內質網磷酸化修飾與肺結核感染后免疫反應的相關性研究

陳 程, 鄧 永, 魯學明, 李榜龍, 李小玉

(湖南省長沙市第一醫院, 湖南 長沙 410005)

結核分枝桿菌通過結核病患者呼出的氣溶膠傳播,并被密切接觸者吸入。免疫監測保護了絕大多數受感染的個體,只有少數結核分枝桿菌感染的個體發展為結核病。T細胞對于抵御結核分枝桿菌至關重要,尤其是TH1免疫受損與結核病發病風險增加相關[1]。由結核分枝桿菌特異性T細胞產生的關鍵TH1細胞因子IFN-γ是檢測結核分枝桿菌感染的公認標志。然而,對結核分枝桿菌感染的健康供體的T細胞的IFN-γ表達進行定量,既不足以預測發展為結核病的風險,也不能作為指示急性疾病的可靠生物標志物。近年來,已經發現了其他候選生物標志物,這些生物標志物可能指示疾病機制和T細胞未能更充分地預防結核病,如白細胞介素6(leukin-6,IL-6)[2]。幾項研究報告了T細胞更高的IL-6表達與結核病患者更高的IL-6血清濃度相關[3-4]。最近研究發現,內質網(Endoplasmic reticulum,ER)應激和下游標記物(PERK、eIF2α、IRE-1α、ATF6、ATF4、XBP-1s、GRP78、CHOP和p-JNK)的水平增加介導T細胞免疫功能失調,并促進IL-6等細胞因子釋放[5]。ER應激是多種應激物在細胞中誘導的結果,包括ER腔中錯誤折疊蛋白的積累、營養剝奪、缺氧、治療劑和炎癥因子[6]。在ER應激過程中,磷酸化的蛋白激酶樣內質網激酶(Pancreatic ER kinase-like ER kinase,PERK)與其負性調節因子分離,并磷酸化幾個靶標,包括翻譯起始因子2α,它觸發激活轉錄因子4的表達,瞬時激活了未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)[7]。為此,本研究的目的是闡明異常IL-6表達和PERK激活事件在人類結核病發病過程中對T細胞功能的可能作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:在這項觀察性研究中,我們招募了2021年1月至2023年6月間在本院接受治療的成年結核病患者(n=28)和沒有結核病癥狀并接觸過的家庭接觸者(健康接觸者)(n=28)。排除艾滋病毒感染的結核病患者(n=5)和健康接觸者(n=5),以及實驗數據集不完整的個體(即結核病患者(n=4);健康接觸者(n=3))。最終納入19例結核病患者和20例健康接觸者進行分析。在確診之前,健康接觸者與結核病指數患者在同一個家庭生活了4個多月。根據病史、胸部X光片和痰涂片檢查對肺結核進行診斷。19例結核病患者中,男13例和女6例,平均年齡40.7歲,范圍20～77歲。20例健康接觸者中,男10例和女10例,平均年齡40.0歲,范圍21～65歲。所有患者在開始治療前采集血樣。這項研究得到了本院倫理委員會的批準(2020-05)。所有研究參與者都提供了書面知情同意書。

1.2用于測量上清液細胞因子的全血體外培養:將肝素化全血(100μL)培養在補充有l-谷氨酰胺(2mmoL/L)和青霉素/鏈霉素(50U/mL)的96孔U底超低吸附細胞培養板中,加入結核純化蛋白衍生物(PPD)(10μg/mL,丹麥Statens Serum Institute公司)刺激或不刺激(僅培養基)細胞72h。培養期結束后,對平板進行離心,收獲上清液并使用基于流式細胞術的LEGENDplex試劑盒(美國BioLegend公司)進行測量。培養上清液(12.5μL)在測定緩沖液中以1∶2稀釋并孵育2h,加入鏈霉親和素PE,并將樣品再孵育30min。然后洗滌樣品并用BD LSR Fortessa流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)進行分析每種細胞因子的濃度。

1.3外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分離及PERK、STAT3表達分析:通過密度離心(德國Ficoll公司)從肝素化全血中分離PBMCs。將抗人AlexaFluor488標記的CD4抗體(美國BioLegend公司)和IL-6(25ng/mL)(美國BioLegend公司)添加到每個樣品中,然后將其孵育在37℃、5%CO2環境中15min。離心樣品,在含有FCS(10%)的PBS中洗滌,并采用APC綴合的抗人PERK抗體(美國eBioscience公司)、Dy650綴合的抗人STAT3抗體(英國Abcam公司)進行染色。在BD Accuri C6流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)上測量樣品,以表征CD4+T細胞中PERK、STAT3表達。

