鹽脅迫對杠柳幼苗生長及次生代謝產物積累的影響

韓翠婷,李先寬,王廣蘋,馬 琳,張 堅

(天津中醫藥大學中藥學院,天津 301617)

杠柳(PeriplocasepiumBunge)為蘿藦科杠柳屬植物,其根皮為傳統中藥“香加皮”,具有祛風濕、強筋骨的功效[1]?，F代研究表明,杠柳的主要有效成分為甾體類成分,如強心苷類、C21甾類等,具有強心、抗腫瘤等藥理作用[2]。此外,杠柳中的揮發性成分,如4-甲氧基水楊醛、異香草醛等也是杠柳的活性成分,其中4-甲氧基水楊醛還是藥典中杠柳的唯一質量控制指標性成分[1]。

土地鹽漬化是全世界面臨的重要環境問題,據統計,目前全球約有9.5億hm2的鹽漬化土地,這已成為限制植物生長發育的主要非生物脅迫之一[3]。因此,探究鹽漬化土壤對植物生長特性的影響,對鹽漬化土壤的開發利用和土壤改良具有重要意義。前人研究表明,種植耐鹽堿植物,可以在一定程度上降低土壤鹽分,達到改良鹽堿地的目的[4]。同時,有研究者提出中藥材種植的“邊緣效應”,表明適度的逆境脅迫能夠明顯提高藥材的活性成分含量[5]。杠柳作為耐鹽堿的水土保持物種,近年來對其研究多見于干旱或沙埋深度等脅迫下的杠柳生理特性及光合作用特征等[6,7]方面,而鮮見杠柳在鹽脅迫下的應答機制及產量品質等相關報道。研究鹽脅迫對藥用植物次生代謝成分的影響有利于揭示逆境條件下其活性成分的合成機制,并為鹽脅迫作為誘導手段刺激藥用植物有效成分合成提供理論指導[8]。因此,本試驗通過鹽脅迫處理,考察杠柳幼苗的生長特性以及次生代謝產物總甾體、杠柳毒苷、杠柳次苷、杠柳苷元和4-甲氧基水楊醛等含量變化,揭示鹽逆境與杠柳次生代謝產物積累的相關性,以期為杠柳的鹽脅迫研究及產量品質調控提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料與試驗設計

試驗于天津中醫藥大學中藥學院進行,種子采自于天津市薊州區山區,經筆者張堅副教授鑒定為蘿藦科植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)種子。選擇適量均一飽滿的種子,經催芽處理后均勻種植到育苗穴盤中,育苗基質由蛭石、珍珠巖(1∶1)混合而成,共15盆。置于光周期(光照/黑暗)16 h/8 h、光照度3 600 lx、恒溫 (23±2) ℃、相對濕度為 (50±5)%的培養室內培養。每周噴施1/2 MS營養液1次,定期澆水。期間進行間苗處理,30 d后選取生長良好、長勢一致的幼苗進行鹽脅迫處理。

將15盆幼苗隨機分為5個處理組,每個處理組3盆。鹽脅迫濃度設置0.2%、0.5%、1.0%、2.0%等4個水平,同時設置空白對照組(CK)。其中,鹽處理液由1/2 MS營養液和分析純NaCl配制,空白對照組澆灌等量1/2 MS營養液。每隔3 d灌溉1次處理液,并使大量處理液從盆底滲出,以交換基質中的積余鹽。脅迫處理10 d后,收獲樣品,記錄不同處理組地上及地下部分的鮮質量數據,經真空冷凍干燥處理后記錄其干質量,計算干濕比(干質量/鮮質量×100%),干濕比越大,代表植株含水量越大,反之則越小。同時將樣品置于-20 ℃冰箱保存,用于后續各成分含量測定。

1.2 藥用成分含量測定

杠柳中總甾體成分含量測定采用香草醛-濃硫酸法[9];杠柳毒苷、杠柳次苷、杠柳苷元及4-甲氧基水楊醛含量測定采用UPLC 法,具體實驗條件參照姚鵬等[10]方法并進行改良。

