冷應激下褐色脂肪細胞線粒體生物發生研究進展

張學凱 姜 敏 邢仲耘 金 曉

(內蒙古農業大學動物科學學院,呼和浩特 010018)

長時間暴露在低于最低適溫區且無法維持自身體溫恒定的冷環境中動物會遭受冷應激。冷應激下動物對能量的攝入從原來的維持生產為主轉變為維持體溫為主,使其生長減慢,對動物的免疫功能造成一定程度的抑制,使免疫功能下降、發病率增加[1]。Young[2]研究表明,長期處于寒冷環境下的動物內環境穩態會發生改變,同時也會增加體增熱,降低動物生產性能及飼料利用率,嚴重制約畜牧業發展。因此,增加產熱維持機體穩態對動物克服冷應激至關重要。

線粒體生物發生是指通過增加線粒體內酶的表達及活性,形成新的線粒體的復雜過程,該過程涉及到線粒體內各種活性物質的合成與轉運、蛋白質與脂質的結合及線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的復制等[3]。褐色脂肪細胞(brown adipocytes,BA)中線粒體的質量和數量是保證冷應激下非顫栗性產熱(non-shivering thermogenesis,NST)的基礎,BA產熱量約占NST總量的70%,因此BA主要負責機體NST[4]。

BA產熱過程受解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、PR結構域蛋白16(PR domain containing 16,PRDM16)等蛋白的調控[5]。研究表明,冷應激下BA可以通過AMPK信號通路誘導線粒體生物發生,增加線粒體數量,從而增加產熱量,維持機體體溫恒定,使動物可以抵抗嚴寒[6]?；贏MPK信號通路在BA產熱過程中調控線粒體生物發生,本文就冷應激下BA線粒體生物發生研究進展及其機理進行了總結。

1 褐色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)

脂肪是機體良好的儲能物質,其主要功能是為動物機體提供熱能、保護內臟、寒冷刺激下維持體溫和參與機體各方面的代謝活動等[7]。動物體內存在白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)和BAT,其中WAT為常見的脂肪,廣泛分布于皮下組織和內臟周圍,是將多余的能量以脂粒形式儲藏起來的能量倉庫,同時還可以作為內分泌器官,調節機體能量代謝,維持機體穩態[8];BAT主要分布于肩胛骨間,呈棕色蝴蝶狀;部分分布于頸背部、縱隔及腎臟周圍,大多存在于新生兒和幼小哺乳動物體內,近期研究表明成年人椎骨和鎖骨附近也存在少量功能性BAT[9]。BAT由BA組成,其細胞體積小,細胞表面密布交感神經纖維和毛細血管,細胞內富含線粒體和細胞色素[10-11]。線粒體通過呼吸作用將糖類等有機物轉化為丙酮酸,再分解為乳酸并釋放能量;還通過氧化磷酸化過程將二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)和無機磷轉化為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)[12]。所以,BA線粒體生物發生可為機體在冷應激下提供熱量,有助于維持冬眠動物、嚙齒動物和新生哺乳動物的體溫。

2 冷應激下BA產熱的作用

產熱是冷應激下哺乳動物產生的適應性反應,是維持生命體征穩定性的關鍵[13]。線粒體是細胞內負責產生能量的細胞器,也是產生熱量的主要場所。在冷應激下,幼小哺乳動物BA需要產生更多熱量來維持身體的體溫平衡。具體來說,BA線粒體生物發生可以增加細胞內線粒體數量和線粒體呼吸鏈的活性,從而提高細胞代謝速率和熱量產生能力[14]。此外,冷應激可通過調控BA產熱相關蛋白UCP1的表達和機體能量代謝活性來促進體內產熱[15]。

