紫紋兜蘭的花形態和雙雄蕊花藥發育及分類學意義

朱永 黃家林 陶凱鋒 王樂騁 張錦 李璐

摘 要： ???兜蘭屬的分類系統學爭議較大，亟待更多資料澄清。該文利用體式解剖鏡和石蠟切片技術觀察了紫紋兜蘭的花結構和雙雄蕊花藥發育特征。結果表明：（1）花形態特征支持將紫紋兜蘭放置于兜蘭亞屬的單花斑葉組，包括萼片具脈紋、花瓣長圓形帶黑褐斑，唇瓣具直立的耳狀結構，退化雄蕊新月形等。（2）花藥原基分化出一對側生并列的藥室，花藥室中央分化出一條不完全貫穿的不育隔膜組織，將其分化為兩個小孢子囊。在花藥成熟時，不育隔膜組織被降解吸收，兩個花粉囊通過次生融合形成一枚馬鞍形的黏性花粉團。（3）發育完整的花藥壁有4層，由外到內分別為表皮、藥室內壁、中層和絨氈層，符合單子葉型花藥壁?；ㄋ幈诰呓q氈層和內絨氈層，均為2核。在2-細胞花粉時期，中層和絨氈層發生降解，藥室內壁發生纖維狀加厚。（4）小孢子母細胞經同時型胞質分裂形成不同排列方式的小孢子四分體，包括正四面體、左右對稱和十字交叉型，并且同一藥室的小孢子母細胞減數分裂不同步現象明顯。（5）在雄配子體發育階段，小孢子或保持在四分體內或從四分體中游離出來，經有絲分裂發育為2-細胞型花粉，形成具有黏性的四合花粉或花粉粒?；诂F有資料，該文比較分析了紫紋兜蘭不完全貫穿的不育隔膜組織、單子葉型花藥壁、具2核的絨氈層和內絨氈層、同時型胞質分裂和黏性花藥等特征的分類學意義，為理解兜蘭屬及杓蘭亞科的分類學和保護生物學提供新資料。

關鍵詞： ?兜蘭屬， 杓蘭亞科， 花藥壁發育， 小孢子發生， 雄配子體發育， 花粉散粉單元， 分類學

中圖分類號： ??Q949.58

文獻標識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0102-11

Floral morphology and anther development in diandrous

orchid Paphiopedilum purpuratum with

their taxonomic implications

ZHU Yong1， HUANG Jialin2， TAO Kaifeng1， WANG Yuecheng1， ZHANG Jin1， LI Lu1*

（ 1. College of Biodiversity Conservation， Southwest Forestry University， Kunming 650224，

China; 2. Yuxi Normal University， Yuxi 653100， Yunnan， China ）

Abstract： ??The taxonomy of Paphiopedilum Pfitz. has been disputed and needs more data for clarification. Floral morphology and anther development in P. purpuratum were observed using microscope and paraffin section. The results were as follows： （1） It was supported that P. purpuratum should be placed in Paphiopedilum subgenus Paphiopedilum sect. Barbata by some floral features， including a single flower， sepal white with veins， petal spotted with blackish-maroon， pouch of a lip auriculate on both sides， and a staminode lunate. （2） At the early stage， anther primordium developed into a pair of laterally juxtaposed thecae. An incomplete sterile septa was differentiated in the center of each theca， giving rise to two arc-shaped microsporangia. When anther split， the sterile septum was discomposed and degenerated resulting in a mass of sticky pollens from two pollen sacs were fused into a unit. （3） The developed anther wall consisted of an epidermis， an endothecium， a middle layer， and a tapetum， conforming to the monocotyledonous type. Both tapetum and the inner tapetum cells contained 2 nuclei. At the stage of 2-celled grains， degeneration occurred in the epidermis and tapetum layers， while the endothecium became thickened fibrously. （4） Microspore mother cells underwent a simultaneous cytokinesis resulting in microspore tetrads with varied arrangements of tetrahedral， isobilateral， and decussate types， and the meiotic activity of microspore mother cells in the same theca was obviously asynchronous and different meiosis phases could be observed. （5） Microspores produced 2-celled pollens via a mitosis， which could be retained in pollen tetrads or released as monad. Based on the data available， some key features are selected for taxonomy and conservation biology of Paphiopedilum in Cypripedioideae， including the differentiation of incomplete sterile septum， the monocotyledonous type of anther wall， the binucleated tapetum， differentiation of the ?inner tapetum， simultaneous cytokinesis， the sticky pollens， and so on. This study provides new information for taxonomy and conservation biology of Paphiopedilum， as well as of ?Cypripedioideae.

