影響月季花瓣呈色的理化因子及花色苷組分分析

袁美靜,馬 譽,巫 瑞,康曉玲,丁傳雨,杜 麗,3*

(1 南陽師范學院 生命科學與農業工程學院,河南南陽 473061;2 南陽師范學院 河南省月季花種質創新與栽培技術工程研究中心,河南南陽 473061;3 南陽師范學院分析測試中心,河南南陽 473061)

月季(Rosahybrida)是薔薇科薔薇屬多年生直立或攀援木本植物[1]。作為中國的傳統十大切花之一,月季具有極高的經濟價值,其豐富多彩的花色、馥郁芬芳的香味、易于繁殖的特性使得月季在園林綠化和切花、盆花市場中占據重要地位[2]?；ǘ漕伾窃录咀钪匾挠^賞特性[3],直接影響月季的商業價值。市場上的月季品種繁多,花色豐富,但由于月季自身缺乏能夠編碼合成藍色色素的基因,導致缺少色澤純正的藍色系月季。因此,培育藍色、復色等新穎花色的月季品種是當前育種工作者的主要目標之一。明確月季花色的形成機理是進行花色育種工作的前提。通過對影響月季花瓣呈色的各理化因子的定量評價及其相關性分析,對于探究花色形成機理和種質創新以及豐富月季市場具有重要意義。

前人研究發現,月季花色的形成具有復雜性,不僅受溫度、光照、水分等外部因素影響,還受花瓣表皮細胞結構[4]、細胞液pH 值[5-6]、金屬離子[7-8]、色素成分[9-10]等內部因素的調控,其中,花瓣中色素的種類和含量直接決定其花瓣顏色[11]。經研究發現,月季花瓣中主要含有的色素種類為類黃酮、類胡蘿卜素以及少量的葉綠素[12]。其中,類黃酮是月季中主要的色素類群[13],主要包括花色苷和黃酮醇苷?；ㄉ談t是由花青素通過與?；?、甲基或糖基的共價連接而形成更加穩定的結構,主要決定花瓣顏色[13-15];黃酮醇苷則是一類輔助色素,使花瓣顏色更加穩定[16]。已有研究表明,不同花色月季的形成受色素種類和含量的重大影響,Wan等[17]研究20個月季品種,并發現粉紅色花瓣主要由矢車菊素/天竺葵素-3,5-葡萄糖苷和矢車菊素/天竺葵素-3-O-葡萄糖苷等花色苷賦予,黃色花瓣主要由類胡蘿卜素賦予,橙色是由花色苷和類胡蘿卜素的組合賦予。Yeon等[18]研究不同花色月季花瓣所含物質,其中粉色和紅色花瓣以花色苷為主,黃色花瓣中含有以β-胡蘿卜素為主,白色花瓣含有極少量類胡蘿卜素。由此可見,不同花色苷的種類和含量使月季呈現出紅、粉、紫等多種花色[19]。目前,對于花色苷的分析鑒定主要采用超高效液相色譜-飛行時間串聯質譜(UPLC-TOF-MS/MS)技術,由于其能夠提供精確分子數、對未知物質進行分析鑒定等優點,在花色苷的分析鑒定方面得到廣泛應用。王琳等[20]在對葡萄風信子花色苷的研究中,建立了適用于葡萄風信子的花青素苷分析方法,利用HPLC-MS技術鑒定出6種花色苷。Li等[21]運用UPLC-TOF-MS/MS對15個水仙品種花瓣進行分析,鑒定出17種黃酮醇,16種類胡蘿卜素,其中綠原酸首次在水仙中被鑒定,為水仙的花色育種奠定了物質基礎。

目前,國內外關于月季花色的研究也有涉及,但多數是對于某一個品種或某一特定類群的研究[22-23],缺乏對多個色系月季花瓣及不同色系月季花瓣呈色機理的系統解析,對后續進行花色育種工作的指導價值不高。本研究選取8個不同花色的月季品種為試驗材料,分別測定其花瓣顏色參數、花瓣細胞結構、細胞液pH 值、金屬離子含量、色素含量等多個理化指標,并利用UPLC-TOF-MS/MS技術對其花色苷成分進行定量分析。隨后將花瓣顏色參數與內部影響因子及花色苷組分進行相關性分析,明確造成不同花色月季形成的主要影響因子和花色苷成分,揭示花色形成機理,篩選花色改良受體品種,為后續利用分子育種手段豐富月季花色,培育符合消費者審美的月季花色新品種提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料和取樣

