激活轉錄因子4與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1互作調控奶牛乳蛋白合成的研究進展

程鳳琦 卜登攀 徐連彬

(1.青島農業大學動物科技學院,青島 266109;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,動物營養學國家重點實驗室,北京 100193)

《中國奶業質量報告(2021)》指出,到2025年我國奶業將實現全面振興,基本實現現代化;奶源基地、乳品質量和產業競爭力整體水平進入世界先進行列[1]。蛋白質飼料資源供應不足是限制我國畜牧業發展的重要因素之一。據我國海關統計,近些年我國飼用蛋白質飼料對外依存度長期保持在80%以上,且需求及進口價格一直呈上漲趨勢[2]。奶牛業是我國優先發展的畜牧業,經過改革開放以來的規模擴張和調整提高2個發展階段,已具備向現代化轉型、向世界一流邁進的產業基礎,但我國奶牛生產效率仍然有提升空間,飼糧氮利用效率僅為發達國家的75%左右[3],進一步加劇了蛋白質飼料資源的供需矛盾并造成了巨大的環保壓力。因此,我國奶業肩負著推動碳達峰、碳中和目標的責任與使命。實際生產中,低蛋白質飼糧基礎上補飼特定氨基酸(amino acid,AA)可提高奶牛的飼糧氮轉化效率,但指導其應用的理論基礎尚不清晰。已有研究表明,所有AA補充時可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通路促進乳蛋白的合成,而AA缺乏可通過激活轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)抑制mTORC1的活性,提示ATF4與mTORC1之間的互作為研究限制性AA在低蛋白質飼糧條件下調控乳蛋白合成的機制提供了重要切入點。本文就此相關內容進行了綜述,以期為完善奶牛限制性AA理論和指導低蛋白質飼糧的配制提供一定參考。

1 低蛋白質飼糧添加AA促進奶牛乳蛋白合成

與生長動物相比,泌乳奶牛的飼糧氮轉化效率偏低。Hristov等[4]根據846個生產試驗數據所做的薈萃分析表明,奶牛飼喂17.8%蛋白質水平的牧草型飼糧時,飼糧氮利用效率僅為25%。相比發達國家,這一問題在我國奶牛養殖業中尤為嚴重。白雪利等[5]在調查中原地區25個奶牛場后發現,飼糧蛋白質水平為15%時,飼糧氮利用效率僅為26%,造成了飼料資源的大量浪費。影響泌乳奶牛氮利用效率的營養因素包括營養水平、養分構成和能氮平衡[6],其中飼糧蛋白質水平的影響不容忽視。大量研究表明,低蛋白質飼糧可有效促進氮的利用。Liu等[7]研究發現,與高蛋白質飼糧相比,泌乳高峰期奶牛飼喂低蛋白質飼糧有較高的牛奶蛋白質效率和總蛋白質效率。AA是蛋白質的重要組成部分,也是哺乳動物上皮細胞增殖和酪蛋白質合成的調節因子[8-9]。一系列奶牛飼喂和灌注試驗表明,適度降低飼糧蛋白質水平的基礎上添加特定AA可在維持生產性能的前提下提高攝入氮向乳蛋白的轉化,從而節約蛋白質飼料資源[10-11]。Haque等[12]發現證明,降低飼糧蛋白質攝入并向十二指腸直接灌注一定比例的組氨酸(histidine,His)、賴氨酸(lysine,Lys)、蛋氨酸(methionine,Met)和亮氨酸(leucine,Leu)可顯著提高泌乳奶牛飼糧氮轉化效率。Lee等[13]發現,在降低飼糧蛋白質水平的同時,補飼過瘤胃Met沒有降低奶牛的產奶量和乳蛋白產量。以上結果提示,“低蛋白質加AA”飼喂策略促進飼糧氮的轉化,但指導其進一步生產應用的理論基礎急需闡明。