Key words： ?Paphiopedilum， Cypripedioideae， anther wall development， microsporogenesis， male gametogenesis， pollen dispersal unit， taxonomy

杓蘭亞科（Cypripedioideae Lindl.）的花形態特征在蘭科里較為獨特，主要因其具有兩枚可育雄蕊和花藥開裂時散粉單元為黏性花粉，明顯區別于其余4個亞科（Dressler， 1986; Kocyan & Endress， 2001; Singer et al.， 2008）。作為蘭科的基部類群，具有兩枚可育雄蕊的杓蘭亞科與具有三枚可育雄蕊的擬蘭亞科（Apostasioideae Rchb.）的親緣關系較近，包括5個屬約180種，每個屬都有獨立而特定的地理分布（Dressler， 1986; Cox et al.， 1997; Pridgeon et al.， 1999）。除了南美洲特有的3個小屬以外，其余2個屬在我國均有分布，即杓蘭屬（Cypripedium L.）和兜蘭屬（Paphiopedilum Pfitz.）（Cribb， 1998; 郎楷永，1999； 劉仲健等，2009）。杓蘭亞科具較高觀賞價值（Cribb， 1998; 郎楷永，1999），其野生資源備受關注，國產兜蘭屬和杓蘭屬均被列入國家重點保護植物名錄（國家林業和草原局 農業農村部，2021）。

長期以來，兜蘭屬的分類系統爭議較大，問題主要集中在屬下的亞屬及其分組的處理。早期的分類系統根據唇瓣形態（Atwood， 1984; Cribb， 1987）和細胞學（Karasawa， 1980， 1982）將兜蘭屬分為2個亞屬或6個亞屬。后來的研究認為該屬應該劃分為3個亞屬（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999），得到了分子系統學證據的支持（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020），但現有中國兜蘭屬的分類系統仍舊采納兩個亞屬的概念（郎楷永，1999； 劉仲健等，2009）亟待澄清。在重建兜蘭屬分類系統的資料中，葉面斑塊的有無和唇瓣形態常被用作該屬的物種鑒定依據（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999; 郎楷永，1999；劉仲健等，2009），其余花結構的分類學價值極少受到關注。Cribb（1998）認為兜蘭亞屬（Paphiopedilum subgenus Paphiopedilum）的單花斑葉組（sect. Barbata）因普遍具有單花、唇瓣基部直立的耳狀結構、葉片具明暗鑲嵌的斑塊等可用于該組的分類依據。它明顯區別于多花無耳組（sect. Coryopedilum），后者普遍具數朵花組成的花序，唇瓣基部無耳狀結構，葉片光滑凈色無斑塊。紫紋兜蘭 ［P. purpuratum （Lindl.） Stein］是中國兜蘭屬最早被引種栽培和命名發表的物種，模式標本產于我國的香港，在福建、廣東、廣西和云南以及境外的越南也有分布（劉仲健等，2009）。根據唇瓣小于中萼片的形態特征，紫紋兜蘭被放置于兜蘭亞屬（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999; 郎楷永，1999）。近年來的分子系統學進一步把它列入單花斑葉組（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020），但是，關于它的形態學和花藥發育特征的研究資料較少。