選取河南省月季種質創新與栽培技術工程研究中心種植的8個不同花色的月季品種為供試材料,分別為白色品種‘藤冰山’、黃色品種‘朝圣者’、橙色品種‘蜂蜜焦糖’、粉色品種‘瑞典女王’、粉紫色品種‘薰衣草花環’和‘藍色風暴’、紅色品種‘嫦娥奔月’、紫紅色品種‘雀之舞’。2022年4—5月收集盛花期(花萼、花瓣完全展開)花瓣,每個品種選擇長勢一致的植株,分散選取中層花瓣,部分新鮮樣品立即用于花色表型測定和解剖結構觀測,其余花瓣凍存于-80 ℃冰箱用于后續實驗。

1.2 花瓣顏色測定

取盛花期生長良好的中層花瓣,在散射光源下根據國際照明委員會的CIEL*a*b*色空間系統,使用分光色差儀(CS-422,中國杭州彩譜公司)測定各個品種的花色參數,測定時將分光色差儀的集光口對準花瓣中央著色部位,獲得花色的明度值L*和色相值a*、b*,并運用公式C*=(a*2+b*2)/2計算彩度C*。每個品種測量3 朵花,每朵花取5片花瓣,重復測定3次,取平均值。

1.3 花瓣形態結構觀察

取盛花期花瓣中間部位,采用徒手切片法制作花瓣橫切面、上下表皮的臨時水裝片,放置于光學顯微鏡(RX 50,舜宇光學)下進行觀察,同時使用軟件進行拍照,觀察色素分布及表皮細胞形態,使用Image J軟件測量花瓣橫切面厚度及上表皮細胞面積,每個品種至少拍3張,每張照片至少測定5個細胞,取平均值。

1.4 花瓣pH 測定

參考唐前瑞[24]的方法并稍作修改,取盛花期新鮮花瓣0.5 g并加2 mL 雙蒸水(不加石英砂)研磨成勻漿,置于離心管中,用平面筆式pH 計(pHS-3C,中國上海儀電科學儀器公司)測量花瓣勻漿pH值,每個品種生物學重復3次,技術重復5次,取平均值。

1.5 花瓣金屬離子含量測定

各月季品種取適量花瓣,去離子水清洗3次后置于電熱恒溫鼓風干燥箱100 ℃殺青30 min,再置于70 ℃的溫度環境中烘干10 h。稱取0.5 g烘干樣品,加入71%硝酸5 mL,于聚四氟乙烯消解罐中消解,后趕酸至近干,采用1%硝酸溶液稀釋并定容。試樣經消解后,由電感耦合等離子體質譜儀(ICAP RQ,賽默飛)測定,以元素特定質量數(質荷比,m/z)定性,采用外標法,測定各品種月季花瓣中鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、鐵(Fe3+)、錳(Mn2+)、鋁(Al3+)5種金屬離子含量,每個品種進行3次生物學重復,取平均值。

1.6 總黃酮含量測定

精確稱取蘆丁標準品,將其配制成1 mg/L 母液,分別取蘆丁0,0.25,0.5,0.75,1.0,1.25 mg/mL置于25 mL 容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法顯色。首先加入5% NaNO2溶液1 mL,搖勻后放置6 min,再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻后放置6 min,加入4% NaOH 溶液10 mL,用70%乙醇定容至刻度,放置10 min。顯色反應后,在510 nm 處測定不同濃度蘆丁的吸光值A,以蘆丁實際濃度為橫坐標,以吸光值A為縱坐標繪制標準曲線得到線性回歸方程為y=0.5148x+0.0062,R2=0.999 5。

分別取8個品種烘干的花瓣粉末0.1 g,加入70%乙醇10 mL,超聲清洗儀100 W 提取1 h,取提取后的溶液2 mL,按照上述NaNO2-Al(NO3)3法進行顯色反應,顯色反應后,在510 nm 處測定不同品種月季花瓣供試溶液的吸光值A。不同品種月季花瓣的總黃酮含量按照上官琨瑤等[25]的方法計算,其中供試溶液的濃度按照蘆丁標準曲線的回歸方程計算。每個品種進行生物學重復3次,取平均值。

1.7 總花色苷含量測定

總花色苷含量測定采用pH 示差法[26]。取0.2 g各品種新鮮花瓣,剪碎后置于具塞試管中,向試管中加入1%鹽酸甲醇溶液(1∶99,V/V)10 mL,蓋上塞子超聲清洗儀100 W 提取20 min,直至組織樣品變白。取過濾后的各品種月季花瓣花色苷提取液1 mL,用pH 分別為1.0和4.5的緩沖液稀釋定容至3 mL,平衡80 min后分別測定530 nm 及700 nm處的吸光值,每個品種3次生物學重復,取平均值。以1%鹽酸甲醇溶液為空白對照,以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷作為花色苷標準品,花色苷總量計算公式為:

式中:TA為花色苷總量;A為2個pH 下吸光度的差值;MW為花色苷分子量(以矢車菊-3-O-葡萄糖苷計,449.2 g/mol);D為稀釋倍數;e為摩爾消光系數[以矢車菊-3-O-葡萄糖苷計,29 600 L/(mol·cm)];L為光程(1 cm);G為花瓣鮮重(g);V為提取液體積(mL)。

1.8 總葉綠素及類胡蘿卜素含量測定

取各品種新鮮花瓣0.2 g分別放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉以及10 mL無水乙醇溶液,研磨至組織變白,常溫避光環境靜置提取。將研磨的勻漿轉移至離心管中,冷凍離心機13 000g離心10 min,取上層提取液,采用紫外-可見分光光度計測定665 nm、649 nm 及470 nm 處的吸光值,以無水乙醇溶液為空白對照,每個品種進行生物學重復3次,取平均值。

總葉綠素及類胡蘿卜素含量計算公式[27]分別為:

式中:Ca為葉綠素a濃度;Cb為葉綠素b濃度;Ca+Cb為總葉綠素濃度;Cxc為類胡蘿卜素濃度(mg/L)。

花瓣色素含量計算公式為:

式中:T為新鮮花瓣樣品中花色素的含量(mg/g);C為色素濃度(mg/L);V為提取液體積(mL);N為稀釋倍數;W為樣品鮮重(g)。

1.9 月季花瓣中花色素成分的UPLC-TOF-MS/MS分析

取各品種月季花瓣,液氮速凍后快速研磨,精密稱取0.5 g樣品,以先前處理優化后的條件為基礎,料液比1∶10,提取液為甲醇∶水∶甲酸=70∶29∶1(V/V/V),提取方式為冰浴超聲提取30 min進行樣品前處理,后將提取液轉移至離心管中13 000g離心15 min,保留上清液用0.22 μm 有機濾膜過濾后待上機測定用。

色譜條件:Acquity UPLC BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫30℃;進樣量2 μL;流動相A 為0.1%甲酸水溶液,流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液,流速為0.4 mL/min。液相色譜梯度洗脫條件為0～8 min,95% A,5% B;8～13 min,86%～76% A,5%～14% B;13～16 min,76%～64% A,24%～36% B;16～17 min,64%～50%A,36%～50% B;17～20 min,50%～50% A,50%～50% B。質譜條件:電噴霧離子源;MSE 正負離子模式,質量掃描范圍50～1 200 m/z;毛細管電壓3 000 V;錐孔電壓45 V,提取錐電壓40 V;離子源溫度100 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃;錐孔氣流量50 L/h,碰撞能6～40 V。

1.10 數據分析

上述試驗均生物學重復3 次,用Excel 2021、SPSS 22.0、Origin 2021軟件進行數據處理與分析。用Masslynx V4.2 軟件對花色苷組分分析,用UNIFI軟件結合自建數據庫鑒定花色苷化合物結構。

2 結果與分析

2.1 花色表型特征

為更好地了解不同花色月季花瓣表型特征的差異,選擇不同色系的8種月季(圖1),其花色表型的測定數據見表1。在CIEL*a*b*系統中,L*值代表花瓣明暗變化程度,與花色發育呈負相關,白色品種‘藤冰山’(A)的L*值最高,花色最明亮;紫紅色品種‘雀之舞’(H)的L*值最低,花色較暗,且隨花色逐漸變深,L*值逐漸減小。a*值代表花瓣紅、綠變化程度,紅色品種‘嫦娥奔月’(G)的a*值最高;白色品種‘藤冰山’(A)的a*值較低。隨著花瓣紅色加深,a*逐漸增高。b*值代表花瓣黃、藍變化程度,黃色品種‘朝圣者’(B)及橙色品種‘蜂蜜焦糖’(C)的b*值顯著高于其余品種,粉紫色系品種‘薰衣草花環’(E)‘藍色風暴’(F)的b*值顯著低于其余品種,且為負值。表明b*值從正值到負值的變化,代表黃色減弱藍色增強。C*值代表花瓣色彩鮮艷程度,白色品種‘藤冰山’(A)C*值最低,紅色品種‘嫦娥奔月’(G)的C*值最高。C*值在8個月季品種中的變化趨勢與a*值相似,與L*值變化趨勢相反。