1.2.1 UPLC色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),保護柱為Waters C18 柱(12.5 mm×2.1 mm,5 μm),以純水(A)-甲醇(B)溶液為流動相梯度洗脫(0 min,90%A;1～4 min,85%～70%A;4～8 min,70%～67%A;8～9 min,67%～55%A;9～11 min,55%～48%A;11～17 min,48%～25%A;17～18 min,25%～90%A),流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣體積為1 μL,檢測波長為235 nm,分析時間為18 min。

1.2.2 對照品溶液制備

精密稱取各對照品適量,加甲醇溶解并定容至5 mL,即得對照品母液。各成分質量濃度分別為杠柳毒苷1.02 mg/mL、杠柳次苷1.06 mg/mL、杠柳苷元0.94 mg/mL、4-甲氧基水楊醛1.02 mg/mL。然后,精密吸取各對照品母液適量,用甲醇配制成每1 mL分別含204 μg杠柳毒苷、212 μg杠柳次苷、188 μg杠柳苷元、204 μg 4-甲氧基水楊醛的混合對照品儲備液,4 ℃冰箱存儲備用。

1.2.3 供試品溶液制備

分別稱取不同處理組杠柳地上及地下部分干燥粉末約 0.1 g,置于5 mL容量瓶中,用純甲醇定容,超聲提取45 min,靜置冷卻后,純甲醇補足體積,8 000 r/min離心2次,每次10 min,上清液即為供試品溶液,過0.22 μm微孔濾膜后,于4 ℃冰箱存儲備用。

1.2.4 方法學考察

(1)線性關系考察:精密吸取一定量的混合對照品儲備液,按照不同稀釋倍數用純甲醇制成一系列濃度的混標對照品溶液,按照1.2.1節色譜條件依次進樣,測定峰面積,以濃度(μg/mL)為橫坐標(x),峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線(表1)。由表1可知,4 個化合物在各自線性范圍內決定系數(R2) 均大于0.999 0,表明4個化合物在其線性范圍內線性關系良好。

表1 杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷及4-甲氧基水楊醛的標準曲線Table 1 Standard curves of periplocin,periplocymarin,periplogenin,and 4-methoxy salicylaldehyde

(2)精密度實驗:在1.2.1節色譜條件下,取杠柳毒苷對照品溶液,連續進樣6次,分別測定其峰面積。結果顯示,其峰面積RSD 值均小于2%,表明儀器精密度良好。

(3)重復性實驗:取同一處理組樣品(0.5%鹽濃度杠柳幼苗根)約0.1 g,按照1.2.3節方法制備供試品溶液,平行操作6份,在1.2.1節色譜條件下依次進樣,測定峰面積。結果顯示,各成分RSD 值均小于2%,表明本方法重復性良好。

(4)穩定性實驗:按照1.2.3節方法制備供試品溶液(0.5%鹽濃度杠柳幼苗根),分別于0,2,4,6,8,12,24 h內進樣,測定峰面積。結果顯示各成分RSD均小于2%,表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

(5)加樣回收率實驗:取已知含量的同一處理組杠柳樣品粉末,平行取樣6份,分別加入對照品溶液適量,按上述提取方法制備提取液,進樣測定各成分的峰面積,計算平均回收率均大于95%,RSD均小于2%。

1.2.5 供試品含量測定

在1.2.1節色譜條件下,分別進樣不同處理組樣品制備所得的供試品溶液1 μL,測定峰面積,計算各處理組樣品中的杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷及4-甲氧基水楊醛成分含量。在該色譜條件下,各成分的色譜峰分離良好,部分結果見圖1。

圖1 混合對照品(A)、0.5%鹽處理組根樣品(B)、0.5%鹽處理組莖樣品(C)的UPLC色譜圖1.4-甲氧基水楊醛;2.杠柳苷元;3.杠柳毒苷;4.杠柳次苷。Fig.1 UPLC chromatogram of mixed reference substances (A),root samples of 0.5% salt treatment group (B),and stem samples of 0.5% salt treatment group (C)1,4-methoxy salicylaldehyde.2,periplogenin.3,periplocin.4,periplocymarin.

