Fam172a 基因敲除加劇非酒精性脂肪性肝病的機制研究

李夢綺 ,韋何銳 ,安穩 ,羅婧 ,何玲玲 ,楊君茹 ,肖凡,魏紅山,Δ

1首都醫科大學附屬北京地壇醫院消化科 北京市,100015

2北京大學地壇醫院教學醫院消化科 北京市,100015

3首都醫科大學附屬北京地壇醫院傳染病研究所,新發突發傳染病研究北京市重點實驗室 北京市,100015

4北京市感染性疾病研究中心 北京市,100015

5國家傳染病醫學中心,首都醫科大學附屬北京地壇醫院 北京市,10015

6傳染病溯源預警與智能決策全國重點實驗室 北京市,100015

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 是指從非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFL) 到非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH) 的一系列肝臟異常[1]。NASH 是NAFLD 嚴重的臨床形式,其特征是肝細胞脂質堆積、炎癥、損傷和凋亡,在極端情況下可進展為肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-3]。目前,NAFLD 已是全球最常見的慢性肝病,全球患病率約為25.24 %[4-7]。隨著過去二十年間中國居民生活方式的巨大改變,NAFLD 也已成為中國最常見的肝臟疾病,全國患病率約為29.2 %,但卻未得到足夠的重視[8]。

NAFLD 的發病機制和臨床表現均具有高度異質性[9],其致病途徑包括: 內質網應激、脂質代謝紊亂、氧化應激、胰島素抵抗、炎癥、纖維化、自噬和細胞凋亡等[10]。目前NAFLD 的發病機制仍未完全闡明,但隨著研究的深入,越來越多研究表明內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)對NAFLD 的發病與進展至關重要,其可通過誘導肝臟胰島素抵抗、脂質積累、炎癥和肝細胞凋亡來參與NAFLD 的發生發展[11-14]。

Fam172a基因,又名C5orf21,位于染色體5 q15,由李連喜團隊首次發現并克隆,該基因在許多組織中正常表達(在脂肪和主動脈組織中的表達量最高)[15-16]。FAM172A 蛋白在小鼠與人類中具有高度同源性,均含有4 個功能區域: Arb2 樣結構域(domain homologous to yeast argonaute-binding protein 2,Arb2 like domain)、絲氨酸水解酶基序(esterase-like serine hydrolase motif,Ser hydrolase)、C 端內質網駐留信號肽(endoplasmic reticulum retention signal,ER signal) 和核定位信號肽(nuclear localization signal,NLS)[17]。由 于Fam172a基因是一個新發現的基因,功能尚不明確,因此目前針對該基因的研究主要涉及動脈粥樣硬化、腫瘤及基因轉錄后水平調控等方面[17-19]。本課題組在前期研究中成功制備了Fam172a基因敲除(Fam172a-/-) 小鼠[20],并通過研究發現Fam172a基因敲除可加重內質網應激誘導的NAFLD[21]。然而,Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD 中的作用機制尚未明確,本文通過衣霉素(tunicamycin,TM) 誘導的野生型(wild type,WT) 小鼠和Fam172a基因敲除(Fam172a-/-)小鼠ERS 模型研究了Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD 中潛在的作用機制[21]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型(wild type,WT) 小鼠采用購自于北京華阜康生物科技有限公司的C57BL/6J 背景的小鼠。Fam172a基因敲除(Fam172a-/-) 小鼠由中國南京大學動物模型研究中心利用C57BL/6J 背景的小鼠構建,基因敲除方法參照相關文獻[20]。選取 6～8 周齡的雄性野生型 (WT) 和Fam172a-/-小鼠進行科學研究。所有小鼠均在標準條件(環境溫度20 ℃～25 ℃和環境濕度50 %～60%) 下飼養,自由進食、飲水并定期更換鼠籠和墊料。所有動物實驗均由首都醫科大學實驗動物學系及首都醫科大學附屬北京地壇醫院動物保護與使用委員會批準。

