豆蔻明通過激活芳香烴受體/核因子紅系2相關因子2/NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3信號通路減輕脂多糖誘導的豬小腸上皮細胞的氧化應激和炎癥反應

方 懿 張亞磊 符清瑤 鄧譚杰 吳小妹 荀文娟

(海南大學動物科技學院,?？?570228)

腹瀉是仔豬斷奶死亡的最常見原因之一,對養豬業有重大影響。仔豬腹瀉的發展通常伴隨著腸道炎癥和氧化應激,這反過來又導致腸上皮損傷。腸上皮細胞是哺乳動物營養物質消化吸收的重要組成部分,也是阻止病原微生物和毒素進入循環系統的重要屏障[1]。豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)是一種從新生仔豬分離出的空腸上皮細胞系,常用于研究免疫調節劑對腸道細胞免疫功能、細胞凋亡和屏障功能的影響[2]。革蘭氏陰性菌及其細胞膜釋放的脂多糖(lipopolaccharides,LPS)可引起上皮細胞氧化應激、炎癥和形態損傷,嚴重損害腸道屏障的完整性[3]。因此,維持腸上皮屏障完整性的治療可能有利于腸道和宿主健康,減少炎癥反應和氧化應激損傷。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)在屏障組織(腸、肺臟、皮膚)中高度表達[4]。AhR是一種重要的免疫調節劑,在感染和炎癥過程中對腸道穩態的調節起著關鍵作用,它在沒有配體的情況下與熱休克蛋白90(HSP90)等形成復合物存在于細胞質中,與外源性配體如豆蔻明(2′,4′-二羥基-6′-甲氧基查爾酮,CDN)結合,活化的AhR進入細胞核,并且與芳香烴受體核轉運蛋白(ARNT)結合為異二聚體轉錄因子,異源二聚體與DNA片段上的醌氧化還原酶1(NQO1)增強子異源響應元件(XRE)特異結合,從而誘導下游目的基因細胞色素P450 1A1(CYP1A1)大量表達[5]。而XRE同時也是炎性小體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)啟動子,與AhR結合后抑制NLRP3轉錄[6]。因此,AhR是一種重要的免疫調節劑,在感染和炎癥過程中對腸道穩態的調節起著關鍵作用。

除了這種典型的信號通路外,AhR還經常與核因子紅系2相關因子2(Nrf2)相互作用[7]。研究表明,AhR激活可調控Nrf2基因轉錄來調控Ⅱ相代謝酶如NQO1、血紅素氧合酶-1(HO-1)等基因表達,從而提高抗氧化防御,緩解氧化損傷[8]。

黃酮類化合物是植物來源的天然物質,對腸道屏障具有有益作用,人們長期以來一直在探索其作為斷奶仔豬替代抗生素的飼料添加劑的可行性[9]。CDN是一種被廣泛研究的黃酮類化合物,主要存在于草豆蔻的種子中,因顯示出相當大的抗炎、抗癌、抗氧化和血管松弛活性的功能,被廣泛用于治療消化系統相關疾病[10]。研究表明,CDN通過激活AhR和Nrf2信號通路發揮抗炎活性并抑制NLRP3炎性小體激活來發揮對小鼠抗結腸炎作用[11]。此外,研究發現,激活AhR可能是恢復緊密連接屏障功能的潛在途徑,并且AhR活化劑可能具有治療腸道疾病的潛力[12]。

然而,目前對于CDN通過調節AhR/Nrf2/NLRP3信號通路緩解LPS誘導的IPEC-J2細胞損傷的保護作用知之甚少。因此,本研究探討CDN對LPS誘導的IPEC-J2細胞氧化應激和炎癥反應及AhR/Nrf2/NLRP3信號通路的影響,旨在為CDN在動物生產中的營養調控研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 IPEC-J2細胞培養

IPEC-J2細胞系由海南大學動物營養實驗室提供。IPEC-J2細胞在補充有10%胎牛血清(Gibco)和青霉素-鏈霉素(Gibco)的DMEM/F12培養基(Gibco)中培養和維持。將復蘇的IPEC-J2細胞在37 ℃含5% CO2培養箱中培養24 h后進行首次換液,之后每48 h更換1次培養基。當它們達到80%匯合時,用胰酶(Gibco)分離細胞并在培養基中傳代培養。

