塔里木馬鹿生茸不同階段營養物質表觀消化率及瘤胃內環境變化規律的研究

盛月云 黃建智 薛鵬飛 于東輝 古力皮葉木·阿布都克然木 錢文熙,2*

(1.塔里木大學動物科學與技術學院,阿拉爾 843300;2.新疆建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室,阿拉爾 843300)

塔里木馬鹿是新疆重點養殖的特色經濟動物,其野生種群是唯一棲息在荒漠生境中的馬鹿亞種。塔里木馬鹿通過采食低質粗飼料獲取能量和蛋白質,長期處于營養匱乏狀態,因此展現出了極高且強大的營養生態適應特征[1]。鹿茸是哺乳動物中唯一可再生(一年一脫落)的器官,成年雄性馬鹿在生產上一般分為生茸期、配種期和生茸恢復期3個階段,生茸期是公鹿養殖的關鍵期[2]。在不到70 d的生茸期里,公鹿不僅要恢復配種期間失去的體重,每天還能增加800～900 g的體重和120～160 g的鹿茸[3]。特別的是,隨著飼喂水平和采食量的增加,飼料利用率一直保持很高。

研究發現,在相同的喂養條件下,相比新疆褐牛、綿羊,塔里木馬鹿對粗飼料有更強的適應性,這種特性與塔里木馬鹿瘤胃菌群中纖維降解菌相對豐度較高有關,提高了其對飼草料的利用效率[4]。馬鹿在生茸期具有較高的飼料利用率,尤其是對蛋白質的利用,其機理尚不清楚,其原因可能與體內蛋白質(氨基酸)周轉效率、瘤胃菌群等有關。有關對公鹿生茸期消化生理特點的研究報導非常少。所以,研究塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃內環境的規律變化,不僅有助于后期為系統挖掘馬鹿對飼糧蛋白質分配模式和體內蛋白質代謝特征提供前期研究,也可為鹿茸生產調控研究提供重要理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2018年3—7月在塔里木大學動物科學與技術學院實驗站進行。

1.2 試驗設計及飼養管理

本試驗采用單因素試驗設計。根據各時期鹿茸的生產特性,把塔里木馬鹿分為4個生產時期,分別為脫盤前期(角盤脫落前21 d)、生茸高峰期(茸型由冰枝開始向三杈生長的21 d)、生茸后期(茸型由三杈開始向四杈生長的21 d)和鋸茸后期(鋸茸后待馬鹿恢復3～5 d后的21 d)。試驗選用5只成年體況接近、健康的雄性塔里木馬鹿為試驗動物。預試期前10 d使用阿苯達挫統一驅蟲,每日08:00、19:00各飼喂1次,保證自由采食和飲水。共分4期進行試驗,每期21 d,其中預試期15 d,正試期6 d,每期正試期第1天開始收集糞樣,正試期第6天晨飼后3 h采集瘤胃液。試驗采用外源指示劑法測定消化率,每日08:00、19:00各飼喂1次,每次飼喂2.0 g三氧化二鉻(Cr2O3),與飼糧充分混勻后飼喂。

試驗飼糧參照《中國養鹿學》[5]和《新疆馬鹿飼養技術》[2]中建議的馬鹿營養需要進行配方設計。采用全混合日糧飼喂,飼糧精粗比為5∶5,脫盤前期、生茸高峰期、生茸后期和鋸茸后期干物質采食量分別為4.00、6.25、7.56和4.50 kg?；A飼糧組成及營養水平見表1。

某營養物質表觀消化率(%)=100×[1-(飼糧中指示劑含量×飼糧中該營養物質含量)/(糞中指示劑含量×糞中該營養物質含量)][6]。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集及指標測定

1.3.1 營養物質表觀消化率

每期正試期第1天開始收集新鮮糞樣100 g左右,加入10%的硫酸進行固氮,放入-20 ℃冰箱保存,用于營養物質表觀消化率的測定。測定樣品之前,將糞樣放入65 ℃烘箱中烘干48 h后粉碎并過40目篩,計算營養物質表觀消化率,計算公式如下:

飼糧樣品及糞樣中干物質(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白質(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)、磷(P)含量分別參照GB/T 6435—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2022、NY/T 1459—2022、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018的方法測定。有機物(OM)含量計算公式如下:

