無創產前檢測在篩查胎兒染色體拷貝數變異中的應用價值分析

彭 圓,黃曉莉

(淮安市婦幼保健院醫學遺傳與產前篩查科,江蘇 淮安 223002)

染色體拷貝數變異(chromosome copy number variations,CNVs)一般是指整倍體、非整倍體等染色體數目異常以外,由染色體結構片段變異引起的遺傳性疾病,通常又稱為染色體微缺失微重復。由于CNVs可以影響受精卵形成過程中遺傳物質信息錯誤傳遞,也是導致不孕不育、受孕后自然流產及出生缺陷等不良事件的原因之一。已有報道的致病性CNVs近300種,合并發病率近0.17%(1/600)[1]。無創產前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)技術是從孕婦外周血中提取胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA),通過新一代高通量測序技術,再結合生物信息分析,得出cffDNA相對量,計算出胎兒染色體異常的風險率。在本研究前期進行的NIPT中發現,除常規的21三體、18三體、13三體等染色體數目異常及性染色體疾病具有較高的陽性預測值外[2],染色體拷貝數的缺失或重復也具有較高的陽性預測值。因此,本研究選擇在淮安市婦幼保健院行NIPT且結果提示可能為胎兒CNVs的孕婦為研究對象,對其產前診斷結果及妊娠結局進行回顧性分析,探討NIPT技術在篩查胎兒CNVs中的應用價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月至2021年7月在淮安市婦幼保健院進行NIPT的孕婦有21 389例,選擇NIPT結果提示可能為胎兒CNVs的224例孕婦為研究對象;對其中171例孕婦進行了羊水穿刺及進一步的產前診斷[羊水染色體核型分析及染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)],所有171例接受產前診斷的孕婦均簽署羊水穿刺知情同意書,告知羊水染色體核型分析及CMA的價值及局限性,獲得胎兒羊水樣本171例。孕婦的年齡為21～46歲,平均為(25.2±3.2)歲;孕周為19～31周,平均為(23.1±2.1)周。通過門診和電話隨訪等方式對所有研究對象進行妊娠結局和新生兒情況的隨訪。

納入標準:單胎,自然妊娠的孕婦在1年內未接受過輸血、移植手術或細胞治療。排除標準:孕婦血清TORCH檢測結果陽性,夫妻雙方已知存在染色體數目或結構異常。

本研究已通過淮安市婦幼保健院醫學倫理委員會批準(編號:2019036)。

1.2 方法

1.2.1 NIPT方法

在無菌條件下,隨機抽取孕婦外周血10mL,送遺傳實驗室進行測序,測序設備為北京博奧生物集團有限公司的高通量測序儀(BioelectronSeq 4000),DNA提取試劑盒(磁珠法)為廣東博奧木華基因科技有限公司生產。使用生物信息軟件對測序結果進行分析,獲取樣品染色體所占比例的Z值信息,以|Z|=3為風險截斷值,|Z|<3時判定為染色體非整倍體低風險,|Z|≥3時判定為染色體非整倍體高風險。對于21三體、18三體、13三體出具正式報告,其他染色體數目或結構異常出具輔助報告。對于所有NIPT提示21三體、18三體、13三體高風險或者其他染色體可能存在異常的孕婦,建議進一步進行遺傳咨詢、產前診斷和超聲系統篩查。

1.2.2羊水穿刺術及染色體核型分析和CMA

在行羊水穿刺術前,應用彩色多普勒超聲探查確定穿刺點,避開胎盤、胎兒,消毒、鋪巾、進針,抽得2份20mL羊水樣本,其中1份按照規范進行羊水細胞培養、中期染色體核型制備及核型分析,另1份按照試劑盒的操作說明進行規范的基因組DNA提取,通過質檢后,用單核苷酸微陣列技術(Affymetrix CytoScan 750K)進行胎兒羊水CMA。

根據羊水穿刺結果從胎兒CNVs的不同類型和CNVs的不同片段兩方面進行分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 24.0統計學軟件對所有數據進行分析,計數資料以例數(n)和百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NIPT結果及產前診斷結果的比較

在21 389例孕婦中,經NIPT提示可能為胎兒CNVs的孕婦共有224例,其檢出率為1.05%(224/21 389),對171例孕婦進行了羊水穿刺及進一步的產前診斷,穿刺率為76.34%(171/224),其中95例確診為胎兒CNVs,總陽性預測值為55.56%(95/171)。

根據CNVs不同類型分組,NIPT檢出情況顯示,微缺失組占所有CNVs的54.02%(121/224),微重復組占所有CNVs的39.73%(89/224),微缺失合并微重復組占所有CNVs的6.25%(14/224),見表1。

表1 不同類型CNVs的檢出及診斷情況

根據CNVs不同片段分組,NIPT檢出情況顯示,>10Mb組占所有CNVs的18.75%(42/224),5～10Mb組占所有CNVs的20.54%(46/224),<5Mb組占所有CNVs的60.71%(136/224),見表2。