花形態和花藥發育胚胎學特征在蘭科分類系統學中發揮著重要作用，包括唇瓣與合蕊柱的形態、可育雄蕊和花藥室的數目、花藥壁發育類型、絨氈層特征、小孢子母細胞減數分裂類型、花藥成熟時的散粉單元等（Burns & Bernhardt， 1985; Dressler， 1986， 1993; Johri et al.， 1992; Johnson & Edwards， 2000; Harder & Johnson， 2008; 李璐，2023），但資料較少（Sood， 1989; 譚慶琴等，2020）。最新的蘭科分類系統為理解5個亞科的花形態和胚胎學特征的分類系統學意義提供了基礎框架（Chase et al.， 2015）?，F有蘭科花藥發育資料集中在具有3枚可育雄蕊的擬蘭亞科（Apostasioiedeae）（Kocyan & Endress， 2001）、具有單雄蕊的蘭亞科（Orchidoideae）（Swamy， 1946; Maheshwari & Narayanaswami， 1952; Kant & Bhanwra， 2010）和樹蘭亞科（Epidendroideae）（Bhanwra & Vij， 2003; Kant， 2019， 2023; 譚慶琴等，2020）。在具有雙雄蕊的杓蘭亞科中，杓蘭屬的花藥發育過程研究資料較多（Swamy， 1949; Brown & Lemmon， 1996; Sood & Rao， 1988; Kant， 2011），但兜蘭屬的花藥發育資料相對少見（Swamy， 1949; 任玲和王伏雄，1987），其余3個屬的資料也較為匱乏（Johri et al.， 1992; Cribb， 1998）。本研究利用體式解剖鏡和石蠟切片技術，觀察了紫紋兜蘭的花結構和花藥發育過程中的不育隔膜組織的分布和分化、花藥壁類型、胞質分裂方式、花藥形態等特征，結合現有資料，比較分析其分類學意義，為理解兜蘭屬及杓蘭亞科的分類學和保護生物學提供新資料。

1 材料與方法

紫紋兜蘭栽培于西南林業大學科研教學實習基地（云南豐春坊生物科技有限公司蘭花資源圃），生長多年，正常開花。2017—2020年，連續4年采集不同發育時期的花蕾和開放花，取15朵左右新鮮開放花，在徠卡體式解剖鏡（Leica M165 FC）下觀察唇瓣、合蕊柱、花粉團等花結構的形態特征并拍照，其余材料固定在50%的酒精，24 h后轉入70%的酒精常溫保存。取固定后的材料，按發育形態分為3個階段（幼嫩花蕾期、花蕾期、開花期），每個階段取5～10朵。材料經酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋，常規石蠟切片（Leica RM 2235，切片厚度為8 μm）。切片經烘干、脫蠟、復水、愛氏蘇木精染色、中性樹脂膠封片后，制成永久切片。切片在尼康顯微鏡（Nikon E100）下觀察并拍照，利用圖像編輯軟件（Adobe Photoshop CS6）制作圖版。蘭科植物結構術語參考《中國蘭科植物鑒別手冊》（陳心啟等，2009）。

2 結果與分析

2.1 花形態及解剖特征

紫紋兜蘭具有以下典型的花結構特征（圖版Ⅰ ：1）：單花，花葶長達30 cm以上；花大，深紫色，帶明顯條紋；中萼片白色、闊卵形，邊緣外卷，頂部急劇變狹呈尖角；合萼片狹披針形，與子房并列向下生長；側花瓣長圓形，具紫紅色脈紋，邊緣淺波狀外卷；唇瓣深盔狀，囊口方闊，前端無缺刻，兩側具一個直立的耳；基部的側裂片向內卷，具疣狀突起。解剖鏡下，可觀察到雄蕊和雌蕊僅在基部愈合為半生合蕊柱，呈扁平半圓柱形，分背腹面，密被紫色短柔毛；兩側各有1枚可育雄蕊，花絲肉質短粗；上部有獨立生長的柱頭和退化雄蕊，肉質扁平呈盾狀，朝近軸面呈90°彎曲生長（圖版Ⅰ ：2-4）。退化雄蕊倒心形半月狀（圖版Ⅰ ：2，3）；柱頭圓餅狀，表面光滑，帶3淺裂（圖版Ⅰ ：3-5）?；ㄋ幇l育早期，兩枚可育雄蕊與柱頭近等高（圖版Ⅰ ：5），可見花藥由一對側生花藥室組成（圖版Ⅰ ：6），每個花藥室頂部沿縱軸有一條淺槽（圖版Ⅰ ：5，6）。發育后期，花藥室沿淺槽開裂（圖版Ⅰ ：7），露出表面光滑、呈彎曲棒狀、粘成一團的花粉（圖版Ⅰ ：8）。

