miR-200c 靶向ZEB1 調控宮頸癌細胞的增殖和凋亡

馮寶菊,江英,呂?？?/p>

武漢市紅十字會醫院急診科 武漢市,430015

宮頸癌是女性第四類常見惡性腫瘤,全球每年新發病例約60 萬例,死亡病例超過30 萬人[1]。盡管在宮頸癌的治療上不斷有所突破,但研究證實其總體5 年生存率仍不容樂觀[2]。因此,亟需探索新的潛在的治療措施及方案。越來越多的研究證實了microRNA (miRNA) 在腫瘤發生發展中的作用[3-4]。miRNA 是一類內源性的非編碼RNA,可以在轉錄后水平上抑制大多數蛋白編碼基因的表達[3]。另外,miRNA 還能以堿基互補模式與mRNA 的非翻譯區相互作用,直接抑制其翻譯或靶向降解[5]。已證實miRNA 在調節真核生物中重要的生物學和生理過程,其異常表達與包括癌癥在內的多種疾病密切相關[3,5]。近年來,miRNA 被報道也可以參與腫瘤微環境中腫瘤細胞與其他間質細胞的相互作用,影響腫瘤免疫微環境的功能進而促進或抑制惡性腫瘤的發生發展[6]。研究表明,多種miRNA 與宮頸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等密切相關,且被認為是宮頸癌診斷、治療和預后評估的新靶點[7]。既往研究已證實,miR-200c 在胃癌組織中低表達,其過表達可通過抑制TGF-β信號通路抑制上皮-間質轉化過程,進而抑制腫瘤的侵襲轉移[8]。在女性生殖系統中,miR-200c 已被報道可通過靶向調控Neuropilin 1 的表達顯著增強奧拉帕尼對耐藥卵巢癌細胞的抗腫瘤作用[9];此外,miR-200c 可通過上調PAI-2 的表達和促進M2 型巨噬細胞極化促進三陰性乳腺癌的惡性進展[10]。然而在宮頸癌中,僅有一項研究報道miR-200c 通過靶向MAP4K4 抑制宮頸癌細胞的轉移和生長[11],關于miR-200c 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及其潛在機制仍需研究?；诖?本研究擬通過臨床樣本檢測和細胞實驗探究miR-200c 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及具體分子機制,以期為宮頸癌的預防和臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織收集

收集2020 年1 月至2020 年12 月在我院婦科接受手術治療的52 例宮頸癌患者的癌組織及鄰近正常組織,所有組織均經臨床病理活檢證實,所有患者術前均未接受放射治療或化學治療。宮頸癌分期標準參照2014 年FIGO 分期標準。手術過程中對所有組織進行取樣,液氮罐中保存。本研究經武漢市紅十字會醫院醫學倫理委員會審批,所有患者/家屬均已簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)

從液氮灌中取出凍存組織或收集轉染的細胞,Trizol 法提取總RNA。利用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit 進行miRNA 的逆轉錄反應,再采用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit 進行miRNA 的RT-qPCR 反應;利用逆轉錄試劑盒(TaKaRa,日本) 進行mRNA 的逆轉錄反應,再采用SYBR-Green PCR Mix (TaKaRa,日本) 進行mRNA 的RT-PCR 反應。以U6 或GAPDH為內參。ZEB1 基因引物為: 5′-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3′ 和 5′-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3′;miR-200c的引物為: 5′-TAATACTGCCGGGTAATGATGGA-3′ 和 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6 的引物為: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ 和U6-R 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH的引物為: 5′-CACTGGGCTACACTGAGCAC-3′和5′-AGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。

1.3 蛋白質印跡

從液氮灌中取出凍存組織,研磨成組織勻漿,每管組織液中加入預冷的80～100 μL 新鮮配置的裂解液,超聲處理1 min 后低溫離心機12 733 r/min 離心30 min,將上清轉移至新的EP 管中,利用BCA 試劑盒(Beyotime Biotechnology,上海) 測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 膠(Servicebio,武漢) 分離目標蛋白,再將其轉印至PVDF 膜上,經5 %脫脂奶粉封閉后,使用一抗稀釋液稀釋抗體(ZEB1、GAPDH 均來自于美國proteintech 公司) 后孵育PVDF 膜,4 ℃過夜;經TBST 洗滌后,使用二HRP 標記的二抗孵育PVDF 膜,再次經TBST 洗滌后,采用ECL 化學發光試劑(Servicebio,武漢) 進行顯色,Bio-Rad 化學發光成像儀(Bio-rad,美國) 獲取圖片,用Image J 軟件評估蛋白的表達水平。