1.4T細胞活化測量:將肝素化全血(100μL)培養在補充有l-谷氨酰胺(2mmoL/L)和青霉素/鏈霉素(50U/mL)的96孔U底超低吸附細胞培養板中,加入PPD(10μg/mL)刺激細胞3h。然后,將細胞固定并透化,用針對AlexaFluor488標記的CD4、PE標記的IFN-γ(美國BD Biosciences公司)、PerCP-Cy5.5標記的IL-2(美國BioLegend公司)和APC標記的CD40L/CD154(美國BioLegend公司)的抗體染色。使用BD Accuri C6流式細胞儀測量細胞。

1.5數據處理:使用SPSS24.0軟件對數據進行分析。結果表示為平均值±標準差。兩組間比較采用學生t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗進行多重比較。Spearman等級相關系數用于STAT3表達與PERK水平的相關性分析。統計學顯著性定義為P<0.05。

2 結 果

2.1PPD刺激結核病患者全血中IL-17/IL-22降低和IL-6/IL-10升高:在PPD刺激的全血樣品的上清液中檢測到高IFN-γ濃度,但是在健康接觸者和結核病患者之間沒有顯著差異(圖1A)。與健康接觸者相比,結核病患者的PPD刺激的全血樣品中IL-17、IL-22水平顯著降低(P<0.05),IL-6、IL-10水平顯著增加(P<0.05)(圖1B-E)。

圖1 PPD對結核病患者和健康接觸者全血細胞因子表達影響

2.2結核病患者全血中較高的自發IL-6和IL-10表達水平:我們接下來比較了研究組中非刺激的全血上清液中細胞因子水平。IL-17和IL-22的濃度通常較低,并且在研究組之間具有可比性。相反,與健康接觸者相比,結核病患者的自發IL-10、IL-6和IFN-γ濃度更高(P<0.05)(圖2)。

圖2 結核病患者和健康接觸者全血細胞因子表達

全血在存在結核分枝桿菌PPD的情況下體外培養72h后,測定上清液中IFN-γ、IL-17、IL-22、IL-6和IL-10的細胞因子濃度。

在不存在PPD刺激情況下,測定全血上清液中IFN-γ、IL-17、IL-22、IL-6和IL-10的細胞因子濃度。

2.3來自結核病患者的T細胞的異常高PERK和受損的IL-6反應:通過流式細胞術分析了來自結核病患者和健康接觸者的T細胞中PERK表達(圖3)。在沒有IL-6體外刺激的情況下,與健康接觸者相比,結核病患者的CD4+T細胞中的PERK水平顯著更高(P<0.001)。加入IL-6導致健康接觸者CD4+T細胞中PERK水平較沒有IL-6體外刺激健康接觸者CD4+T細胞顯著增加(P<0.01)。在結核病患者中沒有檢測到IL-6體外刺激對CD4+T細胞中PERK水平的顯著變化。

圖3 IL-6體外刺激對結核病患者和健康接觸者CD4+ T細胞中PERK表達影響

2.4結核病患者CD4+T細胞中較高的STAT3表達與PERK水平相關:與健康接觸者相比,結核病患者的CD4+T細胞具有更高的STAT3蛋白表達(P<0.05)(圖4A)。同樣,與健康接觸者相比,結核病患者的幼稚(CD45RAhigh)和記憶(CD45RAlow)CD4+T細胞中的STAT3水平更高(圖4B)。我們接下來確定了T細胞中PERK和STAT3表達之間的聯系。在所有供體和結核病患者中,CD4+T細胞中PERK和STAT3表達之間呈顯著正相關性(rho=0.571、0.503,均P<0.05),而在健康接觸者中沒有發現二者顯著相關性(rho=0.332,P=0.141)(圖4C)。

圖4 結核病患者CD4+ T細胞中較高的STAT3表達與PERK水平相關

圖5 STAT3水平與結核病患者T細胞活化和IFN-γ表達負相關

2.5STAT3水平與結核病患者T細胞活化和IFN-γ表達負相關:STAT3之前已被證明可調節T細胞受體激活。因此,我們測量了體外PPD特異性刺激后CD40L/IL-2共表達T細胞和CD40L/IFN-γ共表達T細胞的比例。結核病患者和健康接觸者具有相似比例的結核分枝桿菌PPD誘導的CD40L/IL-2共表達T細胞和CD40L/IFN-γ共表達T細胞(圖5A、B)。僅在結核病患者中觀察到CD40L/IL-2共表達T細胞和CD40L/IFN-γ共表達T細胞比例與STAT3表達呈負相關(rho=-0.481、-0.705,P<0.001),而健康接觸者或所有供體中沒有檢測到相關性(CD40L/IL-2:rho=-0.356、0.020,P=0.112、0.899,CD40L/IFN-γ:rho=-0.219、0.071,P=0.340、0.632)(圖5C、D)。

