不同硒源對西方蜜蜂蜂王抗氧化、免疫指標及抗氧化、繁殖相關基因表達的影響

史文凱 郭冬生 李 震 黎力之 張海波 關瑋琨 鄒垂彬

(1.宜春學院生命科學與資源環境學院,江西省高等學校硒農業工程技術研究中心,宜春 336000;2.江西農業大學蜜蜂研究所,南昌 330001;3.撫州市農業農村局,撫州 344000)

蜜蜂是重要的授粉昆蟲,其不僅可以為人類提供蜂蜜等蜂產品,還可以通過自身采集行為來為農作物授粉[1-2]。蜂王作為蜂群的重要組成部分,在蜂群中發揮著不可或缺的作用,它決定了蜂群的繁衍和生長,擁有高質量的蜂王是培養蜜蜂強群的必然需求。在生產實踐中,普通蜂王一般在1年后產卵能力下降,此時需要更換蜂王來維持強群,而如何培育擁有產卵能力強、產卵高峰期長的蜂王,便成為了重中之重。

提高蜂王質量的一種策略是提供必要的營養物質和礦物質[3]。硒作為機體生長發育必不可少的微量元素,具有提高機體抗氧化能力、調節免疫和內分泌等生物學功能[4-6]。研究報道,補充硒可以顯著提高西方蜜蜂工蜂壽命,并增強幼蟲抗氧化能力和免疫能力[7]。在一定濃度下,硒有利于蠶的生長發育并提高其生產性能[8]。此外,研究表明,硒缺乏癥會導致果蠅生存率和繁殖力下降,而補充硒則可修復使其正?；痆9]。這些研究表明,硒不但具有提高昆蟲免疫能力和抗氧化能力的作用,還可增強成蟲繁殖能力。

亞硒酸鈉(sodium selenite,SSe)由于價格低廉、容易獲取,成為了動物飼糧中最為常見和傳統的補硒添加劑[10]。然而,亞硒酸鈉存在毒性高、生物利用度差、易在環境中遷移等缺陷,同時在動物生產過程中極易引發環境污染等問題[11-12]。而納米硒(nano-selenium,nano-Se)因具有表面活性高、催化效率高、比表面積大、吸附能力強、毒性低等特點,而受到廣泛關注[13-14]。目前,在單胃動物、反芻動物及水產動物的研究中,已發現不同硒源具有增強抗氧化能力、繁殖能力、生長速度等作用[15-17],但鮮見不同硒源對西方蜜蜂的研究,而將不同硒源用于優質人工培育方面的研究則未見報道。西方蜜蜂具有群勢強、采集力旺盛、可產蜂膠和蜂王漿等特點而被廣泛飼養[18-19]。因此,本研究旨在探討飼糧中添加不同硒源對西方蜜蜂蜂王抗氧化能力、免疫能力和繁殖能力的影響,以確定硒對蜂王生長發育的促進作用,以期未來采用飼喂哺育蜂群富硒飼料的方式提高蜂王漿硒含量,為人工營養干預提高西方蜜蜂蜂王質量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗無機硒選用亞硒酸鈉(化學純,純度≥99.5%,西隴化工股份有限公司)作為硒源;納米硒則在亞硒酸鈉的基礎上,參照Zhang等[20]的方法,使用石墨烯和碳粉進行合成,分別記為納米石墨硒(GSSe)和納米碳粉硒(TSSe)。

1.2 試驗儀器

主要試驗儀器包括移液器(Eppendorf,德國)、電子分析天平(Mettler Toledo,瑞士)和ABI定量PCR儀(QuantStudio Q5,美國)。

1.3 試驗蜂群

試驗所用西方蜜蜂蜂群均來自于江西省宜春市萬載縣多多蜜蜂園。隨機選取2群強群,其中一群作為產卵群,產卵蜂王為自然交尾蜂王,提供育王的卵源;另一群作為哺育群,為繼箱飼養。試驗蜂群飼養在標準朗氏蜂箱中,飼養管理方法參照《養蜂學》[21],蜂群無螨害和病害,均為強群,蜜粉及子脾充足,均為10脾蜂群,且試驗進行時為大流蜜期。試驗期間主要蜜源植物為紫云英。