2.2 花藥壁發育

在早期花藥的橫切面上，可觀察到合蕊柱基部兩側各有1枚可育雄蕊，其花藥均由一對側生花藥室組成，朝近軸面彎曲生長，有圍抱合蕊柱之勢（圖版Ⅱ ：1）。每對花藥室連接處的薄壁細胞染色較淺，具有明顯的主維管束，構成一條較寬的藥隔組織 （圖版Ⅱ ：1）?；ㄋ幨抑醒胗幸粓F孢原細胞分化為染色較淺的薄壁細胞且未參與不育隔膜組織的形成，其中最外1～2層細胞徑向伸長，發育為具有2核的內絨氈層（圖版Ⅱ ：2，3）。小孢子母細胞時期，花藥室表皮下的一個孢原細胞經2次平周分裂形成了具有4層細胞的成熟花藥壁，由外至內分別為表皮、藥室內壁、中層和絨氈層（圖版Ⅱ ：4，5）。因此，花藥壁發育模式為單子葉型。小孢子母細胞減數分裂期間，表皮細胞多為整齊的長方形（圖版Ⅱ ：1，7），有的呈波浪狀或齒狀（圖版Ⅱ ：4-6）；藥室內壁細胞增大呈方廓形至長方形（圖版Ⅱ ：4-10）；中層細胞細小，單核；絨氈層細胞增大具有明顯的雙核（圖版Ⅱ ：4-8）。在小孢子四分體或小孢子單體時期（圖版Ⅱ ：6-9），中層和絨氈層降解明顯，藥室內壁細胞繼續增大，表皮細胞變窄?；ㄋ幊墒鞎r，花藥壁僅剩下表皮殘跡和帶狀纖維加厚的藥室內壁層（圖版Ⅱ ：10）。從成熟花藥的縱切面和橫切面上可以觀察到不育隔膜組織降解明顯，花藥頂部凹陷處的花藥壁較?。▓D版Ⅱ ：11），發生斷裂，準備散粉（圖版Ⅱ ：12）。

2.3 小孢子發生和雄配子體發育

發育早期，花藥室表皮下的分生組織經有絲分裂形成孢原細胞，藥室中央的孢原細胞分化為染色較淺的不育隔膜組織，靠外側的孢原細胞分化為染色較深、核質比大的造孢細胞（圖版Ⅱ ：1，2），緊接著分裂形成了核質比大、排列緊密的小孢子母細胞（圖版Ⅲ ：1）。小孢子母細胞經減數分裂I的前期（圖版Ⅲ ：2，3）、中期（圖版Ⅲ ：4）、后期（圖版Ⅲ ：5）和減數分裂Ⅱ形成了處于同一個細胞內的正四面體排列的4個子核（圖版Ⅲ ：6）。之后，4個子核間出現了明顯的子細胞壁，產生了3種排列方式的小孢子四分體，包括正四面體（圖版Ⅲ ：7）、左右對稱型（圖版Ⅲ ：8）和十字交叉型（圖版Ⅲ ：9）。接著，小孢子有的從四分體內釋放出來（圖版Ⅲ ：10），有的仍然保持在四分體內（圖版Ⅲ ：11），繼續通過有絲分裂形成了具有2-核的花粉?；蛩暮匣ǚ郏▓D版Ⅲ ：12）。因此，紫紋兜蘭的小孢子母細胞減數分裂的胞質分裂方式為同時型（Johri et al.， 1992）。