2.1 交感神經系統產熱

冷應激可通過激活交感神經系統,提高BA線粒體生物發生,增加BA產熱[16]。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)和腎上腺素(epinephrine,E)是交感神經的主要遞質,當接收到冷應激信號時,交感神經末梢釋放NE激活BA是產熱增加的生理基礎[17]。NE和E能誘導β3-腎上腺素能受體(β3-adrenergic receptors,β3-AR)被激活,使脂肪分解為甘油和脂肪酸,進入線粒體進行產熱;并且β3-AR的激活使一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/ATP比值增加,進而改變細胞內第二信使分子環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的濃度,通過激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)進一步激活UCP1上游過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferators activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α),PGC-1α通過上調線粒體中UCP1 mRNA的表達而發揮轉錄活性,因此BA產熱增加[18-19]。NE在冷應激下不僅分解脂肪調控產熱,還緩慢引起BA的增殖與分化,促進線粒體生物發生[20]。但是交感神經系統僅控制各種生理過程自上而下調節的產熱,僅允許對極端寒冷的短暫耐受,不足以作為長期冷應激下機體的熱量來源[21]。

2.2 脂肪酸氧化產熱

長期冷應激下線粒體脂肪酸氧化也在能量代謝中起重要作用。脂肪酸是機體在饑餓或長期應激等狀態下通過線粒體內的β-氧化為機體提供能量的主要來源[22]。在生理條件下,骨骼肌線粒體的脂肪酸β-氧化是體內產生ATP的主要途徑[23]。在哺乳動物細胞中線粒體和過氧化物酶體這2種細胞器具有降解脂肪酸鏈的能力,促使脂肪酸氧化;同時,過氧化物酶體β-氧化途徑參與細胞產熱[24]。除了在脂質代謝中的調節作用外,過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators activated receptor α,PPARα)還能通過對其上游因子PGC-1α的激活,以相互依賴的方式調節脂肪酸氧化,激活線粒體內UCP1的NST,維持長期冷應激下能量平衡[25]。PPARα的激活能夠降低甘油三酯水平并參與能量穩態的調節。雌激素相關受體α(estrogen related receptor α,ERRα)也參與脂肪酸氧化,激活線粒體內UCP1的NST,并在各種組織中表達,參與能量代謝調節[26]。ERRα不僅是PGC-1α的下游靶點,而且還被該轉錄因子共激活。PGC-1α誘導增加ERRα表達可以控制線粒體生物發生、脂肪酸氧化和氧化呼吸[26]。長期冷應激下雌激素相關受體(estrogen related receptor,ERR)能夠通過直接行動來為產熱提供能量維持體溫[27]。而缺乏ERR的小鼠在長時間暴露于寒冷環境下無法維持體溫,證明了ERR對適應寒冷環境至關重要[28]。因此,長期冷應激下動物可以通過線粒體脂肪酸氧化激活UCP1的NST維持機體穩態。

2.3 UCP1產熱

UCP1又名增溫素[19],是一種重要的線粒體內膜蛋白,在BA產熱過程中起著重要作用,其主要功能為熱量調節和能量代謝。UCP1作為BAT主要的產熱因子,具有轉運脂肪酸陰離子和催化質子沿濃度梯度向下轉運的功能,使BA出現依賴UCP1而不依賴ATP的產熱[29]。UCP1調節BA線粒體生物發生、線粒體動力學穩態和線粒體自噬,而三者的動態平衡有助于維持線粒體正常功能[30]。UCP1負責BA的NST,在被長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid,LCFA)激活后,UCP1增加線粒體內膜(inner mitochondrial membrane,IMM)的熱傳導[31]。已有研究證明UCP1基因敲除的小鼠NST幾乎消失,對寒冷敏感,不能維持體溫[32];并且冷應激下交感神經系統產熱和脂肪酸氧化產熱等都可激活UCP1的NST,維持體溫恒定。因此,UCP1在NST中起著關鍵作用,UCP1對BAT產熱功能的重要性已被廣泛應用[33]。此外,UCP1也可以通過AMPK信號通路促進線粒體生物發生,調節BA內脂質過氧化及能量代謝穩態。UCP1既可以促進BA線粒體生物發生,還可以維持BA線粒體穩態。BA線粒體生物發生的關鍵轉錄調節因子如PGC-1α、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)等都可激活UCP1,促進BA線粒體生物發生和產熱;而這些激活因子被敲除后,UCP1表達水平下降,抑制線粒體生物發生并減少線粒體數量[34]。因此,BA線粒體的含量與其產熱活性成正比,BA線粒體生物發生通過調控線粒體數量和質量來增加動物機體產熱[35]。