OM=1-Ash。

1.3.2 瘤胃液的采集及處理

在正試期第5天晨飼3 h后,麻醉后使用口腔插管采集瘤胃液,在經4層無菌紗布過濾后立即測定pH,之后將瘤胃液轉移至滅菌離心管,放入-80 ℃冰箱中保存,用于發酵參數及微生物的測定。pH采用pH計(pH-FE28)測定。氨態氮(NH3-N)含量采用酚-次氯酸鈉比色法進行測定,參照馮宗慈等[7]的方法。揮發性脂肪酸(VFAs)含量采用氣相色譜法進行測定,參照曹慶云等[8]的方法。微生物蛋白(MCP)含量采用差速離心法進行測定,參照Broderick等[9]的方法。

1.3.3 樣本DNA的提取及PCR擴增

使用北京天根生化科技有限公司試劑盒,按照說明提取瘤胃液微生物總DNA,利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測總DNA的質量和濃度,使用細菌通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA可變區V4區進行PCR擴增,使用Thermo Fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后,使用Thermo Fisher的IonS5TMXL進行上機測序,對微生物多樣性進行分析。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 23.0中onw-way ANOVA程序進行單因素方差分析,用Duncan氏法進行多重比較。試驗數據用平均值和均值標準誤(SEM)表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 塔里木馬鹿生茸不同階段營養物質表觀消化率的變化規律

由表2可知,塔里木馬鹿生茸高峰期的CP表觀消化率顯著高于生茸后期和鋸茸后期(P<0.05),生茸高峰期的OM和ADF表觀消化率顯著高于鋸茸后期(P<0.05)。塔里木馬鹿生茸不同階段的DM和NDF表觀消化率差異不顯著(P>0.05)。

表2 塔里木馬鹿生茸不同階段的營養物質表觀消化率

2.2 塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃發酵參數的變化規律

由表3可知,塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃pH和NH3-N含量差異不顯著(P>0.05)。塔里木馬鹿生茸高峰期和生茸后期的瘤胃MCP和丙酸含量顯著高于脫盤前期和鋸茸后期(P<0.05),脫盤前期顯著高于鋸茸后期(P<0.05);生茸高峰期的瘤胃乙酸、丁酸及總揮發性脂肪酸(TVFA)含量顯著高于脫盤前期、生茸后期和鋸茸后期(P<0.05),生茸后期的瘤胃異丁酸含量顯著低于脫盤前期和鋸茸后期(P<0.05),脫盤前期和鋸茸后期的瘤胃異戊酸含量顯著高于生茸高峰期和生茸后期(P<0.05)。

表3 塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃發酵參數

2.3 塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃微生物菌群豐度和多樣性變化規律

從圖1可見,隨著序列數目的增加,大部分樣品在序列數目達到25 000時,稀釋曲線已經接近平緩,這說明取樣的數量合理,可以進行后續數據分析。

A:脫盤前期 early stage of antler plate;B:生茸高峰期 peak period of antler growth;C:生茸后期 late stage of antler growth;D:鋸茸后期 late stage of sawing antler。下圖同 the same as below。

由表4可知,塔里木馬鹿脫盤前期、鋸茸后期的觀測物種數和Chaol指數均顯著高于生茸高峰期(P<0.05),而與生茸后期差異不顯著(P>0.05);脫盤前期的Shannon指數顯著高于生茸高峰期(P<0.05),而與生茸后期和鋸茸后期差異均不顯著(P>0.05)。

表4 塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃菌群豐富度和多樣性指數

從圖2可見,塔里木馬鹿脫盤前期、生茸高峰期及生茸后期的瘤胃菌群存在明顯差距。

Stress:應力值,該值越小越好,一般認為當該值小于0.2時,非度量尺度分析的結果較可靠。

2.4 塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃微生物門、屬水平相對豐度變化規律

由表5可知,在門水平上,塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌門。塔里木馬鹿生茸高峰期的瘤胃擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著高于脫盤前期(P<0.05),而與生茸后期和鋸茸后期無顯著差異(P>0.05);脫盤前期瘤胃厚壁菌門和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度顯著高于生茸高峰期(P<0.05),而與生茸后期和鋸茸后期無顯著差異(P>0.05)。塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃其他菌門相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表5 塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃微生物門水平相對豐度