3 討論與結論

雄蕊數目和花藥發育胚胎學特征，包括花藥室數目、花藥壁發育類型、小孢子發生的胞質分裂方式、小孢子四分體排列形式以及散粉單元方式等，在被子植物中，尤其是蘭科分類學中具有重要作用（Johri et al.， 1992; Dressler， 1993; 胡適宜，2005; Singer et al.， 2008； 李璐，2023）?，F有研究表明，關于蘭科的花藥發育的研究資料，集中在具三雄蕊的擬蘭亞科和具單雄蕊的蘭亞科和樹蘭亞科，較少見于具雙雄蕊的杓蘭亞科，且具單雄蕊的香莢蘭亞科（Vanilloideae）的花藥發育研究幾乎為空白（李璐，2023）。據此，本研究觀察了紫紋兜蘭的花形態和花藥發育胚胎學特征，結合現有資料，比較分析了它們的分類學意義，具體如下。

3.1 新月形退化雄蕊和具條紋脈萼片的分類學意義

紫紋兜蘭具有紫色條紋脈的中萼片和新月形的退化雄蕊的花形態特征，明顯區別于大多數兜蘭屬物種，具有較高的物種識別度。值得注意的是，這兩個特征還見于紫紋兜蘭所在的單花斑葉組的其余5種以及同一亞屬的多花無耳組的3個種。前者包括紫紋兜蘭的3個近緣種 ［胼胝兜蘭（P. callosum）、髯毛兜蘭（P. barbartum）、勞氏兜蘭（P. lawrenceanum）］（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020）和國產的2個種 ［秀麗兜蘭（P. venustum）、彩云兜蘭（P. wardii）］（劉仲健等，2009）。后者包括國王兜蘭（P. rothschildianum）、皇后兜蘭（P. sanderianum）和菲律賓兜蘭（P. philippinense），它們都具有這兩個重要分類學意義的形態特征（Cribb， 1998）。這似乎意味著單花斑葉組和多花無耳組之間也許存在著一定親緣關系，值得進一步研究。同時，考慮到退化雄蕊的形態結構在兜蘭屬種間差異明顯（Cribb， 1998），其分類學意義值得重視。

3.2 紫紋兜蘭可育雄蕊花藥成熟時的花粉類型

紫紋兜蘭的花藥成熟開裂后，露出一團表面光滑但有黏性的散粉單元（pollen dispersal unit），即花粉粒被黏性物質粘連為一團，形似樹蘭亞科的花粉團（pollinium）。有研究認為花粉單粒散生是兜蘭屬的分類學特征之一（Swamy， 1949; Poddubnaya-Arnoldi， 1960），杓蘭屬的花粉也被描述為2-細胞型單?；ǚ郏⊿ood & Rao， 1988）。不過，后來的研究進一步證實了兜蘭屬（任玲和王伏雄，1987）和杓蘭屬（Kant， 2011）成熟的散粉單元均為黏性花粉粒，這些黏性物質來自于絨氈層細胞降解后的脂類物質，含有黃色的類胡蘿卜素，被稱為花粉鞘類物質， 具有將整個花藥內的花粉粘成一體，提高傳粉效率的特征（任玲和王伏雄，1987），這與其他4個亞科的散粉單元類型截然不同（Singer et al.， 2008）。本研究觀察到紫紋兜蘭成熟花藥內的花粉細胞較為稀疏，既有單?；ǚ垡灿兴暮匣ǚ?，并非如萬代蘭屬（Vanda Jones ex R. Br.）（張錦等，2019）和巾唇蘭屬（Pennilabium J. J. Sm.）（李璐等，2020）的花粉團那樣排列緊密。這樣的“黏性花粉”在長瓣兜蘭（Paphiopedilum dianthum）（史軍等，2007）和綠花杓蘭（Cypripedium henryi）（Li et al.， 2008）的傳粉者身上清晰可辨，支持了前人的觀點（任玲和王伏雄，1987），為進一步理解杓蘭亞科的傳粉生物學提供了形態學和胚胎學方面的數據。

