豐富環境訓練結合頭穴叢刺對孤獨癥譜系障礙模型大鼠行為的影響

穆姿辰， 唐強， 史云秋， 王艷， 朱淑偉， 莊亞楠， 徐丹雙， 李宏玉， 李保龍,，張春艷,， 袁孟珂

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市 150001

0 引言

近年來，孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)發病率在全球范圍內呈上升趨勢。美國疾病預防控制中心最新研究顯示，美國8 歲兒童ASD 患病率已達到1/36[1]。

ASD 起病于嬰幼兒時期，以社交溝通和社交互動障礙，行為、興趣或活動模式重復、受限等異常行為為特征[2]，重復刻板行為和/或興趣狹窄是其核心癥狀[3]。其病因和病理機制仍未明確，也尚未有療效確切的治療方法[4]。對ASD 患兒社交能力和異常行為的改善有助于其參與社會生活，提升生活質量。

目前ASD異常行為模式的干預方法多采用感知治療、行為分析、音樂療法等一種或多種療法相結合的方式。豐富環境集觸覺、視覺、聽覺、運動和空間位置覺于一體，能夠改善ASD大鼠的社交能力，減少刻板行為[5]。

針灸尤其是頭穴叢刺一直被廣泛用于腦血管疾病的治療中[6]，近年來也逐漸被應用到抑郁、ASD 等疾病治療中[7]。

有研究表明，ASD 患兒的社交能力和情緒變化與白細胞介素(interleukin, IL)-6、IL-1β密切相關[8]。

本研究觀察豐富環境訓練結合頭穴叢刺對ASD大鼠行為學癥狀及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF 級健康成年Wistar 大鼠，其中雌性16只，體質量(250±10) g，雄性8只，體質量(290±10) g，均購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心(批號20210321)，實驗動物使用許可證號SYXK(黑)2020-004。大鼠飼養于黑龍江中醫藥大學腦功能與神經康復實驗室。飼養環境保持溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，自然晝夜節律變化光照，國家標準大鼠生長繁殖飼料飼養，自由飲用食水。本研究對動物的處理嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 模型制備及分組

適應性飼養1 周后，當日20:00 按雌雄比2∶1 進行合籠，次日晨8:00 進行陰道涂片，顯微鏡下觀察是否受精，將母鼠受精的當天記為妊娠第0.5 天。將受孕母鼠隨機分為對照組母鼠(n= 2)和實驗組母鼠(n=6)，參考Schneider 等[9]的方法建立動物實驗模型。實驗組在妊娠第12.5 天時腹腔注射丙戊酸鈉(valproic acid, VPA) 600 mg/kg，按250 mg/mL 溶解于0.9%氯化鈉溶液，對照組孕鼠同等時間注射同等劑量的氯化鈉溶液。子鼠出生當天記為1 d，選取雄性子鼠于生后7～21 d 持續進行生長發育學測試，評估造模是否成功。實驗組母鼠產下雄性后代即為孤獨癥行為異常模型鼠，隨機選出24 只分為模型組(n= 6)、豐富環境組(n= 6)、頭穴叢刺組(n= 6)和豐富環境結合頭穴叢刺組(n= 6)。對照組母鼠產下雄性后代即為正常大鼠，隨機選出6只作為對照組。

1.3 主要儀器和試劑

行為學檢測系統：Smart 3.0 行為學分析軟件。行為學檢測箱：哈爾濱道外區宏大有機玻璃經銷部。豐富環境訓練箱：哈爾濱振發有機玻璃廠。生物顯微鏡：日本NIKON 公司。臺式高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司。一次性無菌針灸針：直徑0.25 mm，長13 mm，蘇州華佗醫療器械有限公司。VPA： 美 國SIGMA-ALDRICH 生 物 公 司。 IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒：北京誠林生物公司(批號E-30644；E-30418)。

1.4 干預方法

對照組和模型組不進行任何干預，給予同等條件活動。其他3 組在生后第21 天開始干預。每天1 次，每周6 d，共4周。

豐富環境組置于豐富環境訓練籠中1 h。參照Nithianantharajah 等[10]將豐富環境訓練籠設置為70 cm×60 cm×50 cm 的透明有機玻璃箱，內部放置刺激運動、氣味、觸覺和聽覺的物品，如彩色小球、檸檬、音響等，同時融合6只陌生正常同齡雌鼠。

