生物信息學分析髓系細胞觸發受體-2對低級別膠質瘤的影響

楊緒東，陶瑞明

［ 滄州市第四醫院（南皮縣人民醫院）神經內科，河北 滄州 061500 ］

膠質瘤（glioma）是最常見的顱內惡性腫瘤，根據2007 年世界衛生組織制定的分類標準，膠質瘤分為四級：Ⅰ級和Ⅱ級膠質瘤被稱為低級別膠質瘤（low-grade glioma,LGG），Ⅲ級和Ⅳ級被稱為高級別膠質瘤（high-grade glioma,HGG）［1-2］。其中LGG 占膠質瘤總發病率的15%～25%，主要包括星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤及少突膠質星形細胞瘤［3］。LGG 的臨床表現不明顯，54%的患者出現頭痛，26%的患者出現癲癇發作，還有很多患者沒有臨床表現，所以LGG 的早期發現及診斷仍沒有較好的方法。此外，與HGG 相比，LGG 生長緩慢，生存期較長，但是如果不及時診斷及治療，所有LGG 最終都會進展為HGG，導致患者生存率降低甚至死亡［4］。因此，尋找LGG 發生發展的相關標志物，對于LGG 的早期發現，早期診斷及治療具有重要意義。髓系細胞觸發受體-2（triggering receptor expresses on myeloid cells-2,TREM-2）屬于免疫球蛋白（Ig）跨膜受體超家族成員，是樹突狀細胞和巨噬細胞等髓樣細胞的膜表面受體，主要通過與接頭蛋白DAP-12 結合來向細胞內傳遞信號［5］。TREM-2 與炎癥反應密切相關。TREM-2 能抑制巨噬細胞活化，抑制白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等促炎因子的釋放，從而發揮抑制炎癥的作用［6］?；罨木奘杉毎譃镸1型和M2 型，前者發揮促炎作用，后者具有抑制炎癥作用，TREM-2 在M2 型巨噬細胞膜上的表達增強，也提示其能下調巨噬細胞等抗原提呈細胞的功能及炎癥因子的釋放［7］。近年來，TREM-2 的免疫識別功能在腫瘤中的作用引起越來越多的關注。TREM-2 在肺癌［8］、肝癌［9-10］、結直腸癌［11］及黑色素瘤［12］的發生發展中發揮重要調控作用，但是TREM-2 在LGG 發生發展過程中的作用研究較少。為進一步明確TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達情況及對惡性表型形成的機制，本研究以TCGA數據庫為基礎，分析TREM-2 在LGG 中的表達情況及對患者總體生存率的影響，以期為LGG 的早期發現、早期診斷及治療提供潛在的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 TREM-2 基因在人LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達差異

運用在線分析軟件GRPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）對TCGA 數據庫中提供的LGG 患者臨床數據進行分析，分析TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達差異。具體操作步驟為：在 GRPIA2 在線網站中選擇“Expression Analysis”模塊下的“Expression DIY”進行分析。頂部選擇箱式圖“Box Plot”后，輸入“TREM2”基因，腫瘤類型選擇“LGG”，差異閾值等其他參數默認，點擊“Plot”得到TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織表達差異的柱狀圖。

1.2 TREM-2 表達與LGG 患者臨床病理特征的關系

在 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）網站首頁頂部點擊“TCGA”分析模塊，然后選擇“TCGA Gene analysis”，輸入基因名稱“TREM2”，在TCGA dataset 處選擇腫瘤類型“Brain lower grade glioma”，點擊“Explore”進行分析，然后在 links for analysis 分析下點擊“Expression”，得到TREM2 的表達與LGG 患者年齡、性別、種族、腫瘤分級、組織學分型等臨床病理特征之間的關系。

1.3 TREM-2 表達對LGG 患者總體生存的影響

采用UALCAN 和GEPIA2 兩個在線網站分析TREM-2 的表達異常對LGG 患者總體生存率及無病生存率的影響。具體分析步驟如下：同樣在UALCAN 網站“TCGA Gene analysis”模塊下輸入基因名稱和腫瘤類型，點擊“Explore”進行分析，然后在links for analysis 分析下點擊“Survival”得到生存曲線圖；在GRPIA2 在線網站中選擇“Expression Analysis”模塊下的“Survival Analysis”進行分析，輸入基因名稱，添加癌癥類型，選擇OS（總體生存率）還是RFS（無病生存率），點擊“Plot”得到最終的生存分析結果。