表2 不同片段CNVs的檢出及診斷情況

2.2 胎兒CNVs的陽性預測情況

在CNVs不同類型組中,微缺失組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合51例,陽性預測值為56.67%;微重復組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合36例,陽性預測值為50.70%;微缺失合并微重復組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合8例,陽性預測值80.00%,三組間陽性預測值比較差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 CNVs不同類型和片段陽性預測值的比較

在CNVs不同片段組中,>10Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合21例,陽性預測值為56.76%;5～10Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合21例,陽性預測值為60.00%;<5Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結果符合53例,陽性預測值為53.54%,三組間陽性預測值比較差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

在CNVs片段<5Mb組中,檢測出2例CMA結果未見異常,但羊水染色體核型分析結果提示異常,1例為9號染色體臂間倒位,核型結果為46,XN,inv(9)(p11q13);另1例為2號與3號染色體間的平衡異位,核型結果為46,XN,t(2;3)(q37;p11)。

2.3 產前診斷結果有關的妊娠結局情況

根據羊水穿刺結果顯示,確診胎兒CNVs共95例,經過與細胞基因組陣列的國際標準(international standards for cytogenomic arrays,ISCA)等數據庫比對分析,將所檢出CNVs的性質分為5類:致病性、可能致病性、意義不明確、可能良性、良性[3-4]。

在經過羊水穿刺進行染色體核型分析和CMA確診的95例胎兒CNVs中,致病性CNVs占33.68%(32/95),可能致病性CNVs占21.05%(20/95),意義不明確CNVs占41.05%(39/95),可能良性CNVs占4.21%(4/95),無良性CNVs病例。

根據產前診斷結果,結合后續的超聲篩查,有38例孕婦選擇了優生引產,其中致病性CNVs引產27例,可能致病性CNVs引產10例,意義不明確CNVs引產1例,無可能良性CNVs和良性CNVs引產病例,見表4。

表4 CNVs的產前診斷結果及妊娠結局(n)

2.4 對NIPT提示為胎兒CNVs孕婦的隨訪情況

對NIPT提示為胎兒CNVs的224例孕婦進行電話或者門診隨訪,其中有31例因拒絕門診就診或就診后電話隨訪不配合導致失訪,隨訪率為86.16%(193/224);但接受羊水穿刺的孕婦隨訪率為100.00%。對于產前診斷結果CNVs雖然為致病性和可能致病性,但選擇繼續妊娠的15例孕婦進行了隨訪和詳細記錄,見表5。

表5 產前診斷結果為致病性和可能致病性CNVs未引產孕婦的妊娠結局

在致病性CNVs中選擇繼續妊娠的孕婦共5例,有3例經對父母進行CMA驗證發現CNVs來自母源,有2例拒絕驗證,5例新生兒中均未見明顯異常表型。

在可能致病性CNVs中選擇繼續妊娠的孕婦共10例,有3例經對父母進行CMA驗證發現CNVs分別來自父源、母源、新發突變;驗證為新發突變的10號病例,新生兒出生后表現為智力低下合并肌張力低,另外2例新生兒中均未見明顯異常表型。10號病例的染色體核型分析及CMA結果顯示,胎兒在2號染色體2q12.1q14.3區段存在21.9Mb片段的重復(見圖1),內含BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74個孟德爾(OMIM)基因;該片段內包含了累及BCL2L11基因的2q13復發性區域[2q13 recurrent region(includes BCL2L11)]。

注：A為10號病例的染色體核型分析結果:46,XY,1qh+,dup(2)(q12q14),箭頭表示異常染色體核型位置;B為10號病例的CMA結果:arr[hg19]2q12.1q14.3(10,2974,221-124,876,241)×3。

在可能致病性CNVs并選擇繼續妊娠的10例孕婦中,有7例拒絕驗證,1例為孕晚期死胎,1例新生兒出生后表現為智力低下(1號病例),另外5例新生兒中均未見明顯異常表型。1號病例的染色體核型分析及CMA結果為5號染色體5p15.33p14.2區帶缺失1個拷貝,長約23Mb(見圖2),該缺失在Decipher數據庫中記錄與行為異常、全面發育遲緩、新生兒張力減退、面容異常、心臟形態異常、不對稱性身材矮小、認知障礙、多發畸形等有關。5p部分單體綜合征又稱貓叫綜合征,是最典型的染色體缺失綜合征,是由染色體5p部分或完全缺失引起的。

注：A為1號病例的染色體核型分析結果:46,XN,del(5)(p14.2p15.3),箭頭表示異常染色體核型位置;B為1號病例的CMA結果:arr[hg19]5p15.33p14.2(38,139-23,389,253)×1。