表1 8個月季品種的花色表型色差值Table 1 Color difference values of flower color phenotypes of 8 rose cultivars

圖1 8個月季品種的花色表型(Bar=1 cm)A.藤冰山;B.朝圣者;C.蜂蜜焦糖;D.瑞典女王;E.薰衣草花環;F.藍色風暴;G.嫦娥奔月;H.雀之舞。下同。Fig.1 Flower color phenotypes of 8 rose cultivars (Bar=1 cm)A.Climbing Iceberg.B.The Pilgrim.C.Honey Caramel.D.Queen of Sweden.E.Lavender Flower Circus.F.Shinoburedo.G.Chang'e Benyue.H.Dance of Peacock.The same as below.

2.2 花瓣解剖結構特征及色素分布

通過徒手切片法觀察月季花瓣組織結構,其花瓣橫截面見圖2,花瓣上表皮細胞見圖3。月季花瓣內部結構主要分為上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮。在8個月季品種中,上表皮細胞均為錐形突起、排列緊密,能夠吸收更多光線,加深花瓣顏色;下表皮細胞多為扁平狀,能夠反射光線,8個品種間具有相似的光吸收特征。

圖2 8個月季品種花瓣的橫切面結構(Bar=100 μm)Fig.2 Cross-sectional structure of petals of 8 rose varieties(Bar=100 μm)

圖3 8個月季品種花瓣的上表皮結構(Bar=50 μm)Fig.3 Upper epidermal structure of petals of 8 rose varieties(Bar=50 μm)

但不同顏色的品種在色素分布等方面具有很大差異,在白色品種‘藤冰山’(A)中,各組織結構均未觀察到色素分布,結合前人研究結果,認為白色花色是由于細胞間隙的微小氣泡在光的照射下發生連續反射形成的一種光學顏色,受花色素的影響較小[9,28]。

在其余品種中,色素主要分布在上、下表皮。表皮細胞顏色與花色一致,說明花瓣結構與花色的形成緊密相關。不同月季品種盛花期花瓣厚度及上表皮細胞面積如圖4所示,8個月季品種的花瓣厚度在185.52～256.15 μm,不同花色月季花瓣厚度之間存在顯著差異。其中,‘藤冰山’、‘朝圣者’、‘蜂蜜焦糖’和‘嫦娥奔月’花瓣較厚,顯著大于其他品種,粉紫色品種‘薰衣草花環’花瓣最薄。

圖4 8個月季品種花瓣的橫切面厚度及上表皮面積Fig.4 Transverse section thickness and upper epidermis area of petals of 8 rose cultivars

不同月季品種盛花期花瓣上表皮面積也有顯著差異,其中‘瑞典女王’上表皮面積最大,‘雀之舞’上表皮面積最小。綜合比較,淺色系月季上表皮面積較大,深色系較小。

2.3 細胞液pH 值測定

8個月季品種的細胞液pH 值測定結果為圖5所示,細胞液pH 值范圍為4.19～5.76,偏弱酸性,不同花色品種之間存在顯著差異。其中,粉紫色品種‘藍色風暴’細胞液pH 值最高(5.76),‘薰衣草花環’次之(5.75),紅色品種‘嫦娥奔月’最低(4.19)。由于白色品種含有少量或不含色素,黃色品種多含有類胡蘿卜素,而橙紅色品種相較于黃色品種還通常含有胡蘿卜素及花色苷兩類色素,因此‘蜂蜜焦糖’相較于‘朝圣者’及‘藤冰山’pH 值較低。

圖5 8個月季品種花瓣細胞液pH 值Fig.5 pH values of petal cell fluid of 8 rose cultivars

綜上所述,花色偏藍紫色pH 值較高,花色偏紅色pH 值較低,在8個月季品種中,由粉紫色到紫紅色,pH 值逐漸降低。

2.4 花瓣金屬離子含量測定

對8 個月季品種中Mg2+、Fe3+、Ca2+、Al3+、Mn2+含量進行測定(表2)。在測定的5種金屬元素中,含量最高的為Mg2+,其次為Ca2+,Fe3+、Al3+和Mn2+在月季中僅微量存在。Mg2+含量在0.592～0.968 g/kg之間,其中在橙色品種‘蜂蜜焦糖’中含量最高,粉紫色品種‘薰衣草花環’‘藍色風暴’含量較低。Ca2+的含量為0.552～1.240 g/kg,在紫紅色品種‘雀之舞’中的含量最高,白色品種‘藤冰山’的含量最低。