1.4 與TREM-2 基因相關的信號通路富集

在UALCAN 在線分析網站中檢索出與TREM-2呈正相關和負相關的基因，其中正相關基因的相關系數（r）需在0.3～0.9 之間，負相關基因的相關系數（r）需在-0.6～-0.3 之間。然后分別將符合要求的正相關基因和負相關基因輸入DAVID6.8 在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov/），對其進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集。

1.5 分析TREM-2 基因在LGG 中的免疫浸潤水平

在 TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）在線數據庫中檢索TREM-2 的表達與LGG純度和免疫浸潤程度之間的關系。在TIMER 中，基因表達與腫瘤純度之間的相關性使用Pearson 分析來計算，基因表達與6 種免疫細胞浸潤程度之間的關系采用Spearman 分析，偏相分析方法可以排除腫瘤純度對分析免疫細胞浸潤的影響。

1.6 統計學方法

統計分析采用SPSS 17.0 軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和t檢驗（Student's test），P＜0.05 為差異有統計學意義；Kaplan-Meier 分析用于患者總體生存率分析；R4.0.5 版軟件及ggplot2 包用于KEGG 通路富集繪圖。

2 結果

2.1 TREM-2 基因在人LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達差異

GEPIA2 在線網站納入的LGG 腫瘤患者為518例，正常對照207 例；結果發現與正常對照組相比，TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達高于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達差異

2.2 TREM-2 的表達與LGG 患者臨床病理特征的關系

TREM-2 的表達水平與LGG 患者的年齡，性別及種族不相關（P＞0.05）。與患者腫瘤分級（Grade-2vs.Grade-3，P＜0.05），組織學分型（星形細胞瘤vs.少突膠質星形細胞瘤vs.少突膠質細胞瘤，P＜0.05）相關，見圖2。

2.3 TREM-2 表達對LGG 患者總體生存率和無病生存率的影響

采用UALCAN 和GEPIA2 網站分別分析了TREM-2 低表達和高表達對LGG 患者總體生存率的影響。圖3A 是UALCAN 網站分析結果，包括LGG 低表達患者382 例，高表達患者129 例，分析結果表明TREM-2 表達越高，LGG 患者的總體生存率越低（P=0.00025）。圖3B 是GEPIA2 網站分析結果，納入LGG 低表達和高表達患者分別為257 例，結果同樣表明TREM-2 表達越高，LGG 患者的總體生存率越低（P=0.0029）。此外，TREM-2高表達會造成LGG 患者的無病生存期縮短（P=0.015）（圖3C）。

圖3 TREM-2 表達對LGG 患者總體生存率及無病生存率的影響

2.4 TREM-2 相關基因信號通路富集

采用UALCAN 在線網站檢索與TREM-2 相關的基因。其中正相關基因1 585 個，相關系數（r）在0.87～0.3 之間，負相關基因1 554 個，相關系數（r）在-0.54～-0.3 之間。分別將正相關基因和負相關基因輸入DAVID6.8 在線軟件進行KEGG 通路富集。1 585 個正相關基因共富集在76 條通路中，其中參與基因數量≥15 個的信號通路有60條，主要涉及結核、癌癥通路、吞噬體、HTLV-1感染、肌動蛋白細胞骨架的調節、破骨細胞分化、Epstein-Barr 病毒感染及單純皰疹感染等通路（圖4）。1 554 個負相關基因共富集在74 條通路中，其中參與基因數量≥15 個的信號通路有36 條，主要涉及MAPK 信號通路、神經活性配體-受體相互作用、谷氨酸能突觸及多巴胺能突觸等（圖5）。

圖4 與TREM-2 正相關基因的KEGG 通路富集氣泡圖

圖5 與TREM-2 負相關基因的KEGG 通路富集氣泡圖

2.5 LGG 中TREM-2 基因的免疫細胞浸潤

在TIMER 在線數據庫中分析LGG 中TREM-2表達與腫瘤微環境中6 種免疫細胞浸潤程度之間的相關性。結果表明，TREM-2 的表達與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤呈正相關，見圖6。