2 mTORC1

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種非典型的絲氨酸(serine,Ser)/蘇氨酸(threonine,Thr)蛋白激酶,屬于磷脂酰肌醇-3-激酶相關蛋白激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase-related protein kinase,PIKK)家族,可對營養水平和生長信號做出反應。mTOR包括mTORC1和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)這2種不同蛋白質復合物。其中mTORC1可整合來自AA、細胞應激、能量狀態和生長因子等信號,通過促進合成代謝和抑制分解代謝調節細胞的生長與分化[14]。如圖1所示[15],mTORC1由mTOR、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白調節相關蛋白(Raptor)、40 ku富含脯氨酸的蛋白激酶B底物(proline-rich Akt substrate of 40 ku,PRAS40)、含有DEP結構域的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白(DEP domain containing mTOR interacting protein,Deptor)和哺乳動物致死性SEC13蛋白8(mammalian lethal with SEC13 protein 8,mLST8)組成。AA是一類調節mTORC1信號通路的信號分子,具體表現為通過抑制其下游真核起始因子4E結合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4E-BP1)活性控制翻譯起始效率,通過刺激真核延伸因子-2(eukaryotic elongation factor-2,eEF-2)蛋白磷酸化水平增加翻譯延伸效率,通過激活核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase,S6K1)增強核糖體生物活性[16]。前人研究發現,飼糧蛋白質水平和吸收后AA供給變化影響乳腺mTORC1信號通路和乳蛋白的合成[17-18]。Duan等[19]研究發現,補充Met可能激活mTORC1信號通路,進一步增加奶牛乳腺上皮細胞(cow mammary epithelial cells,CMECs)中L型氨基酸轉運蛋白1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)及其相關蛋白4F2重鏈(4F2 heavy chain,4F2hc)的表達,從而影響乳蛋白的合成。剝奪所有AA或去除Leu或異亮氨酸(isoleucine,Ile)分別影響牛乳腺組織中S6K1蛋白磷酸化和酪蛋白合成[20]。eEF-2也被認為受mTOR控制,經AA激活后,哺乳動物mTORC1的靶標磷酸化eEF-2,最終刺激mRNA翻譯起始和伸長[21],因此eEF-2是乳蛋白合成的一個重要限制因素[22]。例如培養基中去除所有必需氨基酸(essential amino acid,EAA)增加了牛乳腺組織中eEF-2的磷酸化水平[20]。此外,4E-BP1在Thr37/46位點的磷酸化被認為是翻譯起始率的一個指標[23]。4E-BP1的磷酸化還對多種AA有反應,例如Ile、Thr和Leu等[24]。進一步的分析發現,mTORC1及其下游S6K1和4E-BP1的磷酸化水平與乳蛋白合成速率存在顯著正相關[25]。以上結果提示,mTORC1是乳蛋白合成的一個重要調控靶點。

Amino acids:氨基酸;GDP:二磷酸鳥苷 guanosine diphosphate;GTP:三磷酸鳥苷 guanosine triphosphate;mTORC1:雷帕霉素靶蛋白質復合物1 mammalian target of rapamycin complex 1;mTOR:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin;RagA/B、RagC/D:Rag異二聚體的激活形式 Rag heterodimers activation form;Raptor:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白調節相關蛋白 mammalian target of rapamycin regulatory related protein;Deptor:有DEP結構域的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白 DEP domain containing mTOR interacting protein;mLST8:哺乳動物致死性SEC13蛋白8 mammalian lethal with SEC13 protein 8;PRAS40:40 ku富含脯氨酸的蛋白激酶B底物 proline-rich Akt substrate of 40 ku;4E-BP:真核起始因子4E結合蛋白 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1;ULK1:UNC-51樣激酶1 UNC-51 like kinase 1;TFEB1:脂蛋白質1 lipoprotein 1;LIPIN1:磷脂酸磷酸酶lipin1 phosphatidic acid phosphatase lipin1;HIF1α:缺氧誘導因子1α hypoxia-inducible factor 1α;ATF4:激活轉錄因子4 activating transcription factor 4;Protein synthesis:蛋白質合成;Lipid metabolism:脂質代謝;Cellular proliferation:細胞增殖;Autophagy:自噬。

3 ATF4

哺乳動物擁有超過50種堿性亮氨酸拉鏈[basic (region-leucine) zipper,bZIP]蛋白,其中包括ATF4[26]。在ATF4中,bZIP結構域外的序列約占蛋白質的82%,其包含ATF4的大部分已知翻譯后修飾位點,參與調節ATF4的穩定性、定位和激活基因轉錄等生物過程[27-31]。ATF4及靶基因的構成如圖2所示[32]。ATF4可通過調節目的基因的表達促使細胞適應特定的外部刺激[33],該過程稱為整合應激反應(integrated stress response,ISR),由AA缺乏誘導的一般性調控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible kinase 2,GCN2)和內質網應激誘導的蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)介導[34]。ATF4參與調節炎癥反應[35]、胰島素分泌[36]、自噬[37-38]和內質網應激[39-40]等重要生物過程。近年來關于ATF4調控乳蛋白合成的報道日益增多。GCN2對真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化促進ATF4的選擇性翻譯誘導基因表達,使機體適應AA缺乏從而使體內AA恢復平衡[41]。Torrence等[42]通過NanoString數字基因定量技術發現ATF4的幾十個靶基因涉及AA合成、一碳代謝和AA轉運功能等。Park等[32]同樣證實大量ATF4靶基因參與AA轉運系統,例如陽離子AA轉運蛋白——溶質載體家族7成員α1(solute carrier family 7 member α1,SLC7α1,又稱CAT1)、支鏈AA轉運蛋白——溶質載體家族7成員α5(solute carrier family 7 member α5,SLC7α5,又稱LAT1)以及多種AA轉運蛋白質的伴侶——溶質載體家族3成員α5(solute carrier family 3 member α2,SLC3α2)。Edick等[43]研究證明在CMECs中,聯合缺乏精氨酸(arginine,Arg)、Leu和Lys或者Arg單獨缺乏1、4、8和24 h情況下,ATF4的下游適應AA缺乏的特異性靶基因天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS)和SLC7α1表達上調。以上結果表明,ATF4是AA轉運、合成及蛋白質合成的一個重要調控靶點。