表2 8個月季品種的金屬離子含量Table 2 Metal ion content of 8 rose cultivars g/kg

在Fe3+、Al3+、Mn2+3 種離子中,Fe3+的含量較高于其他2種,在0.037～0.842 g/kg之間,其中紫紅色品種‘雀之舞’的含量最高,整體趨勢隨著花色變淺含量降低。Al3+含量最高的仍為‘雀之舞’,含量是其余品種的4～6倍;Mn2+在所有月季花瓣中含量均較低?？傊?除了Mg2+外,花瓣顏色最深‘雀之舞’所含有的金屬離子含量均顯著高于其余品種。

2.5 花瓣色素含量測定

色素是影響花色的主要因素,包括總黃酮、總花色苷、總葉綠素及類胡蘿卜素。通過對月季花瓣中色素含量的測定,結果(表3)表明,8個月季品種中均含有黃酮、花色苷以及葉綠素這三類色素,類胡蘿卜素僅存在于黃色品種中,且同類色素在不同品種間的含量存在顯著差異?？傸S酮含量在各個品種月季花瓣中的占比最高,其中紫紅色品種‘雀之舞’的總黃酮含量顯著高于其余品種,黃色品種‘朝圣者’的總黃酮含量最低。其余品種隨著花色逐漸變淺總黃酮含量逐漸降低,且存在顯著差異?；ㄉ帐菦Q定花朵顏色的主要色素之一。

表3 8個月季品種的花瓣色素含量Table 3 Petal pigment content of 8 rose cultivars mg/g

‘雀之舞’的總花色苷含量最高,其次為‘嫦娥奔月’,兩者的花色苷含量均與其余品種間存在顯著差異,而白色品種‘藤冰山’的總花色苷含量最低?？傸S酮與總花色苷的變化趨勢一致,都是隨著花色變淺含量降低。由于8 個月季品種中沒有綠色系花朵,因此8個月季品種中的總葉綠素含量都微量存在。類胡蘿卜素僅在黃色品種‘朝圣者’及橙色品種‘蜂蜜焦糖’中存在,且‘朝圣者’的類胡蘿卜素含量遠高于其余品種,但其他3 種色素的含量卻較低。這說明,色素的種類和含量直接決定花瓣顏色,總花色苷和總類黃酮含量變化趨勢一致,隨著花色變淺含量降低,控制著粉、紅、紫色花的形成。類胡蘿卜素調控黃色花的形成,并與花色苷共同調控橙色花的形成。

2.6 花色表型測定值與不同呈色理化因子的相關性分析

為進一步明確影響月季花瓣呈色的主要因子,將測定的各理化指標與花瓣表型參數進行相關性分析,使用Pearson相關系數表示相關關系的強弱情況(表4)。經分析可知,花瓣顏色與金屬離子含量和色素含量之間均存在一定的相關性。L*與a*、Fe3+、Al3+、總黃酮和總花色苷含量之間均存在顯著負相關關系,其中L*與a*、總黃酮含量、總花色苷含量之間存在極顯著負相關(P＜0.01)。a*與pH 值及總花色苷含量之間存在顯著相關關系,其相關系數分別為-0.787和0.787。Fe3+與總黃酮含量之間存在顯著正相關(P＜0.05);Ca2+與Al3+、總黃酮含量之間為極顯著正相關(P＜0.01),與總花色苷含量之間存在顯著正相關;Al3+含量與總黃酮、總花色苷含量均存在極顯著正相關。4種色素中,總黃酮與總花色苷之間呈現極顯著正相關關系,類胡蘿卜素與其余各指標間均不存在相關關系,總葉綠素與除Mg2+外的其他各指標之間均不存在相關關系。

綜上所述,降低花瓣中總黃酮、總花色苷、Fe3+、Al3+含量可增加花瓣亮度,反之花瓣顏色變暗加深;降低花瓣細胞液pH 值或增加花瓣中花色苷含量可提高月季紅色程度,而隨著月季花瓣紅色程度增加,花瓣亮度降低;Fe3+、Ca2+和Al3+含量都隨著總黃酮含量的升高而升高,Al3+含量還與總花色苷含量極顯著正相關。4種色素中,總黃酮含量與總花色苷含量相輔相成,主要決定花朵顏色,隨著總黃酮含量增加,總花色苷含量也呈遞增趨勢;而總葉綠素及類胡蘿卜素與其余指標間僅呈現弱相關性,未達顯著水平。因此,不同花色月季呈色的理化因子之間關系復雜,相互影響,共同作用決定花瓣顏色,其中總花色苷含量和總黃酮含量占主要地位,直接影響花色呈現,金屬離子及pH 值等因素通過改變花色素結構來改變花色。