頭穴叢刺組參照《實驗針灸學》選取百會穴及其左右兩側旁開5 mm 處，從頭后向前額進行叢刺，深5～10 mm，快速捻轉20 s后留針1 h。

豐富環境結合頭穴叢刺組：給予大鼠頭穴叢刺長留針的同時，將其置于豐富環境訓練籠中干預1 h。

1.5 動物行為學檢測

在生后第42天對各組進行行為學測試。

1.5.1 社交能力指數和社交偏好指數

三箱實驗[11]是評估大鼠社交行為的常用方法。

測試箱采用70 cm×60 cm×50 cm 的頂部開口長方體亞克力箱，兩塊中下部開口(允許動物在箱內自由活動)的透明亞克力板將箱內空間均分為3份，箱內兩側箱格對角放置直徑5 cm、高20 cm 的金屬籠，用來放置陌生鼠。攝像頭置于箱體上方全程采集視頻。實驗前7 d 對待測鼠進行適應性訓練，第8 天正式開始實驗。

實驗分為兩個階段。第一個階段為社交能力測試，陌生鼠1 放入右側箱格金屬籠中，左側箱格放入空籠，將測試鼠放入中間箱格，測試10 min；結束后立即進行第二階段測試，即社交偏好測試，陌生鼠1不取出，陌生鼠2 放在空籠中，隨即調換兩個金屬籠的位置，再將被測鼠放入中間箱格測試10 min。采用Smart 3.0 行為學分析軟件記錄和分析測試鼠在3 個箱格中的活動時間、sniff 時間和活動軌跡等信息。為避免干擾，在每只鼠測試后都用75%酒精棉擦拭箱體，晾干后再進行下一只鼠的測試。

1.5.2 重復刻板行為

埋珠實驗[12]主要用于測試大鼠的刻板行為。

提前1 h 把大鼠送入測試箱以適應環境。用75%酒精和水擦拭標準鼠箱，并用紙巾擦干，底部墊料厚5 cm，墊料表面按4×5 的方式均勻擺放20 個大理石球(直徑1 cm)，放入待測鼠，蓋上蓋子，30 min 后將其取出，統計暴露體積大于1/2 的大理石球的個數，以及被埋大理石球的個數。為避免干擾，每只鼠測試后對箱體及墊料進行酒精消毒去味，待酒精揮發后進行下一只鼠的測試。

1.6 血清炎性因子IL-6和IL-1β水平測定

各組大鼠全部完成行為學測試后，腹腔注射10%水合氯醛350～400 mg/kg 麻醉大鼠，取眼球血約3～4 mL，室溫下靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取離心后的淡黃色上清液，1.5 mL 離心管分裝，采用ELISA 法測定血清IL-1β 和IL-6 水平。實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 統計學分析

采用SPSS 27.0 進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以(±s)表示。組間均數比較采用ANOVA 方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗。顯著性水平α= 0.05。

2 結果

2.1 動物行為學檢測

2.1.1 社交能力指數和社交偏好指數

與對照組比較，模型組社交能力指數和社交偏好指數均降低(P＜ 0.05)。與模型組比較，豐富環境組、頭穴叢刺組和豐富環境結合頭穴叢刺組社交能力指數和社交偏好指數均提高(P＜ 0.05)，豐富環境結合頭穴叢刺組優于頭穴叢刺組和豐富環境組(P＜ 0.05)。見表1、圖1和圖2。

圖1 各組三箱實驗社交能力結果Figure 1 Sociability results of three-chamber text in each group

2.1.2 重復刻板行為

與對照組比較，模型組挖掘掩埋動作頻繁，埋珠數量多(P＜ 0.05)。與模型組比較，豐富環境組、頭穴叢刺組和豐富環境結合頭穴叢刺組埋珠數量減少(P＜0.05)，與豐富環境組、頭穴叢刺組相比，豐富環境結合頭穴叢刺組埋珠數量下降(P＜ 0.05)。見表2。