3.3 蘭科花藥室數目和不育隔膜組織分化的重要性

現有資料表明，在蘭科花藥發育過程中，不育隔膜組織的分化和降解對于理解5個亞科不同散粉單元類型的形成非常重要（李璐，2023）。在具有單雄蕊的蘭亞科和樹蘭亞科的花藥發育過程中，早期花藥原基分化出的不育隔膜組織的數目、朝向和位置對于花粉小塊（massulae）和花粉團（pollinium）的類型和數目至關重要（Freudenstein & Rasmussen， 1996， 1997; Freudenstein et al.， 2002; Kant & Goel， 2013）。這是因為不育隔膜組織在后期會發生降解，把成熟花粉囊分割為大小不同（等大或不等大）、數目不等（2、4、8）和形態多樣（全緣、孔裂、淺裂、深裂）的散粉單元（Freudenstein & Rasmussen， 1996; Singer et al.， 2008; Kant & Hossain， 2010; Kant et al.， 2013; 張錦等，2019；李璐等，2020； 譚慶琴等，2020）。本研究觀察到紫紋兜蘭早期的花藥分化為一對側生藥室，每個藥室中央的孢原細胞分化出一條不育隔膜組織，形成一對靠邊的具淺凹的弧形小孢子囊。這一點在前人的研究中均未得到重視，忽略了花藥室數目和不育隔膜組織分化的關系，例如白唇杓蘭（C. cordigerum）和扇脈杓蘭（C. japonicum）被分別描述為4室花藥和4個小孢子囊（Sood & Rao， 1988; Ghimire et al.， 2020），為理解杓蘭亞科的花藥發育的分類學意義帶來了困惑。因此，花藥室的數目和不育隔膜組織分化之間的關系值得深入探討（Kant & Goel， 2013）。

3.4 紫紋兜蘭單子葉型花藥壁發育的分類學意義

紫紋兜蘭的花藥壁有4層，屬于單子葉型。這與杓蘭亞科現有的研究結果均不同，具有分類學價值。例如，同屬植物的南印兜蘭（Paphiopedilum druryi）（Swamy， 1949）和古德兜蘭（P. godefroyae）（任玲和王伏雄，1987）的花藥壁有5層，屬于基本型，而杓蘭屬的白唇杓蘭（Sood & Rao， 1988; Kant， 2011）和扇脈杓蘭（Ghimire et al.， 2020）有6～8層，為多層型花藥壁。在蘭科里，單子葉型花藥壁多見于蘭亞科，如斑葉蘭屬（Goodyera R. Br.）（Sood， 1988）、蜂蘭屬（Ophrys L.）（Aybeke， 2012）、玉鳳花屬（Habenaria Willd.）（Vij & Sharma， 1987; Sood， 1986）、角盤蘭屬（Herminium L.）（Sood & Rao， 1986）和鳥足蘭屬（Satyrium Sw.）（Rao & Sood， 1979）以及樹蘭亞科的巾唇蘭屬（李璐等，2020）等，而多層型花藥壁普遍出現在樹蘭亞科，包括萬代蘭屬（張錦等，2019）和竹葉蘭屬（Arundina Blume）（譚慶琴等，2020）等。此外，擬蘭亞科的成熟花藥壁也普遍具有4～5層，有的地方具有2層加厚的藥室內壁，但關于其花藥壁類型的特征和分類學意義并未被提及（Kocyan & Endress， 2001; Singer et al.， 2008）。因此，本研究認為花藥壁的層數和類型在蘭科植物的花藥發育中非常多樣，這在其他被子植物里不常見，值得重視。