1.4 細胞培養與轉染

人宮頸癌細胞系(HeLa、C33A 和HT3) 和原代正常宮頸鱗狀細胞(NCSC) 均購自中國科學院細胞庫(上海)。所有細胞均培養于含有10 %胎牛血清(FBS) (Invitrogen,美國) 的RPMI-1640培養基(Sigma-Aldrich,美國) 中,在37 ℃、含5 % CO2的培養箱中培養。miR-200c 模擬物、抑制物及相應對照均由上海吉瑪公司合成和純化。轉染前一天,將細胞接種在6 孔板上,并加入2 mL 含10 % FBS 的培養基。待細胞融合率達70 %時,使用Lipofectamine 3000 體系轉染miR-200c 模擬物、抑制物或正常對照轉染細胞,37 ℃、5 % CO2培養箱中下培養24～48 h,收集細胞,RT-PCR 檢測各組miR-200c 的表達,蛋白質印跡法檢測靶基因的表達。

1.5 CCK8 實驗

通過CCK8 試劑盒(Servicebio,武漢) 測量宮頸癌細胞的增殖情況。簡單步驟如下: 將宮頸癌細胞接種到96 孔板中,經Lipofectamine 3000 轉染后在37 ℃下孵育,在轉染后24、48 和72 h 使用CCK8 試劑盒檢測進行檢測。使用Spectra 酶標儀(BioTek,美國) 測量450 nm 的吸光度以評估細胞增殖水平。

1.6 Annexin V 實驗

在使用miRNA-200c 模擬物或抑制物轉染宮頸癌細胞后,使用FITC Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒(DOJINDO,日本) 通過流式細胞儀檢測上述細胞的凋亡水平。簡單步驟如下: 將宮頸癌細胞接種到24 孔板中,經Lipofectamine 3000 轉染后在37 ℃下孵育,轉染后24 h 收集上述細胞,4 ℃避光染色10 min,加入緩沖液,流式細胞儀 (FACSCantoⅡ,BD 公司,美國) 在10 min 內進行檢測。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

使用mirTarBase、targetScan 和miRDB 預 測miR-200c 的靶基因。使用Easy Mutagenesis System試劑盒構建wt-ZEB1-3′UTR 和mut-ZEB1-3′UTR 質粒。將HT3 細胞接種到6 孔板中,使用Lipofectamine 3000 將miR-200c 模擬物或模擬物對照與wt-ZEB1-3′UTR 或mut-ZEB1-3′UTR 質粒進行共轉染,并利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega,美國) 檢測其熒光素酶活性,具體操作步驟根據說明書進行。

1.8 統計學方法

使用SPSS 22.0 (SPSS Statistics,美國) 進行統計分析。正態分布數據表示為平均值±標準差,并使用獨立樣本/配對樣本t檢驗進行分析;以例數(n) 表示計數資料,利用卡方檢驗進行統計學分析。通過Pearson 相關檢驗分析宮頸癌組織中miR-200c 表達與ZEB1 mRNA 表達的相關性。P＜0.05 被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織中miR-200c 的表達水平

我們首先利用RT-qPCR 檢測52 例患者宮頸癌組織及癌旁組織中miR-200c 的表達,結果顯示,與癌旁組織相比,宮頸癌組織中miR-200c 的表達水平顯著降低(圖1)。根據癌組織中miR-200c 表達的中位值,我們將宮頸癌患者分為低表達組(n=26) 和高表達組(n=26),結果發現,miR-200c低表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、淋巴脈管浸潤及FIGO 分期密切相關 (P均＜0.05),而與患者年齡和腫瘤大小無關 (P均＞0.05) (表1)。

