基于TLR4/NF-κB 通路探究NLRP3 對銅綠假單胞菌的清除機制

劉鑫,李茂新,閆丙健,續宗杰

山東第一醫科大學附屬人民醫院燒傷整形科 濟南市,271199

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是燒傷科最常見的革蘭陰性菌,大面積深度燒傷患者由于傷口開放、愈合及用藥時間長,易導致該細菌的感染,該病菌也是引起醫院獲得性感染的主要致病菌之一,可在人機體的任何部位定植,進而導致不同程度的感染發生[1-2]。臨床數據統計,目前肺炎患者因感染PA 死亡的人數超過40 %,且感染同時伴隨其它并發癥的死亡率已超過70 %[3]。目前臨床上常用抗菌藥物治療PA[4],雖能一定程度改善患者病情,但由于抗生素的濫用及PA 天然的耐藥性等問題,導致治療效果并不理想。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLR) 是目前研究較廣泛的模式識別受體之一,主要存在于胞漿中,可介導機體的天然免疫應答[5]。目前,NLR家族成員熱蛋白結構域蛋白3 (NOD-like receptor pyrin domain containing3,NLRP3) 炎癥小體是目前研究最多的炎癥小體之一,其能激活胱冬肽酶-1(caspase-1),進而對白細胞介素(IL) -1 家族細胞因子的加工及成熟發揮促進作用[6]。有研究發現,在膽囊纖維化患者的支氣管上皮細胞和巨噬細胞中PA 能夠激活NLRP3 炎癥小體,但PA 感染人巨噬細胞炎癥小體的激活情況及炎癥對PA 感染的清除機制鮮有報道[7]。Toll 樣受體(Toll-Like receptors,TLRs) 是Ⅰ型跨膜蛋白,是一類保守的模式識別受體 (pattern recognition receptor,PRR),可通過識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs) 而激活下游的核因子κB (nuclear factor κB,NF-κB) 信號通路,調控多種炎癥介質和細胞因子的表達,啟動針對病原體的天然免疫和獲得性免疫[8]。有研究發現[9],TLR4在肺部感染發生時被激活,從而對肺內成纖維細胞中脂多糖誘導的促炎細胞因子的產生發揮促進作用,因此猜測TLR4/NF-κB 信號通路引發的過度炎癥可能是導致PA 感染死亡的重要原因。因此,本研究旨在探究NLRP3 對PA 的清除作用及TLR4/NF-κB 信號通路能否成為NLRP3 影響PA 清除的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

銅綠假單胞菌 (招遠拓普生物工程有限公司);人單核細胞系THP-1 細胞(ATCC 公司);佛波酯(PMA) (美國Sigma 公司);淋巴細胞分離液(中國TBD sciences 公司);CD14 磁珠(美國BD 公司);人重組細胞因子M-CSF (美國Peprotech 公司);ELISA 試劑盒(美國BD 公司);Trizol 試劑、TLR4 干擾RNA (si-TLR4)、TLR4 激活劑LPS (美國Invivogen 公司);TLR4 抗體、p-NFκB P65 抗體 (美國Invivogen 公司);PCR 引物(上海生工合成);PCR 儀(Gene Inc 公司)。

1.2 細胞培養

取THP-1 細胞,將PMA 加入到THP-1 細胞中誘導分化為巨噬細胞,16 h 后將巨噬細胞置于含10 %胎牛血清和雙抗的完全DMEM 培養基中培養,將培養基置于恒溫培養箱中培養,設置培養箱條件為37 ℃、5 % CO2。收集生長良好的巨噬細胞接種于24 孔板中,用PA 刺激巨噬細胞24 h,隨后收集細胞上清液,用于后續實驗。