3 AMPK信號通路誘導BA線粒體生物發生機理

線粒體數量依賴于線粒體生物發生。線粒體生物發生是將組成線粒體的脂質、蛋白和mtDNA等物質不斷融匯到已有的線粒體中,使線粒體物質增加,再通過線粒體分裂,實現數量上的增長[14]。線粒體生物發生過程還受一些蛋白的調控,其中PGC-1α、NRF1和線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)是BA的細胞核表達與線粒體生物發生有關的主要因子[36],共同參與誘導線粒體生物發生過程的信號通路。線粒體生物發生過程由多條信號通路誘導,而AMPK信號通路是目前線粒體生物發生過程中研究最深入、最廣泛的通路之一[37]。

3.1 AMPK

AMPK是一種維持細胞能量穩態的能量傳感器,通過激活PGC-1α調控多種生物過程,包括線粒體生物發生和氧化功能[38]。如圖1所示,冷應激下交感神經元釋放NE和E,激活BA質膜上的β3-AR,導致脂肪分解為甘油和脂肪酸;同時,β3-AR也提高了AMP/ATP比值,從而激活AMPK[39]。被激活的AMPK通過上調下游蛋白PGC-1α的表達,進而完成AMPK信號通路BA線粒體生物發生。而抑制AMPK已被證明對線粒體生物發生有一定的抑制作用[40]。Barbatelli等[41]研究表明,冷應激下β3-AR敲除的小鼠AMPK無法被激活,導致BA線粒體生物發生功能受到抑制。此外,AMPK不僅是線粒體功能的重要調節劑,還參與調節線粒體穩態[42]。

NE:去甲腎上腺素 norepinephrine;E:腎上腺素 epinephrine;β3-AR:β3-腎上腺素能受體 β3-adrenergic receptors;AMP:一磷酸腺苷 adenosine monophosphate;ATP:三磷酸腺苷 adenosine triphosphate;cAMP:環磷酸腺苷 cyclic adenosine monophosphate;AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase;PGC-1α:過氧化物酶體增殖物受體γ輔激活因子-1α peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α;UCP1:解偶聯蛋白1 uncoupling protein 1;PKA:蛋白激酶A protein kinase A;PPAR:過氧化物酶體增殖物激活受體α peroxisome proliferators-activated receptor α;NRF1:核呼吸因子1 nuclear respiratory factor1;ERRα:雌激素相關受體α estrogen related receptor α;mtDNA:線粒體DNA mitochondrial DNA;TFAM:線粒體轉錄因子A mitochondrial transcription factor A。

3.2 主要激活因子PGC-1α

PGC-1α是一種被冷應激快速和高度誘導的核受體轉錄輔助活化因子,AMPK被激活后會增加細胞內AMP/ATP比值,并最終催化PGC-1α的脫乙?；痆43-45]。另外,PGC-1α的活性已被證明是AMPK介導線粒體活化所必需的,AMPK可直接促進PGC-1α磷酸化,是其信號通路中的關鍵環節,并激活下游因子誘導線粒體DNA復制,促進線粒體生物發生(圖1)[39]。有研究表明,轉錄因子PGC-1α通過上調UCP1 mRNA的表達,調節BA產熱能力及能量代謝穩態[46],從而促進線粒體生物發生。PGC-1α還在理解控制線粒體生物發生的轉錄因子共同調控機制中扮演著重要角色[44]。牟彩瑩等[47]研究發現,敲除小鼠的PGC-1α基因抑制了線粒體生物發生相關蛋白表達。此外,BA適應性產熱中的線粒體增殖和呼吸活動也由轉錄共激活劑PGC-1α介導[48]。

