參麥顆粒中多效唑殘留轉移狀況分析及風險評估*

王曉蕾,孫慧珠,雷蓉,安琪,劉永利

(1.河北省藥品醫療器械檢驗研究院,石家莊 050227;2.國家藥品監督管理局中藥材質量監測評價重點實驗室,石家莊 050227)

參麥顆粒為養陰生津常用中成藥,由紅參、南沙參、麥冬、黃精、山藥、枸杞子組成,主要用于面黃肌瘦、津少口渴、腰膝酸軟、食欲不振、頭暈眼花、心悸氣短、神經衰弱等的治療[1]。多效唑是一種三唑類植物生長調節劑,通過改變植物內源激素水平,減弱植物頂端生長優勢,達到根系發達、提高產量等效果[2-4],這種增產方式存在影響中藥材質量的風險[5-6],也會擾亂市場經營秩序,引入安全風險[7]。近年來,麥冬種植中使用多效唑的報道較多[8-9],在日常檢測中也發現麥冬藥材及飲片普遍存在多效唑殘留情況,經查詢農業農村部作物種植登記用藥名錄及歐盟農藥數據庫,多效唑未在麥冬種植中進行使用登記,歐盟部分國家也將多效唑列為禁限用品種。

中藥中外源性有害殘留物的風險評估是對外源性有害殘留物產生不良效應可能性和嚴重性的科學評價[10-11]。研究表明,藥材加工炮制過程會使農藥殘留水平及攝入風險產生明顯變化[12-14],但考察中藥制劑過程農藥殘留轉移行為及評估農藥殘留水平的研究筆者較少見到[15]。參麥顆粒處方中麥冬采用水煮醇沉工藝,多效唑隨工藝轉移行為未知[16-18],有必要模擬參麥顆粒制備過程,考察多效唑從麥冬飲片到參麥顆粒的轉移行為。因此,對參麥顆粒中多效唑殘留限量研究需要建立在全面掌握市場參麥顆粒中多效唑殘留現狀、分布特點、安全性風險基礎上。筆者在本研究建立了氣相色譜-串聯質譜法(gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,GC-MS/MS)測定參麥顆粒中多效唑殘留量測定方法,分析不同樣品中多效唑分布規律,并模擬制劑工藝過程,考察多效唑從飲片到制劑的轉移規律,并對參麥顆粒多效唑殘留進行慢性暴露評估和風險描述,評價市場上參麥顆粒多效唑殘留風險,以期為參麥顆粒質量安全性評價提供數據支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(日本島津公司,型號:GCMS-TQ8040);電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司,感量:0.01 mg,型號:AE240);超純水儀(美國Millipore公司,型號:Milli-Q Integral 10);精密移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2試劑 乙腈、丙酮均為色譜純(默克股份兩合公司),乙酸為色譜純,水為蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3對照品 多效唑標準溶液(農業農村部環境保護科研檢測所,批號:202203,濃度:100 μg·mL-1),配制50 μg·mL-1(溶劑為乙腈)貯備溶液Ⅰ,置-20 ℃密封避光保存。

1.4空白基質樣品 取經篩查不含多效唑的麥冬飲片(購自河北安國藥材市場,批號:202203,經河北省藥品醫療器械檢驗研究院中藥室段吉平主任藥師鑒定為正品),按照參麥顆粒處方制法制備陰性樣品,作為空白基質樣品。

1.5樣品 參麥顆粒抽查自全國21個省(自治區、直轄市)藥品經營單位,共涉及3家企業85批次樣品。麥冬、紅參、南沙參、枸杞子、黃精、山藥均購自河北安國藥材市場,經鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1色譜、質譜條件與系統適用性實驗 50%苯基-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱(柱長30 m,柱內徑0.25 mm,膜厚度0.25 μm);進樣口溫度230 ℃,不分流進樣;載氣為高純氦氣(He);進樣口為恒壓模式,柱前壓力49.7 kPa;程序升溫(初始溫度40 ℃,保持1 min,以40 ℃·min-1速率升至120 ℃,再以5 ℃·min-1速率升至240 ℃,再以12 ℃·min-1速率升至300 ℃,保持8 min);采用質譜檢測器,電子轟擊源(electron ionization,EI),離子源溫度230 ℃,質譜傳輸接口溫度230 ℃,進行多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM),選擇m/z236.00→125.10、m/z236.00→167.10、m/z236.00→132.10作為檢測離子對。