1.2 藥物與試劑

衣霉素(tunicamycin,TM)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑Ⅰ、磷酸酶抑制劑Ⅱ、NF-κB 抑制劑DHMEQ (美國MCE 公司),組織/細胞甘油三酯測定試劑盒、RIPA 裂解液、一抗稀釋液(中國普利萊公司),血漿丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒、血漿天冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(中國邁克生物有限公司),5 × 蛋白上樣緩沖液(含DTT)(北京索萊寶公司美國),PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒、PageRulerTM預染蛋白分子量標準、20 ×SDS 電泳緩沖液、蛋白預制膠 (美國Thermo 公司),甘氨酸(中國索萊寶公司),Tween (中國GPC 生物公司),脫脂奶粉(美國BD 公司),β-Actin 抗體、pNF-κB 抗體、NF-κB 抗體 (美國CST 公司),CHOP 抗體、GRP78 抗體(美國Proteintech 公司),山羊抗小鼠IgG 辣根過氧化物酶抗體、山羊抗兔IgG 辣根過氧化物酶抗體(中國中杉金橋公司),化學發光液(中國美侖生物公司),非變性組織/細胞裂解液 (中國索萊寶公司),胎牛血清 (美國Gibco 公司),多聚甲醛(4 %) (中國塞維爾公司),Tris·HCl 粉末牛血清白蛋白(美國Sigma 公司),Protein A/G PLUSAgarose (美國Santa Cruz 公司),NaCl 粉末、無水甲醇(中國普利公司)。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機、低溫梯度離心機、96 孔酶標儀、實時熒光定量PCR 儀(ABI 7500) (Thermo公司),常溫高速離心機(艾本德公司),冰凍研磨機(賽維爾公司)、組織脫水機(TP1020)、組織包埋機(EG1160)、石蠟切片機(徠卡公司),倒置顯微鏡(蔡司公司),Tanon 發光成像工作站(天能科技有限公司),全自動生化檢測分析儀(Olympus 公司),超凈工作臺(蘇坤實業有限公司)。

1.4 動物分組與處理

C57BL/6J 雄性小鼠 (8 周齡,體重25.0 ±1.5 g) 20 只,隨機分為5 組,每組4 只,分別為WT-Control 組 (WT 小鼠腹腔注射1 mg/kg DMSO)、WT-TM 組 (WT 小鼠腹腔注射1 mg/kg TM)、Fam172a-/--Control 組 (Fam172a-/-小 鼠腹腔注射1 mg/kg 1 × PBS)、Fam172a-/--TM 組(Fam172a-/--小鼠腹腔注射 1 mg/kg TM)、Fam172a-/--TM+NF-κB 抑制劑 DHMEQ 組(Fam172a-/-小鼠同時腹腔注射1 mg/kg TM 和4 mg/kg DHMEQ)。造模24 h 后,麻醉小鼠,球后取血,然后處死小鼠,留取肝臟組織。

1.5 肝臟生物化學指標的檢測

使用Olympus AU 2700 全自動生化分析儀和相應的檢測試劑盒,檢測小鼠血漿的丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT) 和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST) 水平。

1.6 肝臟蘇木素&伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)

將留取的肝左葉固定于4 %多聚甲醛,脫水包埋后,于首都醫科大學附屬北京地壇醫院病理科進行切片(厚度為4 μm) 和HE 染色。

1.7 肝臟油紅O 染色

將留取的肝組織固定于4 %多聚甲醛,于北京塞維爾有限公司進行標本包埋和油紅O 染色。

1.8 蛋白質印跡實驗(Western blotting,WB)

肝組織加入RIPA 裂解液后利用冰凍研磨機充分裂解,將所得組織裂解液離心(4 ℃,12 000 r/min,10 min) 后取上清,上清液即為組織總蛋白原液,測定其蛋白濃度。取40～80 μg 變性總蛋白經預制膠電泳(濃縮膠: 80 V,分離膠: 120 V) 分離目的蛋白,轉膜(100 V,90 min) 并封閉(5 %脫脂奶粉,室溫1 h)。分別加入一抗GRP78 (1 ∶1 000)、p-NF-κB (1 ∶500)、NF-κB (1 ∶1 000)、CHOP (1∶1 000) 和β-Actin (1∶1 000) 于4 ℃孵育過夜,1 × TBST 洗膜10 min,重復3 次后,分別加入相應二抗(1 ∶5 000) 室溫孵育1 h,1 ×TBST 洗膜5 min,重復3 次后,顯色曝光。利用Image J 軟件對成像條帶進行灰度值分析,并利用GraphPad Prism 8.0 軟件對結果進行統計學分析并作圖。

