動物生物安全實驗室廢棄物分類高壓滅菌程序探索

曾薈燕，王團結，李婉清，李 強，孟伯龍，郭桐同，李倩琳，楊成崗，門星光，張廣川

（中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

2021 年實施的《中華人民共和國生物安全法》對病原微生物實驗室生物安全提出了明確要求，指出病原微生物實驗室應當加強對實驗活動廢棄物的管理，依法對廢水、廢氣以及其他廢棄物進行處置，采取措施防止污染[1]?！恫≡⑸飳嶒炇疑锇踩芾項l例》亦提出實驗室應當依照環境保護的有關法律、行政法規和國務院有關部門的規定，對廢水、廢氣以及其他廢棄物進行處置，并制定相應環境保護措施，防止環境污染[2]。由此可見，對實驗室廢棄物的有效滅菌處理，是實驗室生物安全的重要組成部分。

根據實驗室被處理對象的生物危害程度和采取的防護措施，生物安全實驗室分為微生物生物安全實驗室（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4）和動物生物安全實驗室（ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4）[3]。根據實驗室種類不同，實驗活動產生的廢棄物種類亦有差異。微生物生物安全實驗室產生的廢棄物主要為試驗耗材（如吸管、細胞培養瓶、鑷子、離心管等）和個人防護用品，動物生物安全實驗室產生的廢棄物主要為動物尸體、動物排泄物、個人防護用品及試驗耗材。

高壓滅菌是通過破壞或滅活生物因子對試驗材料滅菌和廢棄物去污染的最有效和可靠的方法，不同類型的廢棄物通常需要不同的操作周期以達到適當的滅活溫度[4]?？紤]到動物生物安全實驗室廢棄物種類多，且滅菌時裝載量較大，需要對廢棄物的滅菌效果進行驗證，以確保實驗室生物安全。本研究通過對中國獸醫藥品監察所動物生物安全實驗室產生的廢棄物進行分類，探索了不同種類廢棄物合理的高壓滅菌程序，以期為動物生物安全實驗室廢棄物處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

生物安全型脈動真空滅菌器（ 型號BIST-P3）、化學指示卡（批號22809）、生物指示劑（批號22F02），均購自山東新華醫療器械股份有限公司；隔水式恒溫培養箱（型號GNP-9270），購自上海精宏實驗設備有限公司；雞、鴨、兔、鼠等小動物尸體，豬、牛、羊等大動物尸體，糞膜所收集的禽類糞便，豬、牛、羊、兔等飼養動物的袋裝糞便，以及防護服、利器盒、過期飼料和廢棄墊料等一般廢棄物，均來自中國獸醫藥品監察所ABSL-1 和ABLS-2 實驗室；高壓滅菌袋（規格870 mm×760 mm），購自長沙湘安環?？萍加邢薰?；不銹鋼高壓滅菌箱（規格尺寸50 cm×40 cm×30 cm，箱體兩側帶有透氣孔），購自北京宇軒宏達科技有限公司。

1.2 廢棄物分類及高壓前預處理

根據中國獸醫藥品監察所動物試驗活動產生的廢棄物種類，將廢棄物分為5 類：小動物尸體（雞、鴨、鼠、兔等）、大動物尸體（豬、牛、羊等）、禽類糞便以及豬、牛、羊等動物的袋裝糞便和一般廢棄物（防護服、利器盒、過期飼料和墊料等）。

小動物尸體處理，是將小動物腹部剖開并裝入高壓滅菌袋中；大動物尸體處理，是將動物的頭及四肢肢解，并將胸腔和腹腔剖開后放入高壓滅菌袋中；禽類糞便，由鋪設在隔離器底部的糞膜卷軸旋轉收集；一般廢棄物，是將防護服、利器盒、過期飼料和廢棄墊料等物品置于高壓滅菌袋中。以上物品的高壓滅菌袋置于滅菌箱后體積不可超過滅菌箱的2/3。袋裝糞便是豬、牛、羊、兔等動物糞便，可直接收集到高壓滅菌袋中。高壓前將滅菌袋中的糞便平鋪在滅菌箱中，平鋪高度不超過10 cm。所有裝有廢棄物的高壓滅菌袋袋口用專用膠帶適度包扎，不要過緊[5]。