2.1.2對照品溶液的制備 精密量取多效唑標準溶液適量,用乙腈制成100 ng·mL-1的多效唑溶液,作為對照品貯備液Ⅱ。再取空白基質樣品,同供試品溶液的制備方法制備空白基質溶液。精密量取空白基質溶液1 mL,置氮吹儀,40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL,加入對照品貯備液Ⅱ 50 μL,加乙腈稀釋至1 mL,渦旋混勻,即得。

2.1.3供試品溶液的制備 提取:取樣品10 g,精密稱定,加1%乙酸15 mL,使溶解,渦旋,加乙腈15 mL,渦旋使充分混勻,加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉混合粉末(4：1)7.5 g,渦旋使充分混勻,再置振蕩器上劇烈振搖(350次·min-1)3 min,冰浴中冷卻10 min,離心(2 627×g)5 min。

凈化:取上清液9 mL,置已預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無水硫酸鎂900 mg,N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)300 mg,C18300 mg,硅膠300 mg,石墨化炭黑90 mg]中,渦旋使充分混勻,再置振蕩器上劇烈振搖(350次·min-1)5 min,離心(2 627×g)5 min,精密吸取上清液5 mL,氮氣吹至0.4 mL,乙腈定容至1 mL,混勻,即得。

2.1.4方法學研究

(1)專屬性考察。分別取對照品溶液、按“2.1.1節”方法制備的空白基質溶液和供試品溶液,按“2.1.2節”方法測定,結果對照品色譜圖中多效唑峰形良好,空白基質溶液未呈現保留時間相同的色譜峰。對比樣品與對照品中多效唑峰一級質譜圖及二級質譜圖,圖譜見圖1—2,表明本方法專屬性良好。

A.空白基質;B.多效唑對照品;C.參麥顆粒。

A.對照品一級質譜圖;B.對照品二級質譜圖;C.供試品一級質譜圖;D.供試品二級質譜圖。

(2)線性關系考察。精密量取多效唑對照品貯備液Ⅰ、Ⅱ適量,分別配置成1、5、10、20、50、100 ng·mL-1系列基質混合對照品溶液,各取1 μL,分別注入氣相色譜-質譜聯用儀,按“2.1.1節”色譜條件測定,以多效唑進樣濃度為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,建立標準曲線。結果表明多效唑在1～100 ng·mL-1呈良好線性關系,線性方程為:Y=8 309.1X+871.4(r=0.999 5)。

(3)準確度、精密度、靈敏度實驗。采用空白基質加標方式,制備定量下限樣品進行回收率考察。取空白基質樣品10 g,共6份,精密稱定,分別加入用乙腈配制的多效唑對照品溶液適量,按“2.1.3節”方法制備供試品溶液,按“2.1.1節”條件測定,計算回收率。當多效唑進樣濃度為1 ng·mL-1時S/N>10,見圖3,結果見表1,回收率99.42%,表明本方法準確度良好;重復性以回收率數據的RSD值表示,表明本方法重復性良好;0.000 3 mg·kg-1(進樣濃度1 ng·mL-1)可作為參麥顆粒中多效唑的定量下限。

表1 多效唑定量下限回收率

圖3 多效唑定量下限提取離子流圖

(4)穩定性實驗。取同一份供試品溶液,室溫密封保存,于0 h開始測定,每間隔一段時間測定一次,記錄峰面積,RSD為2.6%,表明供試品溶液至少在24 h內穩定。

2.2測定結果與分析

2.2.1測定結果 全部85批參麥顆粒樣品中均檢出多效唑殘留,殘留量為0.001 3～0.015 8 mg·kg-1,參麥顆粒中多效唑殘留量分布散點圖見圖4,平均0.008 0 mg·kg-1。