由表6可知,在屬水平上,塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃中未注釋的擬桿菌目(unidentified-Bacteroidales)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)為優勢菌屬。塔里木馬鹿生茸后期的瘤胃未注釋的瘤胃球菌科(unidentified-Ruminococcaceae)相對豐度顯著高于生茸高峰期(P<0.05),而與生茸后期和鋸茸后期無顯著差異(P>0.05);脫盤前期的瘤胃未注釋的毛螺菌科(unidentified-Lachnospiraceae)和厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)相對豐度顯著高于生茸高峰期(P<0.05),而與生茸后期和鋸茸后期無顯著差異(P>0.05)。塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃其他菌屬相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表6 塔里木馬鹿生茸不同階段的瘤胃微生物屬水平相對豐度

3 討 論

3.1 塔里木馬鹿生茸不同階段營養物質表觀消化率的變化規律

塔里木馬鹿在生態逆境自然選擇壓力下,保持著對飼料蛋白質極強的消化利用能力,尤其在生茸階段,隨著飼喂水平和采食量的顯著增加,飼料利用率一直維持著較高的水平。一些動物在特殊的生理期,對飼料養分的利用效率均會有所提高,如母豬孕期合成代謝[10]和肉牛生長補償等[11]。通常情況下,動物對飼料的消化率隨采食量的增加而呈現下降趨勢[12]。本試驗中,由于公鹿在脫盤前期攻擊性強,無法收糞,因此缺失脫盤前期的消化率數據;塔里木馬鹿采食量由生茸高峰期至鋸茸后期呈現先上升后下降趨勢,且鋸茸后期低于前2期,NDF表觀消化率變化規律符合這一規律。擬桿菌門的主要作用是分解可發酵碳水化合物和蛋白質及纖維細胞壁的多糖[13]。本研究中,生茸高峰期的瘤胃擬桿菌門相對豐度高于生茸后期和鋸茸后期,呈現降低趨勢,且CP、OM、ADF表觀消化率從生茸高峰期至鋸茸后期呈現同樣的下降趨勢,說明擬桿菌門是塔里木馬鹿在生茸階段保持著對飼料蛋白質極強的消化利用能力的主要因素之一。高秀華等[14]研究發現,梅花鹿鹿茸產量和體增重均不受飼糧粗蛋白質水平影響,但提高飼糧粗蛋白質水平可顯著提高生茸期蛋白質的消化率[14]。這說明生茸階段蛋白質消化率的提高對鹿茸的生長起重要作用。李長生等[15]研究發現,雄性梅花鹿全年外周血漿中睪丸酮和雌二醇的含量出現明顯的變化規律。因此,生茸階段消化率的變化特點可能與性激素水平變化有關。

3.2 塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃發酵參數的變化規律

瘤胃pH是瘤胃發酵情況的綜合表現,主要受唾液分泌、飼糧結構、VFAs含量及瘤胃上皮對VFAs吸收速率、瘤胃食糜流通速率等因素影響。此前對茸鹿瘤胃pH研究發現,瘤胃pH保持在5.6～6.6[16]。通常情況下,TVFA含量上升,瘤胃pH會下降[17]。本研究中,塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃pH維持在5.97～6.21,屬于正常范圍,由脫盤前期至鋸茸后期,瘤胃pH雖然差異不顯著,但呈現先上升后下降趨勢,而瘤胃TVFA含量也呈現先上升后下降趨勢,且生茸高峰期達到最高(110.73 mmol/L),瘤胃pH和TVFA含量并未表現出相應的負相關變化。研究發現,茸鹿的瘤胃食糜通過速度與季節存在很大關系,最低速度系數在2月份,最高速度系數在12月份[16]。本試驗中,在不改變飼糧結構的條件下,隨著瘤胃TVFA含量變化,瘤胃pH并未表現出顯著變化。這可能是由于塔里木馬鹿在脫盤前期瘤胃食糜流通速度處于較低水平,TVFA向后腸道流通較慢,使得瘤胃pH也處于較低水平。此外,塔里木馬鹿也表現出一種維持瘤胃pH穩定的能力。