基于實驗室廢棄物處理流程，在試驗活動中產生的動物尸體、糞便及墊料無法被實時高壓滅菌處理時，需暫存于冷庫[6]。高壓前先對此類廢棄物進行解凍。廢棄物解凍是在滅菌前將廢棄物置于脈動真空滅菌器中，通過流經鍋體夾套中的蒸汽進行解凍，4 h 后再對其進行高壓滅菌處理。

所有廢棄物高壓滅菌驗證均在滅菌器滿載的情況下進行[7]。滅菌器置物架上、下兩層各放置11 箱高壓滅菌箱，22 個滅菌箱之間保留適當空隙，確保蒸汽能夠順利穿透。

1.3 生物指示劑和化學指示卡放置方法

小動物尸體的化學指示卡和生物指示劑放置于尸體的腹腔內部，大動物尸體的放置于尸體肌肉里層，禽類糞便的放置于糞膜卷軸中心位置，豬、牛、羊等動物袋裝糞便的放置于糞便底層，一般廢棄物的放置于每個滅菌箱內廢棄物的中心位置[8]。

1.4 滅菌器程序設定

將滅菌器預設程序中的滅菌溫度121 ℃、排空上限80 kPa、脈動次數4 次設置為固定參數。根據滅菌器使用說明，初始以30 min 作為1 個滅菌時間單位，每間隔30 min 設置1 個滅菌時長進行滅菌驗證；將小動物尸體、禽類糞便、一般廢棄物的排空下限設置為-80 kPa。因袋裝糞便與大動物尸體含有液體成分較多，排空下限不宜太低，設置為-10 kPa。

1.5 結果判定

高壓滅菌結束后，取出生物指示劑和化學指示卡。觀察化學指示卡變色情況，若達到標準色或深于標準色，則滅菌合格；若顏色淺于標準色，則滅菌失敗。采用專用夾具，夾破生物指示劑的內含培養基，將生物指示劑置于隔水式恒溫培養箱，同時設置陰性和陽性對照，56 ℃培養48 h。當陰陽性對照成立時，若培養液保持紫色，則滅菌合格；若培養液變成黃色，則滅菌失敗。只有生物指示劑和化學指示卡均指示合格時，才表示滅菌合格。

2 結果

2.1 小動物尸體

結果（表1）顯示，當滅菌時間為30 min 時，22 箱被滅菌物品中，14 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果為合格，8 箱為不合格。當滅菌時間為60、90 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑滅菌結果均為合格。

表1 小動物尸體滅菌結果

2.2 大動物尸體

結果（表2）顯示，當滅菌時間為30 min 時，有5 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果為合格，17 箱為不合格；當滅菌時間為60 min 時，13箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果為合格，9 箱為不合格；當滅菌時間為90 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格。

表2 豬、牛、羊等大動物尸體滅菌結果

2.3 禽類糞便

結果（表3）顯示，當滅菌時間為30 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為不合格；當滅菌時間為60 min 時，11 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果為合格，11 箱為不合格；當滅菌時間為90 min 時，16 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果為合格，6 箱為不合格。因90 min 未達到滅菌效果，將滅菌時間延長至120 min。當滅菌時間為120 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格。

表3 禽類糞便滅菌結果

2.4 袋裝糞便

結果（表4）顯示，當滅菌時間為30 min 時，7 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格，15 箱為不合格；當滅菌時間為60 min 時，18箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格，4 箱為不合格；當滅菌時間為90 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格。

表4 豬、牛、羊等動物袋裝糞便滅菌結果

2.5 一般廢棄物

結果（表5）顯示，當滅菌時間分別為30、60、90 min 時，22 箱廢棄物的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格。