1.9 統計學分析

所有實驗數據采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析及繪圖,計量資料均采用表示,且均要進行方差齊性檢驗和非參數檢驗,兩組獨立數據之間采用獨立樣本t檢驗,3組及以上數據采用單因素方差分析 (one-way ANOVA),P＜0.05 表示差異顯著具有統計學意義。

2 結果

2.1 Fam172a 基因敲除加重內質網應激誘導的NAFLD

為了對比TM 造模后WT 小鼠和Fam172a-/-小鼠肝功能的情況,我們對小鼠血清ALT 和AST水平進行檢測。結果如圖1 所示,在WT 小鼠中,與Control 組相比,TM 組小鼠的血清ALT 水平明顯升高(P＜0.01);在Fam172a-/-小鼠中,Control 組和TM 組小鼠的血清ALT 水平無明顯差異;無論是在TM 組還是Control 組,Fam172a-/-小鼠的血清 ALT 水平均較 WT 小鼠明顯升高(P＜0.01)。在WT 小鼠和Fam172a-/-小鼠中,與Control 組相比,TM 組小鼠的血清AST 水平均明顯升高(P＜0.05 或P＜0.01);無論是在TM 組還是Control 組,Fam172a-/-小鼠的血清AST 水平均較WT 小鼠明顯升高(P＜0.01)。

圖1 TM 造模后,各組小鼠血漿ALT 和AST 水平

為了進一步了解TM 造模后WT 小鼠和Fam172a-/-小鼠肝臟損傷和脂質堆積水平,我們對小鼠肝臟進行HE 染色、油紅O 染色。結果如圖2 所示,將WT 小鼠和Fam172a-/-小鼠的TM 組與Control 組兩兩進行比較,HE 染色結果提示在WT小鼠和Fam172a-/-小鼠中,與Control 組相比,TM 組小鼠肝臟氣球樣變、壞死和匯管區炎癥均明顯加重,Fam172a-/--TM 組小鼠較WT-TM 組加重更為顯著;肝臟油紅O 染色結果提示在WT 小鼠和Fam172a-/-小鼠的肝臟中,TM 組小鼠肝臟脂質堆積均較Control 組更明顯,且無論是在TM 組還是Control 組,Fam172a-/-小鼠肝臟脂質堆積均較WT 小鼠更為嚴重。以上結果表明,Fam172a基因敲除加重ERS 誘導的肝損傷和脂質堆積。

圖2 TM 造模后,各組小鼠肝臟炎癥和脂質堆積水平

為了研究Fam172a基因敲除影響TM 誘導的小鼠ERS 模型的分子機制,我們利用WB 方法檢測WT 和Fam172a-/-小鼠肝臟FAM172A 和ERS通路關鍵分子(GRP78 和CHOP) 的蛋白質水平。結果如圖3 所示,FAM172A 蛋白在Fam172a-/-小鼠肝臟中幾乎沒有表達,說明Fam172a-/-小鼠已成功敲除Fam172a基因;且在WT 小鼠中,TM 組較Control 組小鼠肝臟中的FAM172A 蛋白表達顯著上調(P＜0.01)。與Control 組相比,TM 組小鼠肝臟中的GRP78 和CHOP 表達水平均顯著上調(P＜0.05、P＜0.01)。Fam172a-/-小鼠與WT 小鼠相比,Control 組之間GRP78 和CHOP 表達水平無明顯差異,而Fam172a-/--TM 組的GRP78 和CHOP表達水平顯著高于WT-TM 組 (P＜0.05、P＜0.01)。以上結果表明,Fam172a基因敲除后會上調ERS 通路的關鍵分子。