瘤胃NH3-N含量的高低反映瘤胃微生物對飼糧蛋白質、氨基酸、尿素、多肽等的利用程度,同時也是MCP合成的主要來源物質[18]。瘤胃NH3-N含量的高低反映出特定飼糧組成條件下蛋白質降解與MCP合成的動態平衡關系,即NH3-N的產生和MCP的合成[19]。MCP是反芻動物的重要蛋白質供應來源之一,它能夠滿足40%～80%的動物蛋白質需求量。其合成效率直接影響著反芻動物對飼料蛋白質的利用程度[20]。茸鹿處于脫盤前期時,食欲和消化機能相應提高,此時,不僅要恢復配種期下降的體重,同時要為生茸儲備營養[16]。生茸高峰期時,體內睪酮含量最低,消化代謝能力強,生茸速度達到高峰,營養需要量比其他時期更多,特別是對蛋白質的需求[16]。本試驗中,在飼喂過程中不改變飼糧組成,僅改變采食量,即保持飼糧等能等氮情況下,由脫盤前期至鋸茸后期,瘤胃NH3-N含量并未出現顯著變化,但MCP含量呈現先上升后下降趨勢,MCP含量依次為92.43、108.46、109.23、87.64 mg/dL,生茸高峰期和生茸后期差異不顯著。這說明在塔里木馬鹿處于生茸期時,MCP合成效率增加,對蛋白質利用效率提高,以滿足生茸的需求。脫盤前期的瘤胃MCP含量也顯著高于鋸茸后期,相比鋸茸后期,脫盤前期為恢復損失的體重和為生茸儲能,需要更多的能量和蛋白質需求,理應具有相對較高的蛋白質利用效率,與試驗結果相呼應。

瘤胃發酵是一項復雜而高效的生理過程,通過微生物發酵產生大量VFAs以作為能量供儲。VFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸,其中的乙酸、丙酸和丁酸比例約占整個TVFA的95%[21]。這些VFAs提供的能量占據了反芻動物總能量需求的70%～80%[22]。碳水化合物中對乙酸產量影響最大的是纖維素的降解量,而可溶性碳水化合物降解量主要影響到丙酸產生量,乙酸和丁酸是合成乳脂的前體物,丙酸是合成葡萄糖的前體物[23]。本試驗中,瘤胃乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量在生茸高峰期和生茸后期顯著高于脫盤前期,而異戊酸恰恰相反。擬桿菌門是降解可發酵碳水化合物的主要細菌[13]。厚壁菌門[24]和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)[25]是反芻動物瘤胃中主要的纖維降解菌。毛螺菌科(Lachnospiraceae)表現強烈的水解活性,促進丁酸的產生[26]。本研究中,生茸高峰期和生茸后期的瘤胃擬桿菌門相對豐度也隨丙酸含量呈現相同的變化,但厚壁菌門和未注釋的瘤胃球菌科相對豐度在生茸高峰期低于脫盤前期,而乙酸含量卻呈現相反的變化,說明機體在此時期發酵產生更多的乙酸為生茸而供能,可能是由于采食量劇增引起的。研究表明,睪酮的合成和代謝紊亂將通過相關代謝通路影響腸道菌群的變化或不穩定以及多樣性改變,進而影響代謝[27]。異丁酸、異戊酸是含4或5個碳原子的直鏈揮發性脂肪酸的異構體,稱異位酸。瘤胃微生物能夠利用異位酸作為碳骨架的來源,合成支鏈氨基酸,進一步促進了瘤胃微生物的生長[28-29]。在脫盤前期,體內睪酮含量處于自交配季節由高降低過程中,且相比生茸高峰期和生茸后期具有較高的異戊酸含量,可能能夠刺激瘤胃微生物活性并促進瘤胃代謝恢復,為了補償機體配種期的消耗。

3.3 生塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃微生物的變化規律

Alpha多樣性可以反映微生物群落豐富度和多樣性。研究發現,雄激素剝奪會減少利用雄激素的腸道細菌,且雄性激素過多也會影響Beta多樣性[30]。去勢3 d后的犢牛,體內的微生物群落結構發生顯著改變,并且Shannon指數明顯降低[31]。此前研究發現,雄性梅花鹿全年外周血漿中睪丸酮含量出現明顯的變化規律[15],生茸高峰期睪酮含量最低[16]。本試驗中,生茸高峰期觀測物種數、Chaol指數及Shannon指數均低于其他3個時期,且顯著低于鋸茸前期,與生茸后期無顯著差異,且脫盤前期和生茸高峰期、生茸后期微生物群落間存在明顯差異。因此,生茸高峰期微生物豐富度和多樣處于最低,可能與體內睪酮含量及利用雄激素的微生物數量的減少有關。