1.4 試驗設計

使用隔王柵控制蜂王在巢脾一側進行隔王產卵,8 h后將帶卵巢脾置入無王繼箱進行孵化,72 h后獲得幼蟲。按照《養蜂學》[21]中人工育王法進行培育蜂王,在蜂群中插入兩框育王框,每個育王框上有3根育王條,每個育王條上約20個人工蠟臺,共移蟲120只。將120只蜂王隨機分為4組,分別為亞硒酸鈉組(SSe組)、納米石墨硒組(GSSe組)、納米碳粉硒組(TSSe組)和對照組(CON組)。參考蘇中渠等[22]的研究結果,試驗中硒溶液濃度設定為3.2 mg/L。自移蟲之后第2天,使用微量進樣器(5 μL,上海高鴿工貿有限公司)在SSe組王臺中幼蟲頭部每日滴加5 μL的3.2 mg/L亞硒酸鈉溶液,在GSSe組王臺中幼蟲頭部每日滴加5 μL的3.2 mg/L納米石墨硒溶液,在TSSe組王臺中幼蟲頭部每日添加5 μL的3.2 mg/L納米碳粉硒溶液,在CON組王臺中幼蟲頭部每日滴加5 μL的雙蒸水,連續添加3 d。在人工移蟲之后,除添加蒸餾水或對應的硒溶液外,王臺中蜂王幼蟲均由工蜂自行哺育。在蜂王出房的前1 d,取出育王框,加上王臺保護罩,放入恒溫恒濕箱[34 ℃,相對濕度(75±5)%],等待蜂王羽化。

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 蜂王化蛹率、出房率和蜂王基礎形態指標的測定

在蜂王出房的前1 d,將育王框提至恒溫恒濕箱中,溫度34.5 ℃,相對濕度75%。在恒溫箱中,每30 min觀察1次,防止蜂王出房后因進食或者水分喪失而出現體重等變化。蜂王出房后對蜂王初生重、胸重進行稱量;使用電子游標卡尺對蜂王體長、翅長、胸長、胸寬進行測量,計算王臺化蛹率(成功化蛹數/移蟲王臺數)和蜂王出房率(出房數/封蓋王臺數)。

1.5.2 蜂王抗氧化和免疫指標的測定

每組隨機選取6只蜂王,加入其質量9倍的生理鹽水進行研磨,待充分研碎之后進行低溫離心,10 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液待測。整個過程在冰水浴中進行。使用上海酶聯生物科技有限公司的試劑盒測定蜂王總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)。

1.5.3 蜂王卵巢抗氧化和繁殖相關基因表達的測定

取出蜂王卵巢,采用試劑盒提取總RNA后,使用反轉錄試劑盒將RNA進行反轉錄為cDNA。實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)擴增系統包括5 μL SYBR?Premix ExTaqTMⅡ,0.2 μL ROX,0.4 μL正向引物(10 μmol/L),0.4 μL反向引物(10 μmol/L),3 μL無核酸酶水,1 μL稀釋的模板cDNA(400 ng/μL)。循環條件:95 ℃ 45 s,60 ℃ 1 min,然后50 ℃加熱到90 ℃的40個循環(每6 s增加1 ℃)。

使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參基因,采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。引物設計及合成均由上海生物工程有限公司進行,引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.6 數據統計與分析

使用SPSS 26.0統計軟件對數據進行分析,試驗結果進行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間采用LSD法進行多重比較,數據以平均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同硒源對蜂王化蛹率、出房率和基礎形態指標的影響

由圖1可見,各組之間蜂王體重、翅長、體長、胸長和胸寬無顯著差異(P>0.05)。TSSe組的胸重顯著高于SSe組(P<0.05),但與GSSe組和CON組無顯著差異(P>0.05)。GSSe組和TSSe組的化蛹率顯著高于CON組(P<0.05)。SSe組、GSSe組和CON組之間出房率無顯著差異(P>0.05),但均顯著高于TSSe組(P<0.05)。