1.3 人外周血巨噬細胞的分離培養

在人外周抗凝血中加入等體積的培養基,充分混勻后,將淋巴細胞分離液按照1∶2 的比例加入到人抗凝外周血中,在20 ℃環境,以1 800 r/min 的速度離心人抗凝外周血30 min,分離血細胞。將位于中間的單核細胞層收集于離心管中,加入PBS溶液,在4 ℃環境,離心機1 500 r/min 速度離心10 min,PBS 洗滌細胞2 次后,收集細胞沉淀。將CD14 磁珠加入到細胞沉淀中,分選出的人單核細胞并培養,置于含10 %胎牛血清的DMEM 培養基上,并加入100 ng/mL 的人重組細胞因子M-CSF,根據細胞計數結果進行鋪板,培養于37 ℃環境中。第3 天換液,7 d 后誘導呈巨噬細胞備用。用PA刺激巨噬細胞24 h,隨后收集細胞上清液,用于后續實驗。

1.4 細胞培養及感染菌液制備

使用前,將PA 接種于假單胞菌瓊脂平板,在常規的培養箱中培養,設置溫度恒定37 ℃;使用時挑取單菌落,并接種于LB 培養基中,將培養基置于恒溫搖床上,37 ℃、200 r/min 的條件下培養12 h,梯度稀釋菌液,直至菌液終濃度為109CFU/mL 備用;使用時以MOI=5 感染細胞,即感染時1 個細胞對應5 個細菌。

1.5 ELISA 檢測細胞中IL-1β、IL-8 水平

收集細胞培養上清液,按照ELISA 試劑盒說明書檢測細胞上清液中IL-1β、IL-8 水平。

1.6 RT-PCR 檢測細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達

取THP-1 巨噬細胞和hMDMs,用PA 刺激巨噬細胞24 h,后用Trizol 裂解細胞并提取細胞中總RNA,提取步驟按照試劑盒說明書進行。逆轉錄總RNA 為cDNA,操作步驟按照試劑盒說明書操作。NLRP3 上游引物5′-CAGCGATGAAGACGCGAGAG-3′,下游引物5′-AGAGATATGGCACGAAAGCTATCCA-3′;caspase-1 上游引物5′-ACTGCTACACCTGTTGCGCCTCA-3′,下游引物5′-CTGCCGACGCAGGAAATTC-3′;GAPDH上游引物5′-CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游引物GGCATGGACTGTGGTCATGA。瞬時離心引物,加入去離子水,充分混勻并制成100 μmol/L 的貯存液;把上游、下游引物稀釋成終濃度10 μmol/L 的溶液。PCR 反應條件: 95 ℃預變性3 min;95 ℃變性10 s;60 ℃退火30 s;共計40 個循環。用2-△△CT法分析表達量。

1.7 蛋白質印跡檢測細胞中TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達

蛋白裂解液充分提取各組THP-1 巨噬細胞和hMDMs 總蛋白,DAB 法檢測細胞中蛋白濃度。配置等濃度蛋白溶液為2 μg/mL,按照6∶1 的比例加入相應的體積的蛋白負載緩沖液,煮沸溶液10 min后保存蛋白溶液于-20 ℃的冰箱。取蛋白樣品30 μg,電泳蛋白樣品后轉移到PVDF 膜上,加入5 %的脫脂奶粉到PVDF 膜上,封閉PVDF 膜1 h,分別加入一抗(1∶1 000),在4 ℃環境中孵育一抗過夜,后清洗PVDF 膜,加入相應的二抗 (1 ∶1 000),室溫孵育二抗2 h。將ECL 發光劑加入到細胞中曝光,用顯影液顯影,用Image Lab 軟件分析各條帶灰度值。

1.8 小RNA 干擾實驗及PA 感染

按照轉染試劑LipofectamineTM2000 說明書,分別將si-NLRP3 及陰性對照si-NC、si-TLR4 轉染到THP-1 巨噬細胞和人單核細胞來源巨噬細胞(hMDMs) 中,分別設為si-NC 組、si-NLRP3 組和si-TLR4 組。將各組THP-1 巨噬細胞和hMDMs 加入到銅綠假單胞菌中共孵育1 h,后進行后續實驗。