圖4 參麥顆粒中多效唑殘留量分布圖

2.2.2分布規律分析 為分析參麥顆粒中多效唑殘留量在企業間及生產年份間的分布規律,將85批樣品分別按企業、生產年份分類,共涉及3家生產企業,生產日期覆蓋2019年9月至2022年6月,其中2019年2批,2020年14批,2021年62批,2022年7批。采用SPSS 25.0版統計軟件,將多效唑殘留量作為因變量,分別以年份、企業為因子做方差分析,結果表明多效唑殘留量在不同年份樣品間差異無統計學意義,而多效唑殘留量在不同企業樣品間差異有統計學意義(P<0.01)。

將多效唑殘留量按企業繪制箱式圖(圖5),企業C多效唑殘留量較集中,且大部分殘留量在均值以下,其他兩家企業數據分散,表明不同企業在樣品生產中由于原藥材自身質量及生產工藝的影響,多效唑殘留量存在差異,存在一定風險,提示生產企業應完善投料飲片必要的質量監測機制及對風險因素的工藝考察,完善對安全性風險的管控。

圖5 不同企業的樣品中多效唑殘留量分布圖

2.3轉移行為考察

2.3.1參麥顆粒多效唑陽性與陰性樣品的制備 分別以不含多效唑的麥冬飲片制備參麥顆粒陰性樣品,含多效唑的麥冬飲片制備參麥顆粒陽性樣品,各藥味均按處方量10%取樣,照制法制備。

2.3.2多效唑殘留量轉移率測定 將自制參麥顆粒陽性樣品及陰性樣品按照“2.1.3節”方法制備成供試品溶液,并按照“2.1.1節”方法測定,以實際制得樣品中含麥冬的量、麥冬及自制樣品中多效唑的殘留量計算轉移率,結果見表2。3份樣品平均轉移率29.8%。

表2 多效唑轉移率

3 風險評估

為進一步評估參麥顆粒中多效唑殘留的安全風險狀況,依據符合中藥使用特點的“中藥中外源性有害殘留物安全風險評估技術指導原則”[19],采用點評估模式,對參麥顆粒中的多效唑殘留量進行風險評估。

3.1危害識別與危害特征描述 多效唑在世界衛生組織農藥危害分級標準規定中屬中等毒性,在我國的農藥危害分級標準中則為低毒性[20]?！妒称钒踩珖覙藴适称分修r藥最大殘留限量》(GB 2763-2021)中多效唑項下每日允許攝入量(acceptable daily intake,ADI)為0.1 mg·kg-1。

3.2慢性暴露評估 暴露評估可分為急性暴露評估和慢性暴露評估,根據參麥顆粒使用特點及多效唑已知健康指導值,僅對參麥顆粒中多效唑殘留進行慢性暴露評估,即針對整個生命周期內平均每日暴露情況評估。慢性暴露量EXPc(mg·d-1·kg-1)計算公式[19]如下:

式中EF為服用頻率,Ed為一生暴露年限,根據國家食品安全風險評估中心有效消費調查問卷[9],EF的P95分位值為每年90 d,Ed為20年;IR 為中成藥日攝入量,根據參麥顆粒說明書服用量計算,每袋重25 g,每次1袋,每天服用3次,即0.075 kg;C為中成藥中農藥的測定值(mg·kg-1),長期暴露評估時C取中成藥中農藥殘留量的平均值,即0.008 0 mg·kg-1;AT為平均壽命天數,以365×70年計;bw為中國人平均體質量,按63 kg計。

3.3風險特征描述 在暴露評估的基礎上,將暴露水平與健康指導值相比較,對評估結果進行綜合分析,描述危害對人群健康產生不良作用的風險及其程度,因多效唑有健康指導值,可通過慢性膳食風險商(chronic hazard quotient,HQc)評價,計算公式[19]如下:

式中ADI為每日允許攝入量,即0.1 mg·kg-1。100為安全系數,表示每日由中藥制品中攝取的農藥的量不大于日總暴露量(包括食物和飲用水)的1%。當結果<1時,認為風險可接受;>1時,認為風險不可接受[19]。

結果參麥顆粒中多效唑殘留量的慢性風險商HQc為0.000 7%,遠低于1,表明正常服用參麥顆粒攝入多效唑的健康風險很低。

4 討論

4.1原因分析 我國麥冬主產地為四川,主產區多效唑使用已超過20年,2016年當地政府開始限制、禁止使用多效唑,但多效唑在土壤中的半衰期較長,土壤殘留已成為普遍現象,且已造成水資源污染[21-22]。四川三臺產區植物生長調節劑研究顯示,土壤中多效唑殘留量0.201～11.255 mg·kg-1,麥冬中多效唑殘留量0.106～1.727 mg·kg-1,53%麥冬中多效唑殘留量>0.5 mg·kg-1,環境中的高殘留導致麥冬中多效唑殘留持續處于較高水平[23]。

4.2安全性分析 歐盟農藥數據庫[COMMISSION REGULATION(EU)2019/89]根莖類作物的多效唑限量值為0.01 mg·kg-1,我國“食品中農藥最大殘留限量GB 2763-2021”地上作物的多效唑限量范圍在0.05～0.5 mg·kg-1,四川省食品安全地方標準中“麥冬須根”的標準規定多效唑殘留限量為0.5 mg·kg-1。針對目前麥冬中多效唑殘留的普遍性,以最高限0.5 mg·kg-1作為麥冬限度,結合轉移率,計算參麥顆粒中多效唑的最高殘留量應為0.15 mg·kg-1,結果85批參麥顆粒樣品中多效唑殘留量均在此限度內。根據轉移率推算各批次參麥顆粒投料的麥冬中多效唑的殘留量在0.027 6～0.330 0 mg·kg-1范圍內,表明投料用麥冬藥材中均不同程度殘留多效唑,符合四川省食品地方標準,但不符合歐盟要求,也僅有3批次低于GB 2763-2021限量低限(0.05 mg·kg-1),雖然風險評估結果顯示正常服用參麥顆粒攝入多效唑的健康風險很低,但仍需保持關注。

4.3安全性控制建議 根據《中藥材生產質量管理規范》,中藥材種植中禁止使用膨大劑、壯根靈等植物生長調節劑,而麥冬中普遍存在的多效唑殘留問題仍在持續,目前暫無對麥冬藥材制定相關的法規限制。使用受到殘留污染的麥冬投料制劑生產,麥冬中殘留的多效唑會轉移到制劑,所以建議制定麥冬藥材及飲片中多效唑限量標準,提高麥冬及其制劑安全性。

近年來麥冬中多效唑檢出的報道較多,筆者本次從市場收集30批麥冬(15批藥材和15批飲片),20批有不同程度多效唑殘留?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版中收載的品種共有138個處方含有麥冬,制法包括原粉、水煮及醇提等方式。美國環境保護局(U.S.Environmental Protection Agency,U.S.EPA)發布的《加工食品及飼料中化學殘留物測試指南》規定:需要對加工過程進行研究,以明確原料中的殘留物在加工過程中是否會降解或濃縮,以加工產物中的農藥殘留量是否高于初級產品,來判斷是否需要基于加工過程建立加工品的最大殘留限度,規定明確了加工過程殘留轉移研究對加工品安全性評價的重要意義。本文在參麥顆粒處方藥味按制法共煎條件下評估多效唑殘留轉移規律,多效唑從麥冬藥材到參麥顆粒的轉移率約為30%,對參麥顆粒安全性評價方式具有指導意義,并基于此完成風險評估,提出安全性控制建議,為麥冬制劑的安全性研究提供了數據支撐。