 g,批號:CB011);頭孢克肟對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:130503-201706,含量:89.2%);甲醇(德國默克公司,批號:11736420346)、乙腈(德國默克公司,批號:10955330820)、三氟乙酸(美國天地有限公司,批號:I6110077)為色譜純,水為純化水,氯化鈉(批號:20171105)、氫氧化鈉(批號:20171002)、磷酸二氫鉀(批號:20180102)、無水磷酸氫二鈉(批號:20180104)、一水合檸檬酸(批號:20171205)、鹽酸(批號:20180104)均為分析純(廣州化學試劑廠)。

2 方法與結果

2.1溶出方法與溶出介質的選擇

2.1.1溶出方法 2020年版《中華人民共和國藥典》[6]采用籃法,轉速100 r·min-1,而《醫療用醫藥品品質情報集》[7]采用槳法,轉速50 r·min-1,溶出介質均為900 mL。頭孢克肟主要在腸道吸收[2],前期研究選擇區分力較好的pH值6.8磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)介質和溶出速度較快的pH值7.5 PBS介質進行對比,取頭孢克肟膠囊分別采用籃法(100 r·min-1)和槳法(50 r·min-1)進行溶出實驗,結果見圖1。相比之下槳法(50 r·min-1)區分力更好,最終選擇的溶出條件為:槳法,50 r·min-1,溶出介質900 mL。

A.pH值6.8 PBS;B.pH值7.5 PBS。

2.1.2溶出介質 參考《醫療用醫藥品品質情報集》[7],選擇pH值1.2鹽酸、pH值6.8 PBS、pH值7.5PBS和水為溶出介質。

2.1.3取樣時間 結合本品在各介質的溶出速度,pH值1.2鹽酸、pH值6.8 PBS和水介質的取樣時間點分別為5、15、30、60、90,120和180 min,pH值7.5 PBS介質的取樣時間點為5、10、15、30、45、60和90 min。

2.2溶液的制備 ①空白輔料溶液:取空白輔料適量及一粒明膠空心膠囊,置100 mL量瓶中,分別加入相應溶出介質超聲溶解并稀釋定容,濾過,取續濾液。②對照品貯備液:精密稱取頭孢克肟對照品適量,置250 mL量瓶,加適量甲醇溶解,加水稀釋至刻度,搖勻,制成1.115 8 mg·mL-1頭孢克肟(以C16H15N5O7S2計)對照品貯備液。③對照品溶液:精密量取上述貯備液2 mL,置20 mL量瓶,分別加入相應溶出介質稀釋定容,作為對照品溶液。④供試品溶液:取本品1粒,按“2.1.1節”溶出方法進行實驗,于設定的時間點取溶出液適量,濾過,取續濾液。⑤系統適用性溶液:取頭孢克肟對照品約23 mg,置20 mL量瓶,加水稀釋定容,于95 ℃水浴45 min,冷卻至室溫后濾過,取續濾液[6]。

2.3分析方法的建立和驗證

2.3.1HPLC色譜條件 以Thermo Accucore C18(50 mm×4.6 mm,2.6 μm)為色譜柱;以乙腈-0.8%三氟乙酸溶液(20：80)為流動相;檢測波長254 nm;柱溫45 ℃;流速1.2 mL·min-1;等度洗脫;進樣量5 μL?！夺t療用醫藥品品質情報集》[7]采用四丁基氫氧化銨溶液和乙腈為流動相,在常規C18色譜柱中頭孢克肟出峰時間約為12 min,且該有機鹽試劑對色譜柱填料的損耗較大。本研究優選核殼型C18色譜柱,流動相換作乙腈-三氟乙酸溶液,使頭孢克肟出峰時間縮短至1 min內,極大地提升了檢測效率。2種方法的典型色譜圖見圖2。