3.3 NRF1-TFAM調控AMPK信號通路線粒體DNA復制

PGC-1α還可以通過誘導解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)和調節核呼吸因子(nuclear respiratory factor,NRF)來刺激BA線粒體生物發生[49-50]。細胞質中被激活的PGC-1α與PPAR、ERR和NRF1/2等轉錄因子通過核孔進入細胞核后相互作用和共激活,并在核內發揮作用。在細胞核里PGC-1α與下游轉錄因子NRF1結合并輔激活,參與線粒體呼吸基因的調節,反之NRF1顯性失活也可以阻斷PGC-1α發揮作用[51]。TFAM作為NRF1的下游基因含有其結合位點,被激活的TFAM可以直接調控mtDNA的復制轉錄,在核基因組中進行編碼[52-53],促使線粒體分裂,增加線粒體數量,從而增加產熱量(圖1)。Piantadosi等[54]對小鼠的試驗研究表明,BA線粒體中TFAM的損傷或NRF1的沉默都使mtDNA拷貝數下降,影響mtDNA的復制轉錄。當然TFAM被敲除后也會導致mtDNA復制顯著減少,導致線粒體生成量降低[55]。

綜上所述,冷應激下AMPK信號通路誘導BA線粒體生物發生過程受AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM的共同調控,誘導BA線粒體數量增加,增加產熱量,可為幼齡動物在寒冷環境下抵御冷應激。

4 BA線粒體自噬維持線粒體功能穩態

4.1 線粒體自噬

線粒體作為細胞的“發電站”,在細胞中起著舉足輕重的作用。BA中損傷的線粒體需要及時準確地進行清除,以保證線粒體功能正常運行[56]。線粒體生物發生、線粒體的融合和分裂、線粒體自噬對線粒體數量和質量的動態平衡發揮著重要作用[57-58]。線粒體自噬指受損傷的線粒體被特異性的包裹進自噬體中并與溶酶體融合,從而完成線粒體的降解,維持細胞內環境穩定的過程[59]。近幾年的研究表明,線粒體自噬是一個特異性的選擇過程,受到多種因素的影響,通過消除功能失調的線粒體和減少線粒體數量維持細胞內穩態[60]。

4.2 線粒體質量和數量維持線粒體功能穩態

線粒體含量是維持能量代謝,以響應細胞代謝狀態、應激和其他細胞內外環境信號的關鍵[3]。線粒體生物發生和線粒體自噬是2種相反的細胞途徑,共同協調線粒體的數量和質量,確保線粒體正常功能[61]。長期冷應激下,小鼠為維持體溫恒定,體內的BA過量產熱會引起氧化應激,導致蛋白、核酸和脂質的直接或間接損傷[62]。尹圓圓[63]研究表明,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的增加會破壞線粒體呼吸鏈,線粒體膜電位和ATP水平因通透性轉換孔開放而下降,使線粒體功能出現障礙,最終導致細胞死亡。為了防止氧化損傷的累積,BA利用線粒體自噬來移除和回收受損的線粒體,從而有效調控BA內線粒體數量和質量。冷應激下BA通過調節磷酸酯酶與張力蛋白同源物誘導的激酶1(phosphatase and tensin homolog induced putative kinase 1,PINK1)-帕金蛋白(parkin protein,Parkin)信號通路介導線粒體選擇性自噬,消除伴隨產熱生成的ROS及損傷和無用的線粒體[64],從而緩解BA氧化損傷,維持線粒體動能穩態。除此之外,冷應激下BA產熱也會受細胞內線粒體的數量和質量的影響[65]。Kim等[66]研究發現,改善小鼠的線粒體質量和數量可以增強脂肪細胞適應性產熱。有報道稱線粒體數量和分布情況與供能活動有關,因為肌肉細胞比脂肪細胞需要能量多,所以肌肉細胞中線粒體數目多于脂肪細胞中線粒體數目;還使得肌肉細胞比脂肪細胞產熱能力強[67]。