數據柱標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 不同硒源對蜂王抗氧化和免疫指標的影響

由圖2可見,SSe組的蜂王T-SOD和GSH-Px活性顯著高于其余3組(P<0.05),且其余各3組之間無顯著差異(P>0.05)。各組之間蜂王iNOS活性和MDA含量無顯著差異(P>0.05)。SSe組和GSSe組的蜂王PO活性顯著高于CON組(P<0.05),但與TSSe組無顯著差異(P>0.05)。TSSe組的蜂王T-AOC顯著高于其余3組(P<0.05),且其余3組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同硒源對蜂王抗氧化和免疫指標的影響

2.3 不同硒源對蜂王卵巢抗氧化相關基因表達影響

由圖3可見,SSe組、GSSe組和TSSe組的蜂王卵巢UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶2A3、UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶2B18和全反式視黃醇脫氫酶基因相對表達量均顯著高于CON組(P<0.05)。各組之間蜂王卵巢UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶1-3基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同硒源對蜂王卵巢抗氧化相關基因表達影響

2.4 不同硒源對蜂王卵巢繁殖相關基因表達的影響

由圖4可見,SSe組的蜂王卵巢苯丙氨酸-4氫化酶基因相對表達量顯著高于CON組(P<0.05),但GSSe組和TSSe組與CON組無顯著差異(P>0.05)。TSSe組的蜂王卵巢法尼基二磷酸磷酸酶基因相對表達量顯著高于CON組(P<0.05),但SSe組和GSSe組與CON組無顯著差異(P>0.05)。SSe組、TSSe組和GSSe組的蜂王卵巢法尼蘇酸甲酯環氧化物酶基因相對表達量均顯著高于CON組(P<0.05),且3組之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 不同硒源對蜂王卵巢繁殖相關基因表達的影響

3 討 論

3.1 不同硒源對蜂王抗氧化和免疫指標的影響

目前,相對于硒在其他動物上的研究,硒對蜜蜂作用的研究甚少,但對于硒毒性已有相關研究。研究發現,當飼糧中亞硒酸鹽濃度達到1.0 mg/L時,硒易對蜜蜂造成脅迫作用,使幼蟲受到巨大損傷[23]。而本試驗中滴加5 μL的3.2 mg/L硒溶液后,王漿中亞硒酸鹽絕對濃度為2.56×10-4～3.20×10-4mg/L,遠低于亞硒酸鹽對蜜蜂的脅迫閾值。目前硒添加劑在哺乳動物及水產動物上大量應用,但硒添加劑對改善蜂王氧化應激及免疫能力的作用卻鮮有報道。

氧化應激指的是動物在氧化應激狀態下,機體產生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)而無法及時清除,造成機體損傷、生產性能下降、器官功能受損及出現炎癥等現象[24]。其本質是機體ROS的產出與抗氧化防御系統能力之間的不平衡所導致[25]。而硒可以有效清除ROS,提升機體抗氧化能力,減少氧化應激所帶來的機體損傷[26]。Meng等[27]研究表明,用0.3 mg/kg不同硒源飼喂蛋雞35 d之后,與對照組相比,亞硒酸鈉組和納米硒組可顯著提升血清GSH-Px活性。Chen等[28]研究表明,在肉雞飼糧中添加2.0 mg/kg硒飼喂21 d后,與對照組相比,試驗組血清T-AOC顯著提升,但是血清MDA含量和GSH-Px活性與對照組相比無顯著差異。這與本試驗結果基本一致,證實了飼糧中添加3.2 mg/kg不同硒源可不同程度地提升西方蜜蜂蜂王抗氧化能力。此外,PO是昆蟲體內重要的酶,其參與調控昆蟲體內一系列生理過程,包括免疫防御、傷口愈合、昆蟲表皮黑化等[29]。蘇中渠等[22]研究表明,飼喂西方蜜蜂幼蟲飼糧硒水平為0.4 mg/kg的亞硒酸鈉7 d后,PO活性顯著高于對照組。本試驗中,SSe組和TSSe組的蜂王PO活性顯著高于CON組,證實了不同硒源可能在提升機體免疫能力方面具有一定的調控作用。