表1 宮頸癌組織中miR-200c 表達與患者臨床病理特征的關系(n=52)

圖1 miR-200c 在宮頸癌和對應癌旁組織中的表達水平

2.2 miR-200c 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

為了探索miR-200c 對宮頸癌細胞的調控作用,我們選擇宮頸癌細胞系進行后續研究。我們利用RT-PCR 檢測了NCSC 及幾種宮頸癌細胞系中miR-200c 的表達水平。結果顯示,miR-200c 在NCSC中的表達水平顯著高于宮頸癌細胞(P均＜0.05);而在宮頸癌細胞系中,HeLa 細胞miR-200c 的表達最高,而HT3 細胞miR-200c 的表達水平最低(圖2A),因此在后續實驗中,我們分別在HeLa 細胞中轉染miR-200c 抑制物,在HT3 細胞中轉染miR-200c 模擬物,對miR-200c 進行功能喪失和功能獲得實驗。結果顯示,miR-200c 模擬物顯著上調HT3 中miR-200c 的表達,而miR-200c 抑制物顯著下調miR-200c 在HeLa 中的表達(圖2B)。同時,我們利用CCK8 檢測了轉染細胞的增殖水平,利用Annexin V 實驗檢測了轉染細胞的凋亡水平。結果顯示,與miR-對照相比,miR-200c 模擬物顯著抑制HT3 細胞的增殖能力(圖2C),而miR-200c 抑制物顯著促進HeLa 細胞的增殖水平(圖2D);miR-200c 模擬物顯著增加HT3 細胞的凋亡水平(圖2E),而miRNA-200c 抑制物顯著降低HeLa 細胞的凋亡水平(圖2F)。

圖2 miR-200c 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

2.3 miR-200c 通過靶向ZEB1 影響宮頸癌細胞的增殖和凋亡

為了明確miR-200c 如何參與調控宮頸癌細胞的增殖和凋亡,我們首先利用miRTarBase、TargetScan 和miRDB 數據庫進行生物信息學分析。結果發現,ZEB1 是miR-200c 潛在的下游靶基因,miR-200c 與ZEB1 mRNA 的3′UTR 存在結合位點(圖3A)。為了明確ZEB1 是否是miR-200c 的靶基因,我們進行了熒光素酶報告基因試驗,結果發現,與模擬物對照相比,miR-200c 模擬物和wt-ZEB1-3′UTR 質粒共轉染顯著降低HT3 細胞的熒光素酶活性,而miR-200c 模擬物和mut-ZEB1-3′UTR質粒共轉染時,則沒有此效應(P＜0.01,圖3B)。為了進一步證實miR-200 對ZEB1 的靶向作用,我們檢測了miR-200c 模擬物或抑制物轉染的宮頸癌細胞中ZEB1mRNA 和蛋白質表達水平。結果表明,miR-200c 模擬物顯著降低HT3 細胞中ZEB1 的mRNA 和蛋白質表達水平,而miR-200c 抑制物顯著上調HeLa 細胞中ZEB1 的mRNA 和蛋白水平(圖3C、D)。此外,我們比較了癌組織和癌旁組織中ZEB1 的表達水平,發現癌組織中ZEB1 mRNA 表達水平顯著增加(圖3E)。相關性分析結果表明,miR-200c 與ZEB1 mRNA 的表達水平呈顯著負相關關系(r=-0.614,P=0.001,圖3F)。以上結果證實,miR-200c 可以靶向調控宮頸癌細胞中ZEB1的表達。

圖3 miR-200c 靶向調控宮頸癌中ZEB1 的表達

2.4 ZEB1 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

為了明確ZEB1 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響,我們分別用siRNA (si-ZEB1) 敲低HT3 細胞和質粒(p-ZEB1) 過表達HeLa 細胞中的ZEB1。蛋白質印跡結果證實,si-ZEB1 顯著降低HT3 細胞中ZEB1 蛋白水平(圖4A),而p-ZEB1 顯著增加HeLa 細胞ZEB1 的蛋白表達水平(圖4B)。接下來,我們利用CCK8 和Annexin V 實驗分析了ZEB1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響。結果證實,與對照相比,si-ZEB1 顯著抑制HT3 細胞的增殖水平(圖4C),而p-ZEB1 顯著增加HeLa 細胞的增殖情況(圖4D);si-ZEB1 顯著促進HT3 細胞的凋亡水平(圖4E),而p-ZEB1 則抑制了HeLa 細胞的凋 亡(圖4F)。