3 討 論

這項研究調查了細胞因子及其相關的T細胞功能在人類結核病患者中的作用。結果顯示,體外自發性和結核分枝桿菌特異性較高的IL-6和IL-10表達水平可能導致結核病患者異常的細胞因子信號事件。此外,結核病患者的CD4+T細胞中STAT3表達與PERK水平呈正相關,并且高STAT3水平與弱TH1反應相關,可能是由于抑制了IL-2信號傳導和T細胞增殖。

結核病由細胞內的結核分枝桿菌引起,其感染可以觸發各種免疫系統成分在炎癥部位的積聚,如M1和M2巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和不同亞型的淋巴細胞[8]。然而,結核分枝桿菌可以逃脫和逃避宿主的先天免疫系統;例如在活動性結核感染期間,T細胞表面的CTLA-4和PD-1增加,來自這些患者的APC上的PDL-1表達增加,導致適當適應性反應的激活減少[9]。最近的證據顯示ER應激在介導結核免疫抑制方面發揮重要作用,如ER應激可以激活骨髓間充質干細胞,并觸發這些細胞產生免疫抑制性的iNOS、活性氧和精氨酸-1[10]。在機制方面,ER應激顯著調節骨髓來源的抑制性細胞對T細胞的抑制活性,促進IL-6、IL-10分泌,這些細胞因子進一步加劇ER應激[11]。其他研究進一步證實了減少T細胞中ER應激相關PERK表達可以促進免疫活性和刺激T細胞,特別是麻風病和結核病[12]。上述數據表明,T細胞中PERK異常表達可能有助于致病細胞因子IL-6的釋放。本研究中,在外源性IL-6存在下,來自結核病患者的CD4+T細胞中的PERK水平沒有增加,并且IL-6誘導的PERK在健康接觸者中的表達沒有達到在結核病患者中觀察到的水平。這些數據表明結核病患者存在異常高的PERK表達和潛在受損的IL-6介導的T細胞反應。

眾所周知,IL-6是TH17細胞發育的關鍵因素,TH17細胞主要參與炎癥性疾病的發展。我們在結核病患者中檢測到產生IL-17和IL-22的TH17細胞比例較低,這與之前的研究一致。最近研究證實,IL-6通過PERK誘導STAT3,IL-6受體信號通過STAT3與gp130鏈結合而受到抑制[13]。研究表明,在結核病感染期間,T細胞和PBMCs中的STAT3 mRNA表達增加[14]。在此,我們通過細胞內流式細胞術表征CD4+T細胞和其他亞群中STAT3蛋白表達水平,并在結核病患者的幼稚(CD45RAhigh)和記憶(CD45RAlow)CD4+T細胞中發現STAT3蛋白表達增加。我們還檢測了不同T細胞亞群中PERK和STAT3表達之間的相關性。與先前關于炎性疾病中PERK/STAT3表達的研究結果一致[14],在結核病患者中,PERK激活伴隨著較高的STAT3蛋白水平。

與健康接觸者相比,我們在結核病患者的PBMCs中檢測到更高的IL-10血漿水平,以及更高的自發IL-10產生。已經描述了結核病患者血漿中較高的IL-10濃度,并且先前也報道了結核病患者體外非活化PBMCs中自發產生的IL-10[15]。在當前和先前的研究中,較高的IL-10表達伴隨著較高的IL-6血漿水平[16]。除了自發產生IL-10和IL-6,結核分枝桿菌PPD存在時,結核病患者的T細胞也被強烈激活,產生IL-10和IL-6。這些結果表明,在以IL-10陽性結核分枝桿菌特異性T細胞為特征的結核病患者中,免疫抑制T細胞表型占優勢。在此背景下,我們一致發現,在結核病患者和接觸者中,STAT3的高表達與低TH1反應之間存在相關性。盡管結核病患者和健康接觸者之間的TH1反應相當,但我們發現CD40L/IL-2共表達T細胞和CD40L/IFN-γ共表達T細胞比例僅在結核病患者中與STAT3表達呈負相關,表明高STAT3水平對結核病患者活化的表達TH1細胞因子的CD4+T細胞有潛在的抑制作用。

總之,我們的數據證實了以前在結核病患者中較高的IL-10/IL-6細胞因子水平的發現,并增加了關于ER磷酸化修飾相關PERK/STAT3信號通路可能驅動結核病患者中的免疫抑制/抗T細胞反應的證據。這種受損的T細胞功能可能導致活動性結核病的免疫反應效率低下,從而需要長期的多種藥物化療。