3.2 不同硒源對蜂王卵巢抗氧化相關基因表達的影響

在感光細胞中,全反式視黃醛可通過白細胞介素-1β(IL-1β)影響c-Jun N端激酶和p38信號通路,誘導視網膜色素上皮細胞死亡,還可通過促進小膠質細胞或巨噬細胞表達促炎因子IL-1β,形成慢性促炎性微環境,致使視網膜上皮細胞產生大量活性氧,進而誘導細胞損傷或凋亡[30-31]。而全反式視黃醇脫氫酶可以消除全反式視黃醛的毒性作用,將全反式視黃醛還原為全反式視黃醇,保證視循環代謝的正常運行[32]。本試驗中,SSe組、GSSe組和TSSe組的蜂王卵巢全反式視黃醇脫氫酶基因相對表達量顯著高于CON組,證實不同硒源可以減少蜂王氧化應激,調控機體細胞凋亡。研究表明,維生素C作為蜜蜂體內最主要的抗氧化因子,其可以有效減少蜜蜂死亡率,還可刺激蜜蜂采食,促進幼蟲及成蜂腺體發育[33-34]。而UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶可以催化D-尿苷二磷酸葡萄糖生成維生素C的前體物質D-葡萄糖醛酸,提高機體抗氧化能力[35]。此外,UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶還是相當重要的藥物代謝酶,其分布于藥物代謝-細胞色素P450代謝通路,可加速自生有毒代謝產物及外來毒物的排泄,UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶基因相對表達量的高低,代表了機體解毒能力的強弱[36-37]。綜上所述,不同硒源具有提升機體抗氧化能力的作用。

3.3 不同硒源對蜂王卵巢繁殖相關基因表達的影響

保幼激素是蜜蜂生長發育極為重要的一種激素,對蜜蜂的生長發育、級型分化等具有重要的影響。在幼蟲期,保幼激素保證著昆蟲蛻皮和化蛹有序進行;在成蟲期,保幼激素可以促進昆蟲卵黃原蛋白的合成,促進卵巢發育成熟[38-39]。同時,在真社會化昆蟲蜜蜂中,保幼激素決定了蜜蜂的分工,從幼蜂到采集蜂,保幼激素滴度隨蜜蜂年齡的增長而提高[40]。此外,保幼激素也與卵子的產生有關,其中高濃度的保幼激素與卵子的高產量相關,低濃度的保幼激素伴隨著卵子的低產量[41],因此,保幼激素的高低決定蜂王產卵量。研究發現,保幼激素來源于昆蟲甲羥戊酸途徑,由法尼基二磷酸鹽合成[42]。本試驗中,SSe組、GSSe組和TSSe組的蜂王卵巢法尼蘇酸甲酯環氧化物酶和法尼基二磷酸磷酸酶基因相對表達量均高于CON組,證實了不同硒源可促進蜂王繁殖能力。此外,研究表明,在蜂王培育過程中飼糧中添加0.04%的葉酸有助于雌性蜜蜂幼蟲向蜂王方向發育,且在育王時添加額外葉酸可提高初生蜂王初生重及繁殖相關基因的表達[43-44]。本試驗中,SSe組、GSSe組和TSSe組的蜂王卵巢四氫葉酸的前體物質——苯丙氨酸-4-羥化酶基因相對表達量均高于CON組,證實了不同硒源可對蜂王發育及繁殖能力具有一定促進作用。

4 結 論

在西方蜜蜂王臺中添加3.2 mg/L不同硒源溶液,對蜂王基礎形態指標無顯著影響,但可提高出生蜂王機體抗氧化能力和免疫能力,同時上調蜂王卵巢抗氧化和繁殖相關基因的表達,說明不同硒源對蜂王抗氧化能力和繁殖能力具有一定的影響。