Integrated stress response:整合應激反應;Amino acids deficiency:氨基酸缺乏;PERK:蛋白激酶R樣內質網激酶 protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;GCN2:一般性調控阻遏蛋白激酶2 general control nonderepressible kinase 2;SESN2:Sestrin 2;ASNS:天冬酰胺合成酶 asparagine synthetase;PHGDH PSATI:磷酸甘油酸脫氫酶 phosphoglycerate dehydrogenase;SLC6α9:溶質載體族6成員α9 solute carrier family 6 member α9;SLC7α5:溶質載體家族7成員α5 solute carrier family 7 member α5;SLC3α2:溶質載體家族3成員α2 solute carrier family 3 member α2;SLC7α1:溶質載體家族7成員α1 solute carrier family 7 member α1;Leucine sensor:亮氨酸傳感器;Asparagine synthesis:天冬酰胺的合成;Serine synthesis:絲氨酸合成;Glycine transporter:甘氨酸轉運體;A transporter for branched chain amino acids:支鏈氨基酸的轉運體;A chaperone for multiple amino acid transporters:多種氨基酸轉運體的伴侶;A transporter of cationic amino acids:陽離子氨基酸的轉運體。

4 ATF4與mTORC1互作調控蛋白質合成

4.1 AA缺乏介導ATF4抑制mTORC1

低蛋白質飼糧補飼AA技術的一個重要特征是減少奶牛飼糧蛋白質和AA的攝入。當蛋白質缺乏或AA不平衡時,可以激活哺乳動物的AA響應信號通路,該過程包括空載轉運RNA(transfer RNA,tRNA)激活的GCN2、eIF2α磷酸化和ATF4表達改變等一系列級聯反應,最終導致mTORC1的活性下降并抑制蛋白質的翻譯過程[44]。ATF4與mTORC1互作調控蛋白質合成途徑如圖3所示[45]。最近的研究進一步明確了ATF4對mTORC1的調控作用,敲除ATF4基因的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),mTORC1對Leu的缺乏表現出持續的激活狀態[46]。Yu等[47]證實在CMECs中,葡萄糖通過ATF4-Sestrin 2(SESN2)-腺苷酸激活蛋白質激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)-mTORC1途徑促進細胞生長和酪蛋白合成。Condon等[44]利用全基因組CRISPR篩選發現,激活ATF4抑制了mTORC1信號通路進而中斷線粒體功能;并發現在寡霉素誘導下,ATF4介導的發育調控以及DNA損傷響應1(regulated in development and DNA damage 1,REDD1)或SESN2的表達上調抑制mTORC1活性。同樣,Jang等[46]研究證明,在二甲雙胍誘導下,ATF4介導的REDD1和SESN2表達上調在mTORC1抑制中起著重要作用。在AA缺乏的細胞中,ATF4翻譯增多并通過抑制整體蛋白質合成速度,從而緩解AA缺乏對細胞產生的影響[48]。SESN2是一種高度保守的蛋白質,可在多種應激條件下誘導表達,抑制mTORC1活性是SESN2的關鍵下游功能[49-50]。關于AA缺乏下ATF4調控mTORC1的作用途徑,Luo等[45]研究發現ATF4誘導的SESN2負調控CMECs中AA介導的mTORC1通路和隨后的酪蛋白質合成。Liu等[51]進一步證實SESN2可以通過AMPK-mTORC1信號傳導抑制mTORC1途徑。目前Luo等[45]已證實CMECs中AA剝奪通過ATF4誘導SESN2的表達進而抑制mTORC1通路,并隨后通過SH3結構域結合蛋白4(SH3 domain-binding protein 4,SH3BP4)抑制酪蛋白合成。Chen等[52]也發現谷氨酰胺(glutamine,Glu)觸發一般AA控制(the general amino acid control,GAAC)途徑增加ATF4水平,從而上調如SLC7α5等AA轉運蛋白,增加AA攝取并提高細胞內AA水平,重新激活mTORC1并抑制自噬。鑒于mTORC1對蛋白質合成的影響,以上結果證實,ATF4蛋白介導AA缺乏抑制mTORC1,進而抑制乳蛋白的合成。