此前,對塔里木馬鹿瘤胃微生物研究發現,第一優勢菌門為擬桿菌門,第二優勢菌門為厚壁菌門,且二者相對豐度和超過75%[32-33]。本試驗中,塔里木馬鹿由脫盤前期至鋸茸后期,瘤胃液中優勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門,且相對豐度和超過90%,與此前研究結果一致。擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度呈現相反的變化趨勢。擬桿菌門能分解飼糧中蛋白質和糖類大分子物質,提高對養分的消化吸收效率[34],且與瘤胃中丙酸含量成正比[35]。本試驗中,相對于脫盤前期,生茸高峰期具有更高相對豐度的擬桿菌門,且在這2個時期擬桿菌門相對豐度與瘤胃內丙酸含量也成正比,與已有研究結果一致。生茸高峰期較高相對豐度的擬桿菌門可能提高塔里木馬鹿在生茸高峰期對蛋白質和糖類的消化利用效率,為機體供應更多的蛋白質和能量。厚壁菌門可以分解飼料中纖維物質。異位酸對于反芻動物瘤胃內的纖維降解菌具有促進作用,能夠提高飼料纖維的降解消化率[36]。研究發現,睪酮會使厚壁菌門的相對豐度更高,而使擬桿菌門的相對豐度更低[37]。本試驗中,脫盤前期的瘤胃厚壁菌門相對豐度顯著高于生茸高峰期,同時發現異戊酸也具有相同的變化趨勢,與前期研究結果變化相符合,這些變化原因可能由生茸期睪酮激素水平變化引起的。研究發現,厚壁菌門與擬桿菌門比例與脂肪沉積密切相關,在肥胖人群中厚壁菌門相對豐度比瘦弱人群高,而擬桿菌門相對豐度比瘦弱人群低[38]。本試驗中,厚壁菌門與擬桿菌門比例也存在明顯變化,脫盤前期相較生茸高峰期和生茸后期具有更高的比例。由此而見,較高的厚壁菌門與擬桿菌門比例在塔里木馬鹿脫盤前期體況恢復方面發揮重要作用。

在屬水平,生茸期塔里木馬鹿瘤胃未注釋的擬桿菌目、解琥珀酸菌屬為優勢菌屬。厭氧弧菌屬能夠利用甘油、核糖發酵,產生丙酸、乙酸和琥珀酸[39]。毛螺菌科表現強烈的水解活性,能夠發酵葡萄糖和果膠,促進丁酸的產生[26]。本試驗中,在相對豐度排名前10細菌屬中,僅未注釋的毛螺菌科在脫盤前期顯著高于生茸高峰期,與異丁酸含量呈現正相關變化。此前研究發現睪酮含量會增加厚壁菌門含量[37]。這說明未注釋的毛螺菌科和厭氧弧菌屬可能是睪酮含量隨季節時間變化對瘤胃液細菌在屬水平影響較大的菌屬。雖然相對豐度不高,但這些微生物可能在脫盤前期降解營養物質,為機體提供能量方面發揮重要作用。

4 結 論

① 塔里木馬鹿對CP、OM、ADF表觀消化率從生茸高峰期至鋸茸后期呈現下降趨勢。

② 塔里木馬鹿在生茸高峰期和生茸后期具有更高的MCP合成效率,對蛋白質有更高的利用能力。

③ 塔里木馬鹿生茸不同階段瘤胃中擬桿菌門和厚壁菌門為優勢菌門,呈現相反變化趨勢;未注釋的擬桿菌目、解琥珀酸菌屬為優勢菌屬。

④ 瘤胃未注釋的毛螺菌科、厭氧弧菌屬和未注釋的瘤胃球菌科是影響塔里木馬鹿生茸階段營養物質表觀消化率和發酵參數的主要菌屬。