2.7 月季花瓣中花色苷組分與花色表型相關性分析

本團隊在前期工作[29]中已建立穩定的月季花色苷組分定量檢測的方法,并對本試驗中的8個品種月季的花色苷組分含量進行精準測定,其結果見表5。由此可知,不同花色月季花瓣中花色苷及黃酮類物質含量存在顯著差異,花色由紫紅色到白色,矢車菊類色素含量逐漸降低,其中矢車菊類色素在紫紅色品種‘雀之舞’中含量最高,黃色品種‘朝圣者’含量最低,且矢車菊-3,5-葡萄糖苷的含量高于矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量;天竺葵類色素在紅色品種‘嫦娥奔月’和橙黃色品種‘蜂蜜焦糖’中含量較高,在其余品種中僅微量存在;二氫楊梅素及飛燕草-3-O-葡萄糖苷在8個品種月季中僅微量存在,而蘆丁的含量在粉紫色系品種中含量相對較高,其中‘薰衣草花環’的含量最高。在前期工作中,明確了8個月季品種中花瓣的花色苷及黃酮類物質的含量,但對于月季花瓣顏色的形成是否與花色苷及黃酮存在一定關系及與哪類花色苷的關系最為密切尚不清楚。故本文引用團隊前期測定的結果,與上文測定的花瓣顏色參數及總色素含量等指標進行相關性分析,進一步明確造成月季花色差異的小分子代謝物,明確月季花瓣呈色機理,同時也為后期利用分子手段進行花色育種奠定基礎。

通過計算月季花瓣顏色參數與花色苷含量、黃酮含量之間的Person相關系數,對其相關性進行分析,并以熱圖形式顯示(圖6)。由此可知,不同顏色參數與花色素之間存在很強的相關性。L*與a*、總黃酮含量及總花色苷含量之間呈極顯著負相關(P＜0.01),并與單個花色苷含量之間也存在相關性,與單個黃酮類化合物間無相關性。L*與矢車菊-3,5-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相關系數分別為-0.97和-0.79,相比之下,L*與矢車菊-3,5-葡萄糖苷的相關性較矢車菊-3-O-葡萄糖苷強。

圖6 月季花瓣顏色測定值與花色苷成分的相關性分析Cy3D5G,cyanidin-3,5-glucoside.Pe3D5G,pelargonidin-3,5-diglucoside.Cy3G,cyanidin-3-O-glucoside.Pe3G,pelargonidin-3-O-glucoside.De3G,delphinidin-3-O-glucoside.* The correlation is significant (P＜0.05);** the correlation is very significant (P＜0.01).Fig.6 Correlation analysis of rose flower color measurement values and anthocyanin componentsCy3D5G.矢車菊素-3,5-葡萄糖苷;Pe3D5G.天竺葵素-3,5-葡萄糖苷;Cy3G.矢車菊素-3-O-葡萄糖苷;Pe3G.天竺葵素-3-O-葡萄糖苷;De3G.飛燕草素-3-O-葡萄糖苷;Ampelopsin.二氫楊梅素;Rutin.蘆丁。*代表相關性顯著(P＜0.05);**代表相關性極顯著(P＜0.01)

而a*恰好相反,a*與大部分單個花色苷含量間存在顯著正相關,其中與矢車菊-3,5-葡萄糖苷的相關性最強。而b*與各指標間均不存在相關性?？偦ㄉ蘸颗c3種花色苷含量呈顯著正相關性,其中與矢車菊-3,5-葡萄糖苷呈極顯著正相關(P＜0.01),與天竺葵素-3,5-葡萄糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷間均存在顯著正相關性(P＜0.05)。飛燕草-3-O-葡萄糖苷只與二氫楊梅素之間存在顯著正相關關系,飛燕草-3-O-葡萄糖苷的含量隨著二氫楊梅素的變化而變化。此結果揭示了月季花瓣花色苷和黃酮代謝之間的相關性。矢車菊類色素之間和天竺葵類色素之間均存在顯著正相關性,但兩類色素之間無相關性,且矢車菊素、天竺葵類色素和飛燕草類色素之間均不存在相關關系,且蘆丁與花瓣表型及花色苷均不存在相關性。這說明三類色素在花色苷合成通路中處于不同的合成方向,調控不同花色的形成,而蘆丁不是影響花瓣顏色變化的主要因子。