1.3 數據處理

利用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析,采用LSD 和Duncan多重比較法進行顯著差異性檢驗,采用Origin 85.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對杠柳幼苗生長狀態和生物量的影響

隨著鹽處理濃度的增加,杠柳幼苗的長勢受到的抑制逐漸加重,但其在0.2%～0.5%鹽脅迫濃度下長勢良好(圖2)。

圖2 鹽脅迫下杠柳幼苗葉片表型和根系形態變化A-E correspond to the control group and treatments with 0.2%,0.5%,1.0% and 2.0% salt concentrations,respectively.Fig.2 Changes of roots and leaves of P.s epium under salt stressA～E 分別對應對照組及0.2%、0.5%、1.0%、2.0%的鹽濃度處理。

同時,從表2可知,杠柳幼苗地上部分干鮮質量在各濃度鹽脅迫下均較對照組有所提高,并隨著鹽濃度增加而先升后降,且均在0.5% NaCl鹽脅迫下增幅達到顯著水平;杠柳幼苗根系鮮質量隨鹽脅迫濃度的增加呈現逐漸顯著下降趨勢,而根系干質量則先增加后降低,并在0.2%～0.5% 鹽脅迫下顯著增加;地上和地下干濕比在各濃度鹽脅迫下均比明顯增加,且有隨鹽濃度逐漸增加的趨勢?？梢?適宜濃度鹽(0.5% NaCl)脅迫處理更有利于杠柳幼苗地上部和根系干物質的積累。

表2 不同濃度NaCl處理下杠柳幼苗生長變化Table 2 Growth of P.sepium seedlings under NaCl treatments

2.2 鹽脅迫對杠柳幼苗根和莖中總甾體含量的影響

如圖3所示,隨著鹽脅迫濃度的提高,杠柳幼苗根及莖中的總甾體含量均呈先升高后降低的趨勢,且均在0.5% NaCl處理時達最大值。與對照相比,杠柳幼苗根及莖中總甾體含量在0.5% NaCl處理時分別顯著提高了18.2%、36.2%;莖中總甾體含量在0.2% NaCl處理時比對照組間顯著提高(P＜0.05)。即適宜濃度鹽脅迫有利于杠柳幼苗根及莖中的總甾體積累。

圖3 鹽脅迫下杠柳幼苗根和莖中總甾體含量變化不同小寫字母表示處理組間在 5%水平差異顯著。下同。Fig.3 Changes of total steroid content in roots and stems of P.sepium seedlings under salt stressDifferent lowercase letters indicate significant difference between the treatment groups at the 5% level.The same as below.

2.3 鹽脅迫對杠柳幼苗根和莖中主要強心苷類成分含量的影響

3種強心苷類成分(杠柳毒苷、杠柳次苷和杠柳苷元)在杠柳幼苗莖中均有分布,且三者含量隨著鹽脅迫濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢(圖4)。其中,杠柳毒苷與杠柳苷元含量在0.5% NaCl處理組下達到最大值,比相應對照組分別顯著提高了35.1%、10.3%(P＜0.05);杠柳次苷含量則在1.0%NaCl處理組下達到峰值,各鹽濃度處理含量均顯著高于對照組,分別達到對照組的1.28,3.97,5.49,2.51倍(P＜0.05)。

圖4 鹽脅迫下杠柳幼苗根和莖中杠柳毒苷、杠柳次苷及杠柳苷元成分含量變化Fig.4 Changes of periplocin,periplocymarin,and periplogenin contents in roots and stems of P.sepium seedlings under salt stress

與杠柳幼苗莖中表現不同,在同樣的檢測條件下,杠柳根中未檢測到杠柳苷元成分。杠柳幼苗根中杠柳毒苷、杠柳次苷含量隨鹽濃度的變化趨勢均與莖中一致,但在鹽脅迫前后均明顯高于相應莖中含量;同時,與對照相比,各處理組根中杠柳毒苷和杠柳次苷含量均不同程度提高,且大多達到顯著水平,杠柳毒苷含量分別達到對照組的1.32,2.08,1.70,1.38倍(P＜0.05),杠柳次苷含量分別達到對照組的1.53,2.15,2.66,1.25倍。