1.9 細菌平板計數實驗

取THP-1 巨噬細胞和hMDMs 加入PA 共孵育1 h后,更換含300 μg/mL 慶大霉素的培養基培養30 min,以清除胞外菌;將孔板用PBS 溶液清洗干凈,后將0.1 % TritonX-100 加入到孔板中,將孔板置于冰上裂解10 min,待細胞充分裂解并釋放出大量的細菌,梯度稀釋細胞裂解液,在PA 平板上將細胞均勻的涂布,每個稀釋濃度設置3 個平板;將平板置于37 ℃環境中過夜,次日對平板菌落計數。細胞清除率=[CFU (1 h) -CFU (2 h)]/CFU (1 h) ×100 %。

1.10 統計學分析

實驗數據采用Graphpad priam 8.0 軟件進行統計學分析。計量資料均用均數±標準差() 表示。不同組間數據采用單因素方差(one-wayANOVA) 分析,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,實驗結果以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PA 感染巨噬細胞后IL-1β、IL-8 水平比較

PA 感染的THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 上清液中IL-1β、IL-8水平明顯增加(P＜0.05) (圖1)。和si-NC 組相比,THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 沉默NLRP3 和TLR4 后的si-NLRP3 和si-TLR4 組上清液中IL-1β、IL-8 表達水平明顯降低(P＜0.05),且si-NLRP3 和si-TLR4 組上清液中IL-1β、IL-8 表達水平相比無統計學意義(P＞0.05) (圖2)。

圖1 PA 感染巨噬細胞后IL-1β、IL-8 表達比較

圖2 巨噬細胞沉默NLRP3 和TLR4 后上清液中IL-1β、IL-8 表達比較

2.2 PA 感染巨噬細胞后NLRP3 和caspase-1 mRNA 表達比較

PA 感染的THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達明顯升高(P＜0.05) (圖3)。

圖3 PA 感染巨噬細胞后NLRP3 和caspase-1 mRNA 表達比較

與si-NC 組比較,THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 沉默NLRP3 和TLR4 后的si-NLRP3 和si-TLR4 組細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達明顯地降低(P＜0.05),并且si-NLRP3 和si-TLR4 組細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達相比較無明顯的差異 (P＞0.05)(圖4)。

圖4 巨噬細胞沉默NLRP3 和TLR4 后細胞中NLRP3 和caspase-1 mRNA 表達比較

2.3 PA 感染巨噬細胞后TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達比較

PA 感染的THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 中TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達明顯增加(P＜0.05) (圖5、圖6A)。和si-NC 組相比,THP-1 誘導分化的巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 沉默NLRP3 和TLR4 后的si-NLRP3 和si-TLR4 組細胞中TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達明顯降低(P＜0.05),且si-NLRP3和si-TLR4 組細胞中TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達相比無明顯差異(P＞0.05) (圖6B、圖7)。

圖5 PA 感染巨噬細胞后TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達比較

圖6 巨噬細胞中TLR4、p-NF-κB P65 蛋白表達

2.4 細胞清除率比較

和si-NC 組相比,沉默PA 感染的THP-1 巨噬細胞和原代人單核來源巨噬細胞hMDMs 中NLRP3 和TLR4 表達細胞清除率明顯增加(*P＜0.05) (圖8)。

圖8 沉默NLRP3 和TLR4 抑制銅綠假單胞菌的清除

3 討論

PA 是燒傷科及院內感染的一種常見病原體,可通過感染不同部位引發多種嚴重癥狀的發生,包括肺炎、腦膜炎、心肌炎等[10]。由于PA 的細胞膜通透性較差,導致多數的抗生素在菌體內不能發揮很好的療效,因此臨床上用抗生素治療銅綠假單胞菌感染性疾病的效果并不理想[11]。目前關于PA 導致炎癥及感染發生的機制鮮有報道,因此,本研究旨在探究PA 誘導巨噬細胞分泌炎癥因子的具體機制,為臨床研發新藥物提供更多的實驗依據,對臨床治療感染PA 所致疾病尤為重要。