3 討論

3.1 NIPT相對于傳統篩查的優點

相較于傳統的血清學篩查,NIPT對于胎兒染色體疾病篩查方面檢測準確度更高,檢測范圍更全面,同時因其具有無創、方便、快捷的優點,已經廣泛應用于臨床。隨著新一代高通量測序技術的發展,除了胎兒染色體非整倍體等數目異常外,NIPT還能檢測出胎兒CNVs。目前,對于NIPT胎兒染色體數目異常方面的研究很多,但關于NIPT應用于胎兒CNVs檢測的報道相對較少[5]。本研究經NIPT提示可能為胎兒CNVs的孕婦檢出率為1.05%(224/21 389),與文獻報道[6-10]的NIPT對胎兒CNVs的檢出率為0.175%～1.600%相符。本研究中經羊水穿刺產前診斷后得到的陽性預測值為55.56%(95/171),與丁昭寧等[11]報道的60.0%基本一致。充分肯定了NIPT在胎兒CNVs篩查方面的應用價值。

3.2 NIPT檢測結果的病例分析

隨著NIPT的廣泛應用,其檢測范圍從常見的21三體、18三體和13三體等染色體疾病,逐漸擴展到了CNVs的檢測,從而進一步減少了染色體疾病胎兒的出生。本研究中的10號病例,羊水穿刺染色體核型分析及CMA結果顯示,胎兒在2號染色體2q12.1q14.3區段存在21.9Mb片段的重復,其內包含了BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74個孟德爾(OMIM)基因。有研究顯示,在發育遲緩、畸形等臨床表型患者中檢測到累及BCL2L11基因的2q13區段的重復,部分患者為遺傳自表型正?；蛘咻p微異常的父母(PMID:21255006,26227573);其中PAX8基因雜合突變與常染色體顯性遺傳的先天性非甲狀腺腫的甲狀腺功能減退2型疾病有關,臨床表型包括不能生長發育、智力障礙、甲狀腺功能減退等;GLI2基因雜合突變與常染色體顯性遺傳的前腦無裂畸形9型疾病有關,臨床表型包括前腦無裂畸形、垂體發育不全伴全垂體功能減退、軸后多指畸形等[4]。也有研究顯示,在身材矮小、小頭畸形、短頭畸形、先天性青光眼、智力障礙等臨床表型的患者中檢測到2q11.2q14.2區段的重復;該病例經父母CMA驗證后確定為新發突變及可能致病性CNVs,隨訪胎兒出生后的臨床表型,與羊水穿刺分析結果相符[12]。

3.3 NIPT對于CNVs的驗證價值分析

有研究顯示,NIPT對于胎兒CNVs檢出率與母體血漿中cffDNA含量及CNVs片段不同大小密切相關[13]。本研究中根據CNVs不同類型分組,NIPT對于微缺失、微重復、微缺失合并微重復三組間陽性預測值分別為56.67%、50.70%、80.00%,其中微重復組的陽性預測值最低、微缺失合并微重復組的陽性預測值最高,但三組間陽性預測值比較差異無統計學意義,可以認為NIPT對于微缺失、微重復、微缺失合并微重復三組間的檢測價值方面無區別,國內外文獻中從該角度報道的可查詢文獻較少。本研究中根據CNVs不同片段分組,NIPT對于>10Mb、5～10Mb、<5Mb三組間陽性預測值分別為56.76%、60.00%、53.54%,其中<5Mb組的陽性預測值最低、5～10Mb組的陽性預測值最高,但三組間陽性預測值比較差異無統計學意義。這與張穎等[14]的研究結果一致。

3.4 NIPT假陰性與假陽性的分析

本研究中進行羊水穿刺的171例孕婦,羊水染色體核型分析及CMA確診CNVs共95例,結果陰性76例。分析NIPT在檢測染色體片段發生假陽性與假陰性的原因,可能是由于cffDNA濃度過低、限制性胎盤嵌合(1%～2%概率)、母體染色體異常、NIPT測序深度不夠、測序數據量不足等因素導致[15-17]。2015年,國際產前診斷學會(International Society for Prenatal Diagnosis,ISPD)更新了NIPT的檢測指南,提出對于NIPT范圍的擴大應當限制在研究相對明確的且有異常臨床表型微缺失或者微重復綜合征,對于NIPT提示可能為CNVs異常的孕婦,必須建議其進行規范的超聲篩查及侵入性產前診斷,以獲取胎兒樣本進行確診,對于部分產前診斷結果還要進行父母CMA的驗證。

綜上所述,利用NIPT對于胎兒CNVs進行初步篩查是有效且可行的[18-19],特別是對致病風險≥5Mb的CNVs[20]。對于有CNVs異常風險的胎兒,在經產前診斷后應及時給予干預,建議終止妊娠。NIPT篩查可以有效地減少侵入性產前診斷的人數,也降低了有創性產前診斷可能導致的不必要的胎兒丟失風險。但要明確的是,NIPT技術仍然是一項篩查檢測,還需要對其檢測的精準性進行大樣本的臨床驗證,目前還不能完全取代胎兒樣本CMA結果,不能作為終止妊娠的金標準[21]。本研究中未能對羊水穿刺結果確診為致病性和可能致病性CNVs的所有胎兒進行父母CMA的驗證,且對于新生兒結局的隨訪結果主要是電話溝通獲得信息,缺少專業新生兒科醫師的規范診斷,在后續的研究中需要注意改進。