2.4 鹽脅迫對杠柳幼苗中4-甲氧基水楊醛含量的影響

圖5顯示,隨著鹽脅迫濃度的增加,杠柳幼苗根及莖中4-甲氧基水楊醛含量呈先升后降再升的趨勢,并均在2.0%濃度下達到峰值,分別為0.841,0.323 mg/g,此時相較對照組分別顯著提高了68.9%、317.6%。在不同鹽濃度處理下,根及莖中的4-甲氧基水楊醛含量相比對照組均顯著增加(P＜0.05)。此外,在鹽脅迫前后,杠柳幼苗根中4-甲氧基水楊醛含量均遠遠高于莖中含量。

圖5 鹽脅迫下杠柳幼苗根和莖中4-甲氧基水楊醛含量變化Fig.5 Changes of 4-methoxy salicylaldehyde content in roots and stems of P.sepium seedlings under salt stress

3 討論

在前期試驗中[11]筆者發現杠柳耐鹽性較強,表現在:(1)幼苗在中等鹽(0.5%)脅迫強度下生長良好;(2)能夠耐受1.0%的高強度鹽脅迫,雖然高強度鹽脅迫下根系生長受到一定程度的抑制,但其頂芽仍然能夠萌發;(3)可以短期耐受2.0%的超高濃度鹽脅迫,生長雖停滯但植株并未死亡。在本試驗中,中等鹽脅迫(0.5% NaCl)下杠柳幼苗地上干、鮮質量均顯著高于其他處理組和對照組,說明中等鹽脅迫更有利于杠柳地上部分生物量的積累。但在本試驗中同時發現,杠柳幼苗根系發達程度及生物量鮮質量隨鹽脅迫強度增加呈現下降趨勢,而干質量則在中低鹽濃度下增加,且鹽脅迫下根系的干濕比均明顯高于對照組。這可能是因為鹽脅迫導致植物生理干旱,耐鹽植物通過鹽離子區隔化和產生初生或次生代謝等滲透調節物質來調節細胞滲透勢,重新建立細胞內穩態;其次有研究表明植物體在鹽脅迫下,細胞壁通過木質化或木栓化起到細胞拒鹽的作用,如有研究顯示一些植物通過根部皮層或凱氏帶細胞壁木化增厚達到拒鹽目的[12],這在一定程度上增加了根系干質量和干濕比。張潭等[13]對枸杞幼苗的研究中也發現此現象。

次生代謝產物不是細胞正常生命活動所必需的物質,不直接參與植物生長和發育過程,但在植物提高自身保護和生存競爭能力、協調與環境關系上發揮著重要作用,且很多次生代謝產物也是藥用植物的主要有效成分或活性成分[14]。相關試驗表明,植物在逆境脅迫下可以通過次生代謝產物的積累來抵御受到的傷害,以保證植物的正常生長發育[15]。杠柳中的主要藥效成分有C21甾體類及強心苷類等,兩者均屬于甾體類化合物。本試驗對總甾體成分含量測定結果顯示,鹽脅迫處理對杠柳幼苗根及莖中的總甾體成分有明顯誘導作用,在0.5%鹽濃度下其含量相比對照組顯著增加,這說明一定強度的鹽脅迫有利于杠柳幼苗中甾體類成分的合成積累。