4.3 AMPK雙向反應過程調節線粒體質量和數量穩態

Laker等[68]研究表明,AMPK不僅調控線粒體生物發生,也直接調控線粒體自噬。糖尿病藥物卡格列凈(canagliflozin,Cana)通過AMPK-PGC-1α信號通路促進線粒體生物發生,增強線粒體氧化磷酸化、脂肪酸氧化和產熱,并通過線粒體自噬清除受損傷線粒體[38]。如圖2所示,BA中的AMPK響應于冷應激并被激活,AMPK磷酸化并激活Unc-51樣自噬活化激酶-1/2(Unc-51 like autophagy activating kinase-1/2,ULK-1/2),促進線粒體自噬,清除損傷的線粒體[61]。Egan等[69]通過對哺乳動物細胞的研究表明,AMPK或ULK1的損失導致線粒體自噬缺陷。楊春麗等[70]研究表明,AMPK可以負調控下游因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)?；罨腁MPK可以抑制mTOR以減少其在絲氨酸(serine,Ser)757上ULK-1的磷酸化,導致ULK-1-AMPK相互作用,最終誘導線粒體自噬[71]。因此,AMPK可以啟動促進線粒體更新的雙向反應[72],自噬的同時并通過激活PGC-1α-NRF1-TFAM觸發線粒體生物發生,通過此過程維持BA內線粒體數量平衡保證其質量,發揮線粒體功能,增加產熱量,調節機體穩態。

NE:去甲腎上腺素 norepinephrine;E:腎上腺素 epinephrine;β3-AR:β3-腎上腺素能受體 β3-adrenergic receptors;AMP:一磷酸腺苷 adenosine monophosphate;ATP:三磷酸腺苷 adenosine triphosphate;AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase;PGC-1α:過氧化物酶體增殖物受體γ輔激活因子-1α peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α;mTOR:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin;ULK-1/2:Unc-51樣自噬活化激酶1/2 Unc-51 like autophagy activating kinase-1/2;NRF1:核呼吸因子1 nuclear respiratory factor1;TFAM:線粒體轉錄因子A mitochondrial transcription factor A。

5 小 結

冷應激下BA線粒體生物發生產熱對哺乳動物維持體溫、抵御寒冷至關重要。在長期或超強冷應激下,幼齡動物細胞中UCP1可介導BAT過量產熱,從而造成氧化損傷,受損傷線粒體可激活線粒體自噬過程維持BA內線粒體質量。同時冷應激可以激活AMPK信號通路誘導BA線粒體生物發生,發揮線粒體機能,增加BA產熱,維持體溫恒定。然而,目前對于冷應激下BA線粒體生物發生的研究還局限在細胞及大鼠和小鼠等模型動物層面上,關于在幼齡家畜方面的研究極少。對于幼齡家畜研究較少的原因較小鼠相比一方面在于其繁殖周期過長、能量來源不同,此研究又受到環境因素控制,飼養采樣較為困難;另一方面在于其褐色脂肪并不發達,主要通過體毛和運動在寒冷環境下維持體溫,而且測量褐色脂肪含量的技術應用比較復雜。

因此,借鑒小鼠BA產熱的有效蛋白和分子機制的認識,通過增加繁殖效率和環境溫度控制進一步研究幼齡家畜在冷應激下通過AMPK信號通路激活BA線粒體生物發生過程,對增加產熱抗寒機制、保護機體免受冷應激損傷、降低死亡率和突破技術屏障是非常有必要的,可為提高北方地區冬季寒冷環境下肉用家畜的增重速度和產肉量提供理論基礎。