1.2 LPS建立IPEC-J2細胞損傷模型

使用CCK-8細胞檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所)確定IPEC-J2細胞損傷模型。用胰酶處理對數期生長的IPEC-J2細胞以制備單細胞懸液,然后接種在96孔細胞培養板中。將細胞培養24 h后丟棄培養基,并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(博士德)洗滌孔,然后填充含有0、0.1、1.0、2.0、10.0 μg/mL LPS(Sigma)的空白培養基分別培養1、3、6、9 h。然后,向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液,孵育2 h后測定吸光度(OD)。CCK-8測定以每劑量6個重復孔進行,并重復3次以確認結果。

1.3 CDN建立IPEC-J2細胞修復模型

使用CCK-8細胞檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所)測定CDN的最佳濃度和時間。IPEC-J2細胞用含有0、1、3、10、30、60、100 μmol/L CDN(南京景竹生物科技有限公司)的培養基孵育2 h,后續操作同1.2。

為了估計CDN對IPEC-J2細胞的修復作用,將IPEC-J2細胞分為對照組(CON組)、CDN組、脂多糖組(LPS組)、LPS+CDN組(L+C組)。在CDN或LPS處理之前,每組同時用PBS洗滌2次。

1.4 細胞內活性氧(ROS)含量測定

使用ROS檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所)檢測處理過的IPEC-J2細胞內ROS含量。2′,7′-二氯氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)是檢測細胞內ROS含量最靈敏和最常用的探針。將IPEC-J2細胞均勻鋪于6孔板(每孔1×106個細胞),并接受CDN和LPS的處理。接下來,用PBS洗滌細胞2次后用胰酶消化、離心,留下細胞沉淀用于測定。PBS重懸后加入10 μL 20 μmol/L DCFH-DA處理20 min。DCFH-DA在細胞中存在ROS的情況下被氧化成強綠色熒光物質二氯熒光素(DCF),其最佳激發波長為488 nm,而發射波長為525 nm。其熒光強度與細胞中的ROS含量成正比。使用激光共聚焦監測熒光信號。

1.5 4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)染色觀察凋亡小體變化

IPEC-J2細胞在6孔板中經CDN和LPS處理后,用DAPI染色液(博士德)染色細胞核10 min。最后,用PBS洗滌細胞爬片3次,使用激光共聚焦監測熒光信號。

1.6 抗氧化指標和細胞因子含量測定

CDN和LPS處理細胞后,用PBS輕輕洗滌2次,并使用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)(博士德)的放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA裂解液)(博士德)在冰上裂解30 min。將細胞在4 ℃下以14 000×g離心10 min,取上清測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及總抗氧化能力(T-AOC),試驗操作均按試劑盒(南京南京建成生物工程研究所)說明書進行。收取細胞測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-1β(IL-1β)含量。根據制造商的指南,使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)測定。使用酶標儀測量每個孔的OD值。

1.7 目的基因mRNA相對表達量的測定

采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定AhR、CYP1A1、Nrf2、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)、NQO1、HO-1、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1(Caspase-1)的mRNA相對表達量。收集細胞后使用RNAiso Plus按照說明書步驟提取總RNA,隨后保存于-80 ℃冰箱。按照反轉錄試劑盒HiScript Ⅲ說明書要求進行反轉錄后,所得cDNA于-20 ℃保存。使用試劑盒進行RT-qPCR,內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)?；虻囊镄蛄幸姳?。反應程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,(40個循環);熔解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。目的基因mRNA相對表達量采用2-△△Ct法計算。

表1 引物序列

1.8 統計分析

所有數值均表示為平均值±標準誤。使用SPSS 21.0進行統計分析,采用one-way ANOVA進行單因素方差分析,差異顯著用Duncan氏法進行組間多重比較,P<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 LPS誘導的IPEC-J2細胞損傷模型建立

由圖1可知,與對照(CON)相比,LPS濃度在1.0～2.0 μg/mL,作用1～6 h均能顯著抑制細胞增殖(P<0.05),LPS濃度在1.0 μg/mL、作用時間6 h時細胞活力約60%,因此選擇該濃度、作用時間用于建立IPEC-J2細胞損傷模型。

數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 不同濃度CDN對LPS處理IPEC-J2細胞的保護作用