Amino acid supplement:氨基酸補充劑;Amino acid deficiency:氨基酸缺乏;Extracellular:細胞外;Cytopiasm:細胞質;Casein:酪蛋白;ATF4:激活轉錄因子4 activating transcription factor 4;GCN2:一般性調控阻遏蛋白質激酶2;PERK:蛋白激酶R樣內質網激酶 protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;SENS2 gene expression:SENS2基因表達;REDD1:發育調控以及DNA損傷響應1 regulated in development and DNA damage 1;SH3BP4:SH3結構域結合蛋白質4 SH3 domain-binding protein 4;S6K1:核糖體蛋白S6激酶1 ribosomal protein S6 kinase;eIF4E:真核起始因子4E eukaryotic initiation factor 4E;RPS6:核糖體蛋白S6 ribosomal protein S6;4E-BP1:真核起始因子4E結合蛋白1 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1;Rag GTPase:Rag鳥苷三磷酸酶 Rag guanosine triphosphatase;CHAC1:ChaC谷胱甘肽特異性γ-谷氨酰環轉移酶1 ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 1;SLC7α11:溶質載體家族7成員α11 solute carrier family 7 member α11;SESN2:Sestrin 2。

4.2 補充AA通過mTORC1調控ATF4相關靶基因

低蛋白質飼糧補飼AA技術的關鍵是篩選適宜的AA添加種類。以往研究表明,補充AA可通過mTORC1通路調控乳蛋白合成,最新的研究證實ATF4蛋白在其中發揮重要作用。Park等[32]研究發現,抑制mTORC1影響了HEK-293T細胞中ATF4相關靶基因的表達;富集分析發現這些基因參與AA代謝、AA轉運和tRNA氨?；D移酶活性,后者與乳蛋白合成密切相關,證實了ATF4蛋白部分介導了AA補充下mTORC1對乳蛋白合成的調控作用。Adams[53]研究發現,ATF4可調節哺乳動物細胞中mTORC1信號通路與AA攝取、AA合成、tRNA生成的結合,進而影響翻譯效率與蛋白質的合成。進一步分析表明,mTOR可在2種水平上控制ATF4的表達。在轉錄水平上,mTOR抑制主要通過增加降解過程來減少ATF4 mRNA的表達豐度并影響其穩定性;而在翻譯水平上,mTOR則通過上游開放閱讀框(upstream open reading frame,uORF)依賴的方式控制ATF4的翻譯,且該過程不依賴eIF2α的磷酸化[32]。4E-BP1同樣介導了mTOR調控的ATF4翻譯抑制[54]。此外,Chen等[52]發現Glu缺乏影響一般AA控制途徑,從而促進ATF4表達上調,但補充Glu后通過SLC7α5阻斷ATF4表達上調。Luo等[45]研究發現,在AA補充的CMECs中,mTORC1與酪蛋白合成的相關蛋白質表達增加,但ATF4誘導的SESN2及SH3BP4相關蛋白質表達下降。Leu剝奪抑制了MEFs中mTORC1的活性,但ATF4的缺乏消除了該種抑制作用,提示ATF4可直接或通過mTORC1間接感知AA的供給變化[42]。以上結果表明,“AA供給-mTORC1激活-ATF4靶基因-蛋白質翻譯”是低蛋白質飼糧下補飼AA調控乳蛋白合成的一條重要途徑,由于ATF4與mTORC1互作為近年提出,目前相關模型大多為醫學模型,在反芻動物上應用較少,但因其在平衡AA供給和乳蛋白合成方面的重要作用,因此關鍵AA的篩選及其差異作用機制還需進一步研究。

5 小 結

低蛋白質飼糧添加AA技術包含蛋白質減少和AA補充2方面。ATF4蛋白質可介導AA缺乏對mTORC1的抑制作用,進而降低乳蛋白的合成;反之,AA補充可激活mTORC1磷酸化,并通過調控ATF4相關靶基因的表達影響乳蛋白合成,提示ATF4與mTORC1互作在平衡AA供給與乳蛋白合成時發揮重要作用。然而,不同單一AA及多種AA配比組合對ATF4-mTORC1互作的差異化影響還需進一步研究,相關結果可為生產中低蛋白質飼糧的配制提供重要理論依據。