表5 一般廢棄物滅菌結果

2.6 廢棄物滅菌程序確定

分別選取5 種廢棄物首次通過滅菌試驗的滅菌參數進行3 次重復試驗，發現重復試驗的化學指示卡和生物指示劑結果均為合格，因此確定5 種廢棄物的滅菌參數如表6 所示。

表6 廢棄物滅菌參數

3 討論

3.1 高壓滅菌溫度和時間的重要性

采用滅菌器預設程序對動物尸體和動物糞便進行高壓滅菌時，有部分化學指示卡和生物指示劑結果為滅菌失敗。在后續試驗中，通過對滅菌程序的滅菌時間、脈動下限等參數優化處理，實現了廢棄物的可靠滅菌。

影響高壓滅菌效果的因素有很多，比如溫度、時間、脈動方式、滅菌包質量、滅菌器是否漏氣等[9-12]。一個滅菌程序對微生物的致死效應主要由兩大因素決定，即溫度和時間[13]。只要被滅菌對象的中心溫度達到設定溫度，維持一定時間就可實現滅菌。而其他影響因素是為熱蒸汽能夠快速穿透物品提供便利。例如有研究[14]表明，排空方式為上限80 kPa、下限-80 kPa 比上限80 kPa、下限0 kPa 具有更徹底的冷空氣排除效果，進而為飽和蒸汽的快速、充分滲入提供了條件。工作中，需要根據實驗室實際情況綜合考慮飼養動物的便利性和廢棄物的無害化處理，如采用卷糞膜的方式收集禽類糞便可以提高工作效率，但因糞便被多層塑料膜包裹，其中心部位需要很長時間才能達到滅菌溫度，因此需通過延長滅菌時間（120 min）實現滅菌效果。同時，對于開展高致病性病原微生物試驗活動產生的廢棄物，需采用多層包裝和袋口扎緊等措施保障生物安全，在高壓滅菌時可通過調整脈動次數和延長滅菌時間等方式實現可靠滅菌。

3.2 廢棄物分類高壓的重要性

動物生物安全實驗室的廢棄物種類較多，涉及動物尸體、動物排泄物、動物墊料、防護用品以及試驗耗材等。目前國內尚缺乏動物生物安全實驗室廢棄物的消毒技術規范，滅菌器的說明書也僅是提供預設程序。高壓蒸汽滅菌器作為廢棄物無害化處理的有效方式，必須對其進行規范管理，根據實驗室器械、感染性廢棄物、動物尸體等不同的消毒滅菌對象，建立各項規章制度和操作規程[15]。因此，動物生物安全實驗室應根據廢棄物種類進行分類高壓，保證滅菌效果。除確保實驗室生物安全外，分類高壓還能優化實驗室廢棄物處置程序，提高實驗室廢棄物無害化處理效率。

3.3 廢棄物高壓驗證的重要性

廢棄物去污染處理后，必須定期對消毒滅菌效果進行驗證。驗證措施包括物理驗證和微生物驗證，同時壓力蒸汽滅菌器有多種滅菌程序，也應對每一種程序分別驗證[7，16]。動物生物安全實驗室在進行廢棄物滅菌前，應根據實驗室滅菌設備體積大小、廢棄物種類及廢棄物包裝大小，開展高壓滅菌驗證。然后根據滅菌結果，制定本單位廢棄物高壓滅菌標準操作規程，并對廢棄物的滅菌程序、廢棄物包裝尺寸、廢棄物類別、滅菌時袋口狀態等作出明確規定。對采用相同高壓程序實現廢棄物滅菌的，在實際工作中可一同高壓，否則應分類、分次進行高壓。

3.4 加強動物生物安全實驗室消毒技術規范建設

我國于2002 年發布的《消毒技術規范》[17]對醫療衛生機構廢棄物處理作了明確要求，但涉及動物生物安全實驗室及微生物生物安全實驗室廢棄物處理時，尚屬欠缺。通常情況下，后者參考《消毒技術規范》開展相關工作。生物安全是國家安全的重要組成部分，因此建議加強各級動物生物安全試驗室消毒技術規范建設，確保實驗室廢棄物無害化處理，保障生物安全。