由圖2可知,與CON相比,隨著CDN的濃度增加(1～100 μmol/L),IPEC-J2細胞活力顯著回升(P<0.05),當CDN濃度為60 μmol/L時,IPEC-J2細胞活力與CON無顯著差異(P>0.05),表明本試驗選取的CDN濃度對IPEC-J2細胞是安全的,并且可以刺激IPEC-J2細胞的增殖。

CON:對照 control; LPS:脂多糖 lipopolysaccharide。

2.3 通過DAPI染色觀察細胞內凋亡小體的變化

由圖3可知,凋亡細胞其中一個形態學特征是染色質濃聚,且細胞核結構在凋亡后期崩解,因此觀察核形態是較為直接的指標。DAPI染色結果顯示,1 μg/mL LPS處理后,濃縮和破碎的細胞核較對照組顯著增多;細胞誘導的細胞核皺縮和凋亡小體。60 μmol/L CDN單獨處理細胞后,可以明顯抑制DAPI染色細胞的凋亡。

白色箭頭所示:濃縮和破碎的細胞核。

2.4 CDN對IPEC-J2細胞MDA含量的影響

由圖4可知,1 μg/mL LPS處理后,細胞內MDA含量較CON組顯著提高(P<0.05);60 μmol/L CDN單獨處理IPEC-J2細胞時,MDA含量顯著低于CON組(P<0.05);而CDN預處理可顯著降低LPS誘導的細胞MDA含量升高(P<0.05)。

圖4 CDN對IPEC-J2細胞中MDA含量的影響

2.5 CDN對IPEC-J2細胞ROS生成的影響

LPS處理細胞6 h后熒光顯微鏡觀察情況如圖5所示,與CON組相比,LPS組DCFH-DA探針檢測到IPEC-J2細胞的ROS生成量增多,CDN單獨處理或CDN與LPS處理后,顯著抑制IPEC-J2細胞誘導ROS生成,降低熒光強度,表明CDN單獨處理或CDN與LPS處理后對應激細胞均具有降低ROS生成的能力。

圖5 各組IPEC-J2細胞DCFH-DA熒光探針結果

2.6 CDN對IPEC-J2細胞的細胞因子含量的影響

由表2可知,與CON組相比,LPS組IL-10含量顯著降低(P<0.05),IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.05);與CON組相比,CDN組中IL-6、IL-10和TNF-α含量無顯著差異(P>0.05),IL-1β含量顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,L+C組中IL-10含量顯著升高(P<0.05),IL-1β含量顯著降低(P<0.05),IL-6及TNF-α含量有降低的趨勢(0.05

表2 CDN對IPEC-J2細胞中細胞因子含量的影響

2.7 CDN對IPEC-J2細胞抗氧化指標的影響

由表3可知,與CON組相比,LPS組GSH-Px活性、GSH含量和T-AOC顯著降低(P<0.05),CAT及SOD活性有降低的趨勢(0.050.05),GSH-Px活性顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,CDN與LPS處理后GSH含量以及GSH-Px、SOD和CAT活性與T-AOC均顯著升高(P<0.05)。

表3 CDN對IPEC-J2細胞中抗氧化指標的影響

2.8 CDN對LPS誘導的IPEC-J2細胞中AhR/Nrf2/NLRP3信號通路的影響

由圖6可知,與CON組相比,LPS組Nrf2、NQO1和CYP1A1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05),Keap1、NLRP3、ASC與Caspase-1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,L+C組中Nrf2、NQO1、HO-1及CYP1A1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05),Keap1、NLRP3、ASC與Caspase-1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。

Nrf2:核因子E2相關因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2;Keap1: Kelch樣ECH關聯蛋白1 recombinant Kelch like ECH associated protein 1;HO-1:血紅素氧合酶-1 heme oxygenase-1;NQO1:醌氧化還原酶1 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1;AhR:芳香烴受體 aryl hydrocarbon receptor;CYP1A1:細胞色素P450 1A1 cytochrome P450 family 1 subfamily a member 1;NLRP3:NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 nucleotide-binding oligomerization domain 3;ASC:凋亡相關斑點樣蛋白 apoptosis-associated speck-like protein;Caspase-1:半胱天冬酶-1 cysteinyl aspartate specific proteinase-1。