杠柳毒苷、杠柳次苷及杠柳苷元是存在于杠柳中的甲型強心苷類成分,既是屬于總甾體中的重要成分,同時也是杠柳中的主要藥效成分[16]。其中杠柳苷元在糖基轉移酶的催化作用下,可與加拿大麻糖及葡萄糖相結合,從而形成糖苷類化合物杠柳次苷及杠柳毒苷。研究表明糖基轉移酶可能廣泛參與植物的各種脅迫應答,在植物的生長發育中發揮重要作用[17]。由糖基轉移酶催化的糖基化反應,是植物細胞生長發育、代謝平衡過程中所必需的一種修飾反應,經修飾獲得的糖基化產物具有不同的生物學功能,使得糖基化反應成為影響及調節植物生長代謝平衡的重要機制[18]。植物中的總甾體類成分包括植物甾醇、膽固醇和膽固醇代謝過程中的下游產物,如C21甾體和強心苷等。本試驗中適當濃度的鹽處理可以顯著提高甾體類化合物的含量,同時也提高了甾體類下游代謝產物強心苷類成分含量。這說明適度的鹽脅迫可以激活杠柳中甾體合成的整個代謝路徑,參與逆境下的脅迫響應。但強心苷中的這3種主要成分被誘導出現的峰值所處鹽脅迫濃度并不完全一致,這可能與不同鹽脅迫下強心苷類產物合成下游路徑中的糖基轉移酶或水解酶活力變化有關。本試驗還發現,杠柳不同部位中杠柳毒苷和杠柳次苷含量均表現為根中明顯高于莖中,而杠柳苷元成分卻未在根中檢測到。在姚鵬等[10]研究結果中,同樣顯示其根中杠柳苷元含量很低或檢測不到,這與本試驗結果相一致。這可能是由于杠柳根中的糖基轉移酶活性更強,從而導致其糖基化反應更迅速,導致苷元含量過低幾乎檢測不到;而在莖中杠柳苷元含量更高,則可能是莖中糖苷水解酶活力高或糖基轉移酶活力低導致,這有待后續通過分子生物學方法進一步驗證。

4-甲氧基水楊醛作為藥典中規定的唯一指標性成分,其含量高低對于杠柳的藥用質量評價具有重要作用。在植物中,4-甲氧基水楊醛合成的前體物質有4-羥基苯甲醛,兩者結構中都具有酚羥基和醛基2種還原性基團,均屬于多酚類次生代謝產物,能夠中和逆境脅迫下植物體內產生的活性氧自由基,發揮抗氧化作用,減輕植物受到的氧化脅迫傷害[19]。本試驗結果顯示,杠柳幼苗根莖中4-甲氧基水楊醛含量隨鹽脅迫程度的增加呈先升后降而后再升的趨勢,同時所有鹽脅迫組中4-甲氧基水楊醛的含量均顯著性高于對照組。由此可見,高鹽強度(1.0% NaCl)脅迫雖然也能夠顯著促進植株中4-甲氧基水楊醛的誘導,但含量卻低于中低強度鹽脅迫組,這可能是由于高鹽脅迫下植物體內氧化還原平衡被打破,產生了更多的活性氧自由基,而植物體產生的4-甲氧基水楊醛等多酚類物質被活性氧大量消耗,從而導致4-甲氧基水楊醛在杠柳地上和地下均呈現出下降的趨勢。而超高強度鹽(2.0% NaCl)脅迫下杠柳幼苗無論地上還是地下部分4-甲氧基水楊醛含量均顯著增加(明顯高于其他各組),這說明超高鹽脅迫下,植物體通過次生代謝產生小分子還原性多酚類物質可能是應對極端惡劣條件下氧化脅迫的重要措施。前期試驗表明杠柳幼苗中抗氧化酶體系發揮中和活性氧的作用是在中低濃度鹽脅迫范圍內,而黃酮類成分的含量則在高鹽脅迫下顯著提高,這進一步說明小分子還原性物質可能是杠柳幼苗在極端逆境條件下抵御氧化脅迫對其植株造成傷害的重要措施。衛樂等[20]研究也發現不同鹽濃度下玫瑰中部分多酚物質含量呈先升后降而后再升的趨勢,這與本試驗結果具有一致性。此外,本試驗中由于選擇的研究對象為杠柳苗期(1個月齡),次生代謝產物積累時間較短,因此次生代謝產物含量均相對較低,但鹽脅迫下次生代謝產物誘導的變化趨勢顯著,說明適度的鹽脅迫可以促進杠柳植物體中次生代謝產物的積累。

4 結論

在中等濃度(0.5%)鹽脅迫處理下,杠柳幼苗地上部分的生物量積累顯著增加,同時根系干質量也顯著增加;杠柳幼苗根及莖中的主要次生代謝產物如總甾體、強心苷類等含量在0.5%鹽脅迫濃度作用下均明顯上升,而4-甲氧基水楊醛含量則在2.0%的高濃度鹽脅迫下顯著增加。這為杠柳在中等強度鹽漬化土壤上引種栽培提供了理論依據,對鹽漬化土壤改良利用及杠柳資源開發提供了新思路,同時也為杠柳道地藥材產地的劃分提供了參考。