圖3 TM 造模后,各組小鼠肝臟中FAM172A、GRP78 和CHOP 的表達情況

2.2 Fam172a 基因敲除活化NF-κB 通路

NAFLD 經典的“二次打擊假說” 認為肝臟炎癥可導致NAFLD 的進展,而NF-κB 是調節炎癥最重要的轉錄因子[2,22-23]。為了進一步探討Fam172a基因敲除對NF-κB 的影響,我們利用WB 方法檢測WT 和Fam172a-/-小鼠肝臟pNF-κB 和NF-κB的蛋白質水平。

結果如圖4 所示,在WT 小鼠中,與Control 組相比,TM 組小鼠肝臟中pNF-κB/NF-κB 的相對水平稍有增加,但無顯著性差異。在Fam172a-/-小鼠中,與Control 組相比,TM 組小鼠肝臟中的pNF-κB/NF-κB 的相對水平顯著上調(P＜0.01)。Fam172a-/-小鼠與WT 小鼠相比,Control 組之間pNF-κB/NF-κB 的相對水平無明顯差異,而Fam172a-/--Tm 組的pNF-κB/NF-κB 的相對水平顯著高于WT-Tm 組(P＜0.01)。

圖4 TM 造模后,各組小鼠肝臟中pNF-κB 和NF-κB 的表達情況

2.3 NF-κB 介導Fam172a -/- 小鼠中內質網應激誘導的NAFLD

為了研究Fam172a基因敲除是否通過NF-κB 來介導Fam172a-/-小鼠中內質網應激誘導的NAFLD,我們利用NF-κB 抑制劑DHMEQ 對Fam172a-/-小鼠進行處理,并檢測Fam172a-/--TM 組和Fam172a-/--TM+DHMEQ 組小鼠血漿的ALT、AST 水平。結果發現,與Fam172a-/--TM 組相比,Fam172a-/--TM +DHMEQ 組小鼠血漿的ALT 水平顯著降低(P＜0.05),AST 水平無明顯變化(圖5)。

圖5 Fam172a -/-小鼠TM 造模后,TM 組和TM+DHMEQ 組小鼠血漿ALT 和AST 水平

為了進一步了解NF-κB 抑制劑DHMEQ 處理對TM 造模后Fam172a-/-小鼠肝臟損傷和脂質堆積水平的影響,我們對Fam172a-/--TM 組和Fam172a-/--TM+DHMEQ 組小鼠肝臟進行H&E染色、油紅O 染色和肝臟TG 含量檢測。結果如圖6 所示,HE 染色結果提示與Fam172a-/--TM 組小鼠相比,Fam172a-/--TM +DHMEQ 組小鼠肝臟氣球樣變、壞死和匯管區炎癥明顯減輕;肝臟油紅O染色結果提示,Fam172a-/--TM +DHMEQ 組肝臟脂質堆積較Fam172a-/--TM 組改善。以上結果表明,急性ERS 模型中,NF-κB 抑制劑緩解了Fam172a基因敲除引起的肝損傷和脂質堆積的加重。

為了研究NF-κB 影響Fam172a-/-小鼠中ERS模型的分子機制,我們利用WB 方法分別檢測Fam172a-/--TM 組和Fam172a-/--TM+DHMEQ組小鼠肝臟ERS 通路關鍵分子(GRP78 和CHOP)的蛋白質水平。

結果如圖7 所示,與Fam172a-/--TM 組相比,Fam172a-/--TM+DHMEQ 組小鼠肝臟中的GRP78和CHOP 表達水平均顯著降低(P＜0.01),即NFκB 抑制劑可逆轉Fam172a基因敲除引起的ERS 通路關鍵分子的上調。

圖7 Fam172a -/-小鼠TM 造模后,肝臟中GRP78 和CHOP 的表達情況

3 討論

NAFLD 的發病機制復雜,經典的“二次打擊假說” 和“多重打擊假說” 體現了肝臟炎癥和內質網應激在NAFLD 發生發展中的重要作用[2,22,24]。近年來也有文獻報道了抑制肝臟炎癥和內質網應激可能是治療NAFLD 的有效策略[24-25]。本研究探討了Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD 中的潛在作用機制。實驗結果發現抑制NF-κB 通路可以通過減輕內質網應激來改善Fam172a基因敲除小鼠的NAFLD。