3 討 論

腸道屏障是抵御細菌和病毒感染的第1道防線。大量研究表明,生長性能與腸道屏障功能密切相關,完整的腸道屏障功能是決定動物健康和生長性能的關鍵因素[1]。過去常在飼糧中添加抗生素以預防腹瀉和改善仔豬的生長性能。然而,由于其具有耐藥性等負面影響,現已在被包括中國在內的許多國家所禁止[9]。因此,有效地篩選飼料添加劑、保護豬腸道屏障免受早期斷奶應激等不利因素造成的各種損害至關重要。

豆蔻素顯示出相當的抗炎、抗癌、抗氧化和血管松弛活性,主要分布于海南、廣東、廣西等熱帶地區[10]。先前的研究表明,15 μmol/L CDN通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核因子-κB(NF-κB)信號傳導誘導卵巢癌細胞中的G2/M期停滯和凋亡,發揮其作為卵巢癌天然治療劑的潛在用途[12]。與此同時,用43 μmol/L CDN處理經HCoV-OC43感染的MRC-10細胞后,也可以通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活發揮抗炎活性[13]。此外,CDN對NLRP3炎癥小體和炎癥性結腸炎的抑制也已進行了研究[14-15]。研究發現,30 μmol/L CDN的處理可通過活化AhR,上調Nrf2及其靶基因NQO1、HO-1等表達,抑制NLRP3炎性小體激活,進而抑制炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達,發揮其對小鼠的抗結腸炎作用,而添加AhR抑制劑消除了CDN對葡聚糖硫酸鈉(DSS)和三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的抗結腸炎作用[16]。然而,目前對于CDN通過調節AhR/Nrf2/NLRP3信號通路緩解LPS誘導的IPEC-J2細胞損傷的保護作用知之甚少。

小腸上皮結構的穩態受細胞增殖和細胞凋亡的調節。然而,由于暴露于各種有毒物質,腸上皮經常受到氧化應激,導致細胞凋亡增強。因此,氧化應激與腸上皮細胞凋亡廣泛相關[2]。培養細胞中的氧化應激可以通過ROS釋放和MDA產生等標志物進行評估[17]。本研究表明,LPS處理后ROS和MDA含量升高,表明IPEC-J2遭受氧化應激。本試驗通過提高細胞活力和減少細胞凋亡小體的產生證實60 μmol/L CDN的處理可以減少氧化應激誘導的IPEC-J2細胞凋亡。此外,細胞外自由基的清除反應及機體內抗氧化劑之間的相互協作可通過T-AOC的大小反映[18]。研究發現,CDN通過提高SOD、CAT、GSH-Px等關鍵抗氧化酶的活性,顯著上調了小鼠心肌細胞的抗氧化能力,降低了體外和體內的MDA含量[15]。Gao等[19]研究發現,在大鼠腎臟損傷模型中,40 μmol/L CDN的處理降低了大鼠腎小管上皮細胞MDA的含量,提高了GSH含量和SOD活性。本試驗結果發現,CDN預處理后逆轉了LPS導致的CAT、SOD活性及GSH含量下降,這些結果表明,CDN對LPS誘導的IPEC-J2細胞氧化損傷具有有效的保護作用,與前人的研究結果一致。

革蘭氏陰性菌外細胞壁的很大一部分由LPS組成,LPS有助于細菌與宿主細胞結合,并通過與Toll樣受體4(TLR4)結合來激活先天免疫系統和免疫應答[7]。與腸上皮細胞接觸的革蘭氏陰性菌可增加腸細胞的ROS產生,從而導致感染細胞凋亡,進而破壞細胞層完整性并誘導促炎細胞因子的表達和釋放,導致炎性損傷[13]。此外,在對BV2小膠質細胞的體外試驗表明,CDN是一種潛在的炎癥抑制劑,它對促炎細胞因子[TNF-α、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、IL-1β]的產生具有免疫調節作用[19-20]。Hou等[21]研究發現,CDN處理可減輕腸道疾病的發生,包括復發性結腸炎和結腸炎相關腫瘤,并減少IL-1β和TNF-α的含量。與前人研究結果相似,本試驗結果表明,CDN處理可以逆轉LPS導致的IL-6、IL-1β含量增加和IL-10含量降低,減弱炎癥反應。