圖4 ZEB1 對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

宮頸癌是世界上嚴重危害婦女生命和健康的惡性腫瘤之一,復發和轉移是宮頸癌治療失敗的主要原因[2]。因此,宮頸癌嚴重影響了女性的生活和健康。miRNA 芯片數據表明,宮頸癌組織和細胞系中存在多種異常表達的miRNA,這些異常表達的miRNA 影響宮頸癌的發生和發展。例如,miR-203 和miR-125b 可以調控HPV 病毒的DNA 的復制過程[12]。miR-34a 和miR-125b 還可以通過調節HPV 的表達,從而促進宮頸癌的發生發展[13]。miR-200a 也可以影響宮頸癌的轉移,研究表明,宮頸癌中miR-200a 和miR-9 的表達水平可以預測患者的存活率[14]。miR-200 是抑制腫瘤的miRNA家族,包括miR-200a、miR-200b 和miR-200c,參與腫瘤的發生發展[15]。有研究證實,miR-200b 在上皮性卵巢癌中異常表達,血漿miR-200b 可作為早期診斷上皮性卵巢癌的分子標志物[16]。miR-200c 也在腫瘤發生發展中發揮重要作用,參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等諸多生物學過程。例如,miR-200c 可以抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移[17],同時miR-200c 在結直腸癌中的下調[18]。本研究結果顯示miR-200c 在癌組織中的表達低于癌旁組織,與Mei 等[11]的研究結果一致;細胞功能實驗證實,miR-200c 通過調控宮頸癌細胞的增殖與凋亡,從而參與宮頸癌的發生發展過程。

miRNA 通過與靶基因的3′-UTR 區域結合從而影響其表達,參與調控多種生理病理過程[4-5]。為了探索miR-200c 調節增殖、凋亡的分子機制,我們根據多個數據庫推測ZEB1 為其潛在的靶基因。ZEB1 作為鋅指E 同源盒結合轉錄因子,主要功能是調控上皮間質轉化(EMT) 過程[19]。近年的研究證實,ZEB1 的功能也不限于調節EMT 過程。有研究在非侵襲性腫瘤病變中觀察到ZEB1 表達,如原位胰腺腺癌或胰腺上皮內病變,證實ZEB1 是胰腺腫瘤發生早期步驟的關鍵驅動因素,可能與腫瘤的增殖和凋亡有關[20]。另外,有研究證實,ZEB1也是滋養細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和存活的關鍵,敲低滋養細胞中ZEB1 的表達可以通過Akt 信號通路影響其增殖、凋亡、遷移、侵襲和EMT 過程[21],而抑制ZEB1 的表達可促進細胞凋亡,并通過上調血管內皮生長因子A 的表達來促進血管生成活性[22]。因此,ZEB1 不僅可以促進細胞的侵襲和遷移,還可以改變其增殖、凋亡、成管等。既往研究表明,ZEB1 和P53 家族成員之間在增殖和細胞存活方面存在復雜的相互作用。除此之外,ZEB1 已被證明通過影響P53 和RB 依賴的抑制途徑來抑制腫瘤細胞的凋亡過程[23]。通過數據庫我們預測ZEB1 是miR-200c 的潛在靶標,而熒光素酶報告基因檢測也表明ZEB1 是miR-200c 的直接靶標。本研究證實miR-200c 可以負向調控ZEB1,兩者的表達水平在宮頸癌組織中呈負相關關系。另外,miR-200c 可以通過靶向ZEB1 的表達,調控宮頸癌細胞的增殖和凋亡過程,從而參與宮頸癌的發生。

綜上所述,本研究結果表明miR-200c 可通過靶向抑制ZEB1 表達調控宮頸癌細胞的增殖與凋亡,從而參與宮頸癌的發生發展。miR-200c/ZEB軸有望成為宮頸癌治療的潛在分子靶標。