圖6 TREM-2 表達與免疫細胞浸潤的相關性分析

3 討論

TREM-2 編碼一種在髓系細胞表面表達的天然免疫受體，能調控巨噬細胞和樹突狀細胞，進而參與調控機體的免疫反應，在TLR 配體刺激下可以和接頭蛋白DAP12 耦合，引起下游信號通路的級聯反應，負性調控DC 和巨噬細胞，進而調節炎癥反應［13-15］。由于炎癥介質以及免疫炎癥級聯反應的激活能夠誘導細胞DNA 損傷或者基因突變，導致細胞異常增殖，最終誘發癌變［16-17］。有研究表明［8］，在肺癌患者巨噬細胞中，TREM-2 的表達水平明顯增加，并且與肺癌的惡性等級呈正相關，且體外實驗進一步證明Leiws 肺癌細胞高轉移株（3LL）誘導巨噬細胞高表達TREM-2，同時3LL誘導的荷瘤鼠體內IL-12 分泌減少，IL-10 分泌增加，T 細胞增殖抑制，提示其有促進肺部腫瘤生長的作用。此外，在結直腸癌中，TREM-2 會影響腸道菌群平衡［18］，有助于結直腸癌的產生。另一方面，敲除TREM-2 能降低IL-23，IL-6 等炎癥因子的表達，進而影響結直腸癌的進展，表現為腫瘤病灶減小，腫瘤增殖速度減慢、腫瘤分級水平降低等［11］，提示TREM-2 可能對結直腸癌的發生發展有促進作用。然而，對于TREM-2 在LGG 中的表達情況及在LGG 發生發展中的作用研究較少。

本研究基于TCGA 數據庫，采用生物信息學的方法，初步發現TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達是高于正常組織；病例特征分析發現，LGG與患者腫瘤分級呈正相關，并且還和組織學分型有關，在星形膠質細胞瘤、少突膠質星形細胞瘤及少突膠質細胞瘤中的表達依次降低，差異有統計學意義，而與患者的年齡、性別及種族等不相關。對患者生存分析結果表明，TREM-2 表達越高，LGG 患者的總體生存率和無病生存率越低。TREM-2 的免疫-炎癥調節作用可能是其影響LGG進展的重要機制之一，研究發現差異表達TREM-2與腫瘤微環境中的B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等6種免疫細胞的浸潤程度呈正相關，表明TREM-2的表達對LGG 的免疫微環境具有影響，能夠調控腫瘤的免疫微環境。TREM-2 對腫瘤免疫微環境的調節目前已經有相關文獻報道。對腫瘤微環境的scRNA-seq 序列研究表明，TREM-2 在多個髓樣細胞亞群中表達，尤其是巨噬細胞亞群，TREM-2 巨噬細胞的富集是肝細胞癌患者不良臨床結局的獨立指標［19］。MOLGORA 等［20］人發現TREM-2 敲除小鼠對MCA 誘導的肉瘤、結直腸癌和乳腺腫瘤更具抵抗力，并且證明PD-1 抗腫瘤免疫治療對TREM-2 缺陷小鼠比WT 荷瘤小鼠更有效。單細胞RNA 測序分析髓系細胞表明，TREM-2 缺乏和抗TREM-2 單抗治療均引發浸潤腫瘤的巨噬細胞群顯著改變，說明TREM-2 是人類腫瘤浸潤巨噬細胞的標志物，是補充檢查點免疫治療的一個新途徑，但是TREM-2 調控腫瘤免疫微環境的機制還需深入研究。

綜上所述，TREM-2 在LGG 發生發展中可能是一個促癌基因，其對腫瘤的調節作用可能與腫瘤免疫-炎癥微環境相關，這為進一步研究TREM-2在LGG 的免疫治療提供了新的見解和思路，為LGG 早期診斷、早期治療提供了潛在靶點。但是，本研究也存在一定局限性，沒有在體外進一步研究TREM-2 對LGG 增殖、遷移、侵襲等惡性表型及其調控免疫微環境的具體機制，未在動物實驗中進一步探究其作用來全面研究TREM-2 在調控LGG 中發揮的作用。