綜上所述,花色苷是影響月季呈色的主要因子,蘆丁等黃酮類物質輔助月季呈色。矢車菊-3,5-葡萄糖苷在月季花色苷組分中占據主體地位,是影響月季花瓣亮度L*和紅度a*的主要因素,其中對L*產生負影響,對a*產生正影響。在8個品種月季中,除橙黃色品種‘蜂蜜焦糖’外,矢車菊-3,5-葡萄糖苷在5種花色苷組分中占比最高,且在紫紅色品種中含量最高。由此發現,矢車菊-3,5-葡萄糖苷能夠調控月季花瓣向紫紅色發展。天竺葵類色素與L*、總花色苷含量間也存在顯著正相關性。天竺葵-3,5-葡萄糖苷占比高于天竺-3-O-葡萄糖苷,且在紅色品種‘嫦娥奔月’中最高,其次是橙黃色品種‘蜂蜜焦糖’,其顯著高于其他品種。這說明天竺葵色-3,5-葡萄糖苷對于月季花瓣紅色花朵的形成有一定的影響,并與類胡蘿卜素一起調控月季形成橙紅色的花朵。

飛燕草-3-O-葡萄糖苷在月季中僅微量存在,但在粉紫色系品種 ‘薰衣草花環’中發現極高的蘆丁含量。這說明月季中極少量的飛燕草素不足以使花朵變藍,但無色的黃酮醇可能與花色苷發生作用,從而使月季呈現出一定程度的藍紫色。

2.8 8個品種月季花瓣花色素組分的聚類分析

根據所測得的花色苷和黃酮類物質的含量,對8個品種月季進行聚類分析。由圖7 可知,當歐式距離在400時,將所有樣本聚類為3類,即白色品種‘藤冰山’、粉色品種‘瑞典女王’及紫紅色品種‘雀之舞’為一類;黃色品種‘朝圣者’、橙黃色品種‘蜂蜜焦糖’、粉紫色品種‘藍色風暴’及紅色品種‘嫦娥奔月’為一類;粉紫色品種‘薰衣草花環’單獨為一類;且還可發現‘薰衣草花環’始終單獨為一類。

圖7 8個品種月季花瓣花色素成分的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of 8 cultivars of rose based on anthocyanin components

通過對比各品種月季花色苷組分的含量,發現第一類中3個品種的月季所含的蘆丁含量在7個組分中占比最高,而‘藤冰山’和‘瑞典女王’不含或含量較少花色苷組分,但‘雀之舞’中矢車菊-3,5-葡萄糖苷的含量較高,因此當歐式距離為88時,其又與‘雀之舞’區分開來。第二類中4個品種中均含有較豐富的矢車菊-3,5-葡萄糖苷和少量的蘆丁,故聚為一類;但與其他3個品種相比,‘嫦娥奔月’中還含有較高的天竺葵-3,5-葡萄糖苷,因此在歐氏距離為118時其也與其他3 個品種區分開來。第三類中‘薰衣草花環’以極高的蘆丁含量和較低的花色苷含量顯著區別于其他品種,單獨成類。

3 討論

3.1 總花色苷和總黃酮含量是影響月季花瓣呈色的主要因子

花色是植物最重要的觀賞性狀之一,受多種呈色因子影響,對各因子進行量化評價并分析其相關性對于探究花色形成機理及種質創新具有重要意義。在對8個不同花色月季品種的花色表型進行測定時,隨著花色加深,L*值逐漸減小,a*值、C*值呈現增大的趨勢,L*值與a*值、C*均呈負相關,L*值與b*值之間無顯著相關性這與劉藝平等[30]對荷花花色表型和李盈俠等[31]對牡丹花色表型研究的結果一致?；ò炅炼萀*值及花瓣彩度C*值均與花瓣紅度a*值相關,相較于b*值,a*值對于花瓣表型的參考價值更大,這與吳艷梅等[32]對麗格海棠花色表型研究的結果一致?；ò杲Y構主要是影響光線反射從而影響花色。研究結果表明,白色花瓣中無色素分布,其余品種色素在花瓣上下表皮中均有分布。與程怡等[22]對月季‘仙境’的研究結果一致。月季與芍藥[33]、葡萄風信子[34]的色素分布模式一致,與長春花[27]等不同。而花瓣厚度不是決定花朵著色的主要因素,與劉金芝[35]的研究結果相同。細胞液的酸堿程度影響著花青素的結構穩定和存在方式,在觀賞植物花瓣中,細胞液大多偏酸性,本研究中的8個月季品種pH 值為4.19～5.76,偏弱酸性,藍紫色系花瓣pH 值最高;隨著花瓣顏色逐漸加深,pH 值逐漸降低,且pH 值與紅度a*值呈顯著負相關,可通過降低pH 值增加花瓣紅度,與余智城等[36]對野牡丹花色的研究結果一致。研究金屬離子對花瓣呈色的作用,發現Fe3+、Ca2+、Al3+與花瓣表型顏色均具有相關性,在一定程度上影響著月季花瓣呈色,且Al3+與總花色苷之間呈極顯著相關,因此推測Al3+可能會與花青素苷β環上的二羥基結合形成高度著色的絡合物[37],從而影響花朵呈色。唐東芹等[38]在對風信子花色進行研究時也證實了這一點。相關性研究顯示,盡管pH 值、Fe3+、Ca2+、Al3+、總黃酮含量、總花色苷含量與月季花瓣呈色密切相關,但總黃酮及總花色苷含量與花色表型的相關系數較高,是主要影響因子,這與謝燕等[39]對臘梅花色研究的結果一致。