在本研究中,我們通過給小鼠腹腔注射TM 建立了ERS 模型。實驗結果發現TM 誘導的ERS 模型小鼠的肝臟中FAM172A 和ERS 通路關鍵分子(GRP78 和CHOP) 的蛋白表達水平均顯著升高,且在Fam172a-/-小鼠中升高更為明顯,因此Fam172a基因是ERS 誘導的NAFLD 損傷的負反饋調節因子,與本課題組前期結果一致[21]。

NF-κB 是一種與炎癥、自身免疫性疾病、細胞凋亡和腫瘤發生等過程有關的轉錄因子,在許多細胞中均有表達[23,25]。許多研究表明NF-κB 可通過調控肝臟炎癥促進NAFLD 的進展[2,25-27]。由于Fam172a基因敲除和NF-κB 均可促進NAFLD 的進展,我們推測Fam172a基因和NF-κB 之間可能存在某種聯系。有文獻報道ERS 可以通過多種機制激活NF-κB 通路引起炎癥反應,且ERS 可以通過激活NF-κB 通路來影響NAFLD 的進展[12,24,28]。因此本研究假設Fam172a基因敲除通過活化NF-κB通路加重ERS 誘導的NAFLD。為了探究Fam172a基因敲除對NF-κB 的影響,我們利用WB 方法檢測WT 和Fam172a-/-小鼠肝臟pNF-κB 和NF-κB的蛋白質水平。實驗結果顯示,在Fam172a-/-小鼠中,TM 誘導的ERS 模型小鼠肝臟中pNF-κB/NF-κB 的相對水平顯著升高。該實驗結果表明,NF-κB 是Fam172a 的下游靶分子。2022 年明 少雄[29]報道了草酸鹽可通過ERS-ROS-NF-κB 信號通路誘導腎小管上皮細胞凋亡,且NF-κB 信號通路被抑制時,ERS-ROS 通路也被抑制,說明ERS 通路和NF-κB 通路之間存在正反饋循環。董曉飛[30]同樣報道了NF-κB 抑制劑QNZ 可以抑制ERS 和NF-κB信號轉導。由此看來,抑制NF-κB 通路能夠有效地抑制ERS。由此本研究進一步假設抑制NF-κB 通路可以減輕ERS 誘導的NAFLD。為了驗證這一猜想,本研究利用NF-κB 抑制劑DHMEQ 處理Fam172a-/-小鼠,實驗結果顯示在Fam172a-/-小鼠中,經DHMEQ 處理后的TM 造模小鼠肝臟的NAFLD 相關表型顯著改善,ERS 通路關鍵分子(GRP78 和CHOP) 的表達水平也顯著降低。以上結果證實,抑制NF-κB通路可以減輕Fam172a基因敲除誘導的NAFLD,其機制主要是抑制ERS。

本課題組前期研究發現,Fam172a基因敲除可加重ERS 誘導的NAFLD,而本文則重點研究了Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD 中的潛在作用機制。本文首次證明了NF-κB 是Fam172a基因的下游靶分子,并通過NF-κB 將肝臟炎癥和ERS 這兩個NAFLD 關鍵發病機制結合在一起。

本研究發現Fam172a基因可以調控NF-κB 通路,但其具體的調控機制還未明確,我們將在下一步的實驗中繼續完善該機制的研究。此外,Fam172a基因除了調控ERS 通路外是否還會對其他NF-κB 下游通路造成影響也是我們需要進一步探究的問題。

綜上,本文的研究結果表明Fam172a基因敲除可通過活化NF-κB 通路來加重ESR 誘導的NAFLD。本文只在動物水平研究了Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD 中的作用機制,后續我們還將利用TM 建立HepG2 細胞系(Fam172a基因高表達和低表達) 的ERS 模型,在細胞水平進一步驗證Fam172a基因敲除在ESR 誘導的NAFLD中的作用機制。