表2 各組埋珠實驗結果Table 2 Comparision of marble burying results among groups

2.2 血清炎性因子IL-6、IL-1β水平

與對照組比較，模型組外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平升高(P＜ 0.05)；與模型組比較，豐富環境組、頭穴叢刺組和豐富環境結合頭穴叢刺組外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平下降(P＜ 0.05)，豐富環境結合頭穴叢刺組IL-6 和IL-1β 水平低于豐富環境組和頭穴叢刺組(P＜ 0.05)。見表3。

表3 各組血清炎性因子IL-6、IL-1β水平Table 3 Comparision of serum levels of inflammatory factors IL-6 and IL-1β among groups單位：ng/L

3 討論

VPA 建立ASD 模型已被眾多研究證實在解剖學、病理學、病因學方面與人類數據有顯著的相似之處[13]。2005 年，Schneider 等[9]首次從行為學角度證實VPA 建立孤獨癥模型的有效性。Schneider 團隊發現VPA建立的ASD大鼠模型生長發育較遲緩，對疼痛的敏感度降低，社交行為數量減少，運動和重復/刻板行為以及焦慮增加，這種行為改變與人類ASD行為障礙的特征有顯著相似之處。后續許多研究采用不同的行為測量工具，如三箱實驗檢測ASD大鼠社交能力，埋珠實驗檢測其重復刻板行為，曠場實驗檢測其焦慮情緒，均得到與Schneider 等相同的結論[14-15]。目前該模型的行為學表現已作為評估手段廣泛應用于ASD的行為學研究中。

ASD 患兒的行為學癥狀與大腦神經生物學改變和外部環境刺激有關。豐富環境訓練通過感覺、觸覺、視覺、聽覺、運動、空間以及同伴等豐富的刺激，有利于改善ASD 大鼠的社交能力[5]。通過調節基底神經節選擇核中的神經元代謝活性，增加樹突棘密度，或者增加神經營養因子或突觸蛋白表達來改善神經可塑性和神經遞質系統，減少炎癥和氧化應激，從而改善小鼠重復刻板行為、社交功能缺陷以及認知功能障礙等癥狀[16-18]。一項為期17 周的BTBRT+Itpr3tf/J 小鼠豐富環境訓練研究顯示，三箱實驗中豐富環境組雄鼠社交偏好和社交能力較模型組有顯著提升[19]。

頭穴叢刺直接作用于大腦體表投影區，可以改善局部血供，調節大腦氧和葡萄糖代謝，增強神經興奮性，減少炎癥反應，留針達到一定刺激量時可以促進神經功能重組，改善相應的異常行為，在腦部發育關鍵時期效果尤甚[20-23]。此外，頭穴叢刺通過上調海馬中神經調節蛋白1 和表皮生長因子4 受體表達、調節額葉皮質相關激素水平，如催產素、5-羥色胺來改善ASD 大鼠的行為學癥狀[24-25]。一項關于頭穴叢刺治療ASD 的Meta 分析顯示，頭穴叢刺是減輕ASD 嚴重程度、改善ASD 行為癥狀的有效治療方法[26]。本研究顯示，干預后各組社交能力指數和社交偏好指數改善，重復刻板行為減少，豐富環境訓練結合頭穴叢刺效果更好。

ASD 是一組異質性神經發育綜合征，與免疫系統失調和炎癥反應異常密切相關[27]。IL-6 是參與腦發育的重要免疫因子，外周血液IL-6 的升高可以通過神經解剖結構和神經可塑性的損傷介導孤獨癥樣行為[28]。IL-1β 通過淋巴細胞和巨噬細胞激活觸發炎癥反應。有研究發現，ASD 患兒單核細胞損傷并導致體內免疫反應發生改變，使促炎因子IL-1β 和IL-6 異常增多，與抑炎因子IL-10 處于不平衡狀態，進而促使ASD 患兒異常行為的出現[29]。本研究顯示，豐富環境訓練結合頭穴叢刺能夠下調孤獨癥大鼠血清中促炎因子IL-6和IL-1β 的表達，減輕外周炎性狀態。這與趙曉倩等[30]的研究結果一致。

4 結論

豐富環境訓練結合頭穴叢刺能夠改善孤獨癥大鼠行為學癥狀，降低周圍血清炎性因子表達，兩者聯合應用效果更佳，但具體機制仍需進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。