A.《醫療用醫藥品品質情報集》檢測方法;B.本研究提出的檢測方法;1.頭孢克肟。

A.pH值1.2鹽酸;B.pH值6.8 PBS;C.pH值7.5 PBS;D.水;a.空白輔料;b.對照品;c.供試品;1.頭孢克肟。

2.3.2專屬性實驗 取空白輔料溶液、對照品溶液和供試品溶液,按“2.3.1節”色譜條件測定,色譜圖見圖

3,結果表明輔料均無干擾。

2.3.3系統適用性實驗 取系統適用性溶液,按“2.3.1節”色譜條件測定,色譜圖見圖4,結果表明頭孢克肟峰與雜質峰的分離度>1.5,本方法系統適用性良好。

1.頭孢克肟;2.頭孢克肟(E)異構體。

2.3.4線性關系考察 精密量取“2.2節”貯備液0.1、0.2、0.5、1、2、4、6 mL,分別置20 mL量瓶,用相應溶出介質稀釋配制成不同濃度對照品溶液。按“2.3.1節”色譜條件測定,以峰面積(Y)為縱坐標、濃度(X)為橫坐標進行線性回歸,結果表明頭孢克肟濃度在5.58～334.74 μg·mL-1范圍內線性關系良好,見表1。

表1 頭孢克肟的回歸方程

2.3.5精密度實驗 取對照品溶液(111.58 μg·mL-1)連續測定6次,記錄峰面積,見表2,結果表明本方法精密度良好。

表2 精密度實驗結果

2.3.6濾膜吸附實驗 取本品1粒,加入pH值1.2鹽酸900 mL,超聲處理30 min,作為供試品溶液,同法制備另外3種介質的供試品溶液。取供試品溶液適量離心處理,取上清液;另取供試品溶液1.5 mL過孔徑0.45 μm濾膜,棄去濾液一半后取續濾液。取上述2種溶液按“2.3.1節”色譜條件測定,記錄峰面積,計算濾膜對頭孢克肟的吸附率,公式如下:

結果顯示,4種供試品溶液的吸附率分別為0.67%、0.49%、0.56%和0.44%,表明濾膜對頭孢克肟無明顯吸附作用。

2.3.7溶液穩定性實驗 取“2.3.6節”4種供試品溶液,過濾后于室溫放置0、2、4、6和8 h后,按“2.3.1節”色譜條件測定,結果4種供試品溶液的峰面積RSD分別為0.48%、0.18%、0.10%和0.26%,表明供試品溶液在室溫8 h內穩定。

2.3.8重復性實驗 取本品,按“2.2節”制備各介質的供試品溶液,于溶出終點取樣,重復取樣6次,按“2.3.1節”色譜條件測定,記錄峰面積,見表3,結果表明本方法重復性良好。

表3 重復性實驗結果

2.3.9回收率實驗 分別精密量取“2.2節”貯備液0.5、1和2 mL,置20 mL量瓶,加入相當于1粒頭孢克肟膠囊的空白輔料和膠囊殼,并用相應介質稀釋配制成相當于標示量(111 μg·mL-1)25%、50%和100%的溶液,各介質每個濃度溶液平行制備3份,按“2.3.1節”色譜條件測定,見表4,結果表明本方法回收率良好。

表4 回收率實驗結果

2.3.10耐用性實驗 按“2.2節”方法制備pH值7.5 PBS介質的供試品溶液(90 min取樣)和對照品溶液,以“2.3.1節”色譜條件為基礎,按表5條件和參數進行調整,每個色譜條件進樣測定3次,按外標法計算供試品溶液藥物濃度的RSD,結果見表5,表明本方法耐用性良好。

表5 耐用性考察結果

2.4溶出曲線測定和相似性評價 取本品參比制劑(批號:CB011)和仿制制劑3批(批號:02180401、02180501和02180502),按“2.1節”進行溶出度實驗(n=12),于各時間點分別取溶出液1.5 mL,過濾后按“2.3.1節”色譜條件測定,以外標法計算各時間點的溶出度,結果見表6—9,溶出曲線見圖5。參考《普通口服固體制劑溶出度實驗技術指導原則》[11],采用相似因子(f2)法評價兩制劑溶出曲線的相似性,計算公式如下:

表6 pH值1.2鹽酸中的溶出實驗結果

表7 pH值6.8 PBS中的溶出實驗結果

表8 pH值7.5 PBS中的溶出實驗結果

表9 水中的溶出實驗結果

A.pH值1.2鹽酸;B.pH值6.8 PBS;C.pH值7.5 PBS;D.水。

式中Rt和Tt分別表示參比制劑與受試制劑在各取樣時間點的溶出度,n為取樣時間點個數,當f2≥50,可判斷兩制劑的溶出曲線相似。結果顯示,3批仿制制劑與參比制劑在4種介質中的f2因子均>50,見表10,表明仿制制劑和參比制劑的溶出行為一致。

表10 頭孢克肟膠囊在不同介質中的相似因子(f2)

2.5生物等效性實驗 取頭孢克肟膠囊仿制制劑(T,批號:02180401)和參比制劑(R,批號:CB011),采用單中心、隨機、開放、單劑量、兩制劑、兩序列、兩周期交叉給藥實驗設計方法(清洗期4 d)進行空腹和餐后人體生物等效性實驗(空腹和餐后實驗健康受試者各30例),受試者入選標準:年齡≥18歲的健康受試者;身體質量指數19.0～26.0 kg·m-2;男性體質量≥50.0 kg,女性體質量≥45.0 kg;無心血管、血液、肝、腎、內分泌、呼吸、消化、神經、精神、免疫、皮膚及代謝紊亂等疾病病史?？崭箤嶒炗诮o藥前0 h(30 min內)和給藥后1.0、2.0、3.0、3.33、3.67、4.0、4.33、4.67、5.0、5.5、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0 h時間點采集靜脈血,餐后實驗于給藥前0 h(30 min內)和給藥后1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.33、4.67、5.0、5.33、5.67、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0 h時間點采集靜脈血[12],檢測各血樣中頭孢克肟的血藥濃度[13],通過Phoenix WinNonlin 7.0版軟件計算頭孢克肟藥動學參數[藥-時曲線下面積(AUC0-t和AUC0-∞)],并用SAS9.4版統計軟件對關鍵藥動學參數達峰濃度(Cmax)、AUC0-t和AUC0-∞進行統計分析,評價兩制劑生物等效性,結果見表11[14]。結果顯示,仿制制劑和參比制劑空腹和餐后藥動學參數幾何均值比90%置信區間均在80%～125%,表明兩制劑生物等效[15]。

表11 兩種制劑的生物等效性評價結果

3 討論

3.1檢測方法的優化 2020年版《中華人民共和國藥典》[6]收載的溶出度測定法為紫外-可見分光光度法,溶出液需要稀釋后才能測定,且不同介質、不同時間的藥物濃度跨度較大,難以統一稀釋操作,不利于高通量樣品檢測?！夺t療用醫藥品品質情報集》[7]的HPLC法可直接進樣檢測,但單個樣品的檢測時間約為15 min,且流動相對色譜柱填料的損耗較大,需頻繁更換色譜柱。本研究優選核殼型C18色譜柱、以乙腈-三氟乙酸水溶液為流動相,建立了快速測定頭孢克肟膠囊溶出度的HPLC法,既省去了繁瑣操作,又減少了人為誤差,單個樣品的檢測時間約為1 min,極大地縮短了檢測時間、減少了有機溶劑和色譜柱的耗費,提高了檢測效率,達到降本增效的目的,適合研發和生產中高通量樣品的分析應用。

3.2溶出方法的選擇 本研究參考《醫療用醫藥品品質情報集》[7]采用槳法(50 r·min-1),與2020年版《中華人民共和國藥典》[6]的籃法(100 r·min-1)相比,更有區分力,能更好地反映制劑的內在質量差異。頭孢克肟主要在小腸吸收[2],結合本研究在4種介質中的溶出情況,pH值6.8 PBS介質可模擬小腸環境,且區分力較好,在處方工藝開發過程可作為重點考察的關鍵介質。

3.3體內外相關性 溶出曲線研究是評價口服固體制劑內在質量差異,保證臨床用藥有效的一種重要手段。本實驗3批仿制制劑在體外多種介質中與參比制劑的相似因子(f2)均>60,表明仿制制劑與參比制劑在各介質中的溶出行為一致,批間差異小,且仿制制劑和參比制劑在人體內空腹和餐后均為生物等效,表明本實驗的溶出方法在一定程度上能預測藥物在體內的溶解情況,可為頭孢克肟膠囊的一致性評價提供借鑒。