3.2 花色苷對月季花瓣呈色起主要作用,黃酮類物質起輔助作用

月季花瓣中主要存在的花色苷主要為矢車菊類及天竺葵類色素,連接的糖苷包括葡萄糖及蕓香糖。與王峰[1]和Mikanagi等[40]對月季花色苷物質鑒定的研究結果一致。月季花瓣中黃酮類物質主要為槲皮素及山奈酚的糖苷化、?；苌?在觀賞植物中也多次被報道。張玲等[41]在對‘紫枝’玫瑰進行花青素苷檢測時,類黃酮苷多以槲皮素和山奈酚的糖苷化、?；难苌餅橹?。鐘培星等[42]研究發現芍藥中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷等黃酮醇的含量與芍藥花色呈現明顯線性關系。在對8個品種月季花瓣顏色參數與花色苷組分進行相關性分析時發現,月季花瓣的顏色多由花色苷的種類和含量決定,黃酮類物質輔助花瓣呈色。矢車菊-3,5-葡萄糖苷是月季花瓣中主要的花色苷成分,這與之前的報道[43-44]相吻合。這是因為月季中含有一種特殊的矢車菊糖基轉移酶,其經常在花色素苷元的2個不同位置上發生糖基化[19]。矢車菊-3,5-葡萄糖苷調控月季花瓣向紫紅色發展,天竺葵-3,5-葡萄糖苷對橙、紅色花的形成有一定的影響,這與李想等[28]的研究結果一致。8個品種月季中均含有豐富的蘆丁,但相關性顯示蘆丁與花色表型并無相關性,這說明黃酮醇可能通過與花青素發生共色作用而產生色素沉著,從而輔助花瓣呈色。這與Gordillo等[45]的報道一致,其也發現花青素與黃酮醇共著色可以使花青素更穩定。

3.3 粉紫色品種‘薰衣草花環’為最適合進行花色改良的月季受體品種

Katsumoto等[46]在培育藍色月季時,通過分子手段進行花色改良時能夠積累藍色色素的受體品種通常是一些花瓣中含有較多黃酮醇卻積累少量的矢車菊類色素,并且具有較高的細胞液pH 值的月季品種。同時,結合之前的研究中也發現矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素位于花色苷合成途徑的不同方向,蘆丁等黃酮醇類物質與花色苷發生共色素沉著,輔助花朵呈色,導致花瓣顏色向藍紫色偏轉。故選擇含有豐富黃酮醇類前體物質以及對于存在競爭關系的色素含量較少的月季品種成為花色育種的理想品種。而在本研究中發現粉紫色品種‘薰衣草花環’正因為積累了高含量的蘆丁和少量的矢車菊類色素而顯著區別于其他品種,且其pH 值也顯著高于其他品種,故后續可通過調控內源基因表達或轉入外源基因的手段來改良花色。而白色品種‘藤冰山’和粉色品種‘瑞典女王’也含有適量的蘆丁和少量的花色苷以及較高的細胞液pH 值,因此成為第二個合適的選擇,其雖含有一定量的黃酮醇,但由于不含或僅含有少量的花色苷,導致可能缺少一些能夠編碼合成花色苷的酶基因,故推測需轉入多個外源基因,重新構建花色苷合成通路,因此改良過程和‘薰衣草花環’相比較為繁瑣,但具體的花色改良方案還需進一步研究。