NLRP3 作為固有免疫系統重要組成部分的炎癥小體,其在髓樣細胞中廣泛表達,包括中性粒細胞和單核巨噬細胞等,且能識別細胞、病毒等病原體及LPS 等危險信號分子[12]。在巨噬細胞中,NLRP3 炎癥小體的表達是感染性疾病的典型特征[13]。研究發現,NLRP3 炎癥小體可由環境刺激物、內源性危險信號以及致病菌如PA 等激活,進而通過促進炎癥小體的集合而分泌大量的炎癥細胞因子[14]。本研究通過培養THP-1 誘導分化的巨噬細胞及原代人單核來源巨噬細胞hMDMs,并用PA 感染THP-1 和hMDMs 發現,巨噬細胞中NLRP 和caspase-1 的相對表達明顯增加,且會分泌大量的IL-1β 和IL-8。有研究發現,IL-1β 是目前研究最關鍵的免疫調節及促炎細胞因子,其不僅可被caspase-1 加工,還能被炎癥小體所激活[15]。在單核細胞分化過程中,IL-1β 可通過促進分化為M1樣巨噬細胞而促進B 淋巴細胞的增殖和分化。由此可見,IL-1β 可能參與PA 的免疫應答過程,并且還能對炎癥小體的激活發揮促進作用。有學者通過對感染銅綠假單胞菌的肺炎研究發現,機體內IL-1β 和IL-18 水平增加會減弱對PA 的殺傷力[16];還有學者研究發現,當小鼠caspase-1 缺陷時,PA感染的小鼠眼部炎癥和角膜荷菌量明顯減少[17]。本研究通過進一步轉染沉默si-NLRP3 發現THP-1和hMDMs 細胞上清液中IL-1β 和IL-8 水平降低,同時抑制細胞中NLRP3 和caspase-1 表達,增加對PA 的清除率。因此提示NLRP3 炎癥小體的激活有可能是PA 逃避免疫殺傷的策略,但其具體的機制尚不清楚。

在固有免疫應答中,TLRs 是重要的蛋白調控分子之一,激活TLRs 可和特異性免疫及非特異性免疫應答相連接[18]。TLR4 是TLRs 家族成員之一,其可對革蘭陰性菌的脂多糖進行識別,進而通過激活不同的信號通路對促炎細胞因子的分泌發揮誘導作用。本研究結果顯示,PA 感染巨噬細胞THP-1和hMDMs 后,細胞中TLR4 的表達明顯增加,猜測在PA 激活炎癥反應時TLR4 是主要受體。當細胞膜上的TLR4 和PA 相結合時會激活NF-κB 信號傳導通路,進而對細胞炎癥因子的基因轉錄及蛋白表達發揮調節作用。Lee 等[19]研究發現,用PA 感染肺上皮細胞后會激活NF-κB 信號通路,進而介導炎癥的發生發展;還有學者研究發現[20],不同濃度的PA 刺激U937 后可激活NF-κB 信號通路,進而對炎癥因子IL-8 的產生發揮促進作用。本研究結果顯示,PA 感染巨噬細胞THP-1 和hMDMs后,NF-κB 信號傳導通路的P65 蛋白被磷酸化,且蛋白表達明顯增加,由此提示,在PA 感染巨噬細胞時TLR4 及其下游因子在引發炎癥反應中發揮重要作用,可能是幫助NLRP3 激活時PA 逃避免疫殺傷策略的機制之一。本研究通過進一步轉染沉默si-TLR4 時發現THP-1 和hMDMs 細胞上清液中IL-1β 和IL-8 水平降低,抑制細胞中NLRP3 和caspase-1 表達及TLR4 和P65 表達,增加對PA 的清除率,提示抑制PA 感染巨噬細胞中TLR4/NFκB 的激活,可能是增加巨噬細胞對PA 殺傷的機制。

綜上所述,沉默NLRP3 可增加巨噬細胞對銅綠假單胞菌的清除作用,其作用機制可能和抑制TLR4/NF-κB 信號通路激活有關。由于時間和成本等因素,本研究尚未對活化的TLR4/NF-κB 信號通路能都影響巨噬細胞對PA 殺傷作用進行研究,使研究結果存在一定局限性。在今后的研究中,會增加激活TLR4/NF-κB 信號通路及作用于其它下游分子的研究,為臨床治療感染PA 所致的疾病提供更多的實驗數據。