AhR在腸上皮細胞中廣泛表達,腸上皮細胞是結合來自飼糧或微生物代謝產物的AhR配體的主要部位[4]。通常,AhR被認為是基本螺旋-環-螺旋/Per-Arnt-Sim超家族的一部分,并在細胞質中以非活性形式與幾個共伴侶結合[4]。配體結合后,輔殼蛋白釋放AhR,然后將其帶入細胞核,在那里它與芳烴受體(ARNT)的核易位子異二聚體[4-5]。AhR的典型基因靶點是細胞色素P450(如CYP1A1、CYP1A2等),參與多環芳烴和其他異種生物的代謝,CYP1A1在腸道免疫系統中起著至關重要的作用,控制相關的穩態過程,以及對致病性損傷的反應[4-5]。前人研究結果證明,AhR拮抗及敲除AhR和芳基烴受體核易位器(ARNT)減弱了5-羥色胺對CYP1A1的誘導,而5-羥色胺可以通過激活AhR在腸上皮細胞中誘導CYP1A1的表達[6]。Xun等[22]研究表明,補充90 mg/kg白藜蘆醇通過激活AhR/Nrf2途徑并活化AhR激活下游CYP1A1基因的表達來緩解經敵草枯誘導的腸道炎癥和氧化應激以有效保護腸道完整性。本研究結果表明,在IPEC-J2細胞中CDN顯著上調了AhR及CYP1A1 mRNA的相對表達量,說明CDN對AhR活化及下游基因的表達具有積極作用。

根據以前的研究,AhR是抑制NLRP3炎癥小體的轉錄作為NLRP3炎癥小體活性的負調節因子[6]。NLRP3炎癥小體是一種細胞內傳感器,可檢測環境刺激物和內源性危險信號,并已被建議作為人類代謝和自身炎癥性疾病的重要治療靶點。它由炎癥傳感器蛋白NLRP3、含有半胱天冬酶募集結構域的ASC和效應蛋白Caspase-1組成[7]。當發生感染和細胞損傷時,NLRP3炎癥小體激活并觸發Caspase-1前體向Caspase-1的轉化,從而促進IL-1β的激活[8]。此外,大量研究表明,AhR與Nrf2之間存在相互作用機制[23]。當AhR、Nrf2沉默時,則導致細胞氧化損傷及免疫失調,增加致癌易感性[24]。Nrf2通路與細胞保護、氧化還原通路相關,可抵抗氧化應激。有研究發現,尿石素A和其有效合成類似物(UAS03)通過激活AhR-Nrf2通路上調腸道緊密連接蛋白來發揮其屏障功能,吲哚-3-乳酸(ILA)可增加AhR靶基因CYP1A1和Nrf2靶基因谷胱甘肽還原酶2(GPX2)、SOD2和NQO1的mRNA表達,從而保護腸道上皮細胞[25]。Tamoyo等[26]研究發現,6-甲?；胚岵3,2-B]咔唑(FICZ)增加Nrf2/NQO1通路的表達介導抗氧化作用,從而對小鼠心臟具有保護作用。此外,CDN可以通過激活Nrf2通路抑制炎癥蛋白環氧化酶2(COX2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和炎癥細胞因子PGE2的表達,同時增加抗氧化蛋白HO-1和NQO1的表達[27]。此外,Yan等[28]研究發現,柚皮素可以通過AhR信號通路抑制NLRP3炎癥小體的激活,添加AhR信號通路抑制劑CH223191后逆轉了對胰腺和腸道損傷和炎癥的治療效果。本試驗結果與前人研究結果相似,與LPS組相比,CDN預處理后上調了Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA的相對表達量,抑制了NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA的相對表達量。這一結果進一步表明,CDN通過AhR/Nrf2信號通路特異性阻斷NLRP3炎癥小體的激活和預防腸道損傷,但CDN緩解斷奶仔豬腸道炎癥過程還有待進一步研究。

4 結 論

本研究表明,CDN通過激活AhR/Nrf2信號通路抑制NLRP3炎癥小體的激活,促進Ⅰ期代謝酶CYP1A1、Ⅱ期代謝酶(HO-1和NQO1)表達和增加抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性來減輕氧化損傷,并調節炎癥細胞因子的分泌和表達。