被子植物的絨氈層細胞核通常為單核，但部分物種也有雙核且在屬內較為穩定，具有一定的分類學意義（Johri et al.， 1992）。紫紋兜蘭花藥壁絨氈層和不育隔膜組織的內絨氈層均具雙核現象，這與南印兜蘭（Swamy， 1949）和古德兜蘭（任玲和王伏雄，1987）的觀察結果一致，但與杓蘭屬白唇杓蘭（Sood & Rao， 1988; Kant， 2011）和扇脈杓蘭（Ghimire et al.， 2020）具單核絨氈層的結果不同。這說明絨氈層細胞核的數目或許可以作為兜蘭屬和杓蘭屬界限劃分的依據之一。有意思的是，Swamy（1949）曾經系統地觀察了蘭科16屬28種植物配子體發育的胚胎學特征，其中，南印兜蘭具有雙核絨氈層，明顯區別于其他單雄蕊類的蘭科植物，因此雙核絨氈層被認為是杓蘭亞科的鑒別特征之一。不過，后來Sood（1988）也發現了蘭亞科的斑葉蘭（Goodye rarepens）也存在雙核絨氈層的現象，并提出該特征并非具雙雄蕊蘭的杓蘭亞科所特有。這在后人的研究結果里也得到證實?，F有蘭科花藥發育資料表明，單核絨氈層較為普遍，見于擬蘭亞科、蘭亞科和樹蘭亞科等大部分類群（Vij & Sharma， 1987; Singer et al.， 2008; 張錦等，2019），而雙核絨氈層相對少見，出現在杓蘭亞科的兜蘭屬以及蘭亞科和樹蘭亞科的一些物種，如火燒蘭屬（Epipactis Zinn）植物（Sood， 1997; Bhanwra et al.， 2006a）、紋瓣蘭（Cymbidium pendulum）、蓋喉蘭（Smitinandia micrantha）（Bhanwra et al.， 2006b）和紫花苞舌蘭（Spathoglottis plicata）（Sriyot et al.， 2015）等。此外，在綬草（Spiranthes sinensis）的花藥發育過程中，絨氈層細胞在分化早期為單核，成熟時變為雙核（Sood， 1989），這在紫紋兜蘭的花藥發育過程中未曾注意到。因此，還需要觀察發育完整的花藥壁結構的細胞特征來確定絨氈層細胞核數目（Johri et al.， 1992）。

3.5 紫紋兜蘭的小孢子發生和雄配子體發育的分類學意義

紫紋兜蘭的小孢子母細胞經同時型胞質分裂方式形成小孢子四分體，通過有絲分裂形成了2-細胞型花粉，兼具單?；ǚ酆退暮匣ǚ酃泊娴默F象，這與杓蘭亞科現有研究資料基本一致（Poddubnaya-Arnoldi， 1960; Sood & Rao， 1988; Brown & Lemmon， 1996; Kant， 2011; Ghimire et al.， 2020），可作為該亞科區別于其他亞科的胚胎學特征。雖然最早的研究表明杓蘭屬為連續型胞質分裂（Guignard， 1882），但并未得到后續研究資料的支持。在蘭科花藥發育過程中，同時型胞質分裂較為普遍，而連續型胞質分裂相對較少，后者見于萬代蘭屬（張錦等，2019）、蜂蘭屬（Aybeke， 2012）和苞舌蘭屬（Spathoglottis Blume）（Sriyot et al.， 2015）。因此，小孢子發生的胞質分裂方式在蘭科分類系統中的演化趨勢也值得重點關注（Furness & Rudall， 1999; Furness et al.， 2002）。

紫紋兜蘭的小孢子四分體排列方式多樣，包括正四面體、左右對稱型和十字交叉型，為理解小孢子四分體排列方式的分類學意義提供了新資料。已有研究表明，蘭科的小孢子四分體排列方式多樣，多達５種，包括正四面體、左右對稱型、十字交叉型、“Ｔ”型和線型（胡適宜，1982；Johri et al.， 1992）。其中，正四面體最常見，左右對稱型次之，而其余幾種排列方式是現有蘭科花藥發育中比較少見的。值得注意的是，小孢子四分體的排列方式與散粉單元內部的四合花粉的排列方式基本保持一致。這在蘭亞科的花粉小塊（Kant et al.， 2013）和樹蘭亞科的堅固花粉團（張錦等，2019； 譚慶琴等，2020； 李璐等，2020）等的花藥發育過程中均得到了證實，對于理解蘭科的成熟花粉形態具有重要意義。

3.6 結論

綜上所述，本研究提出以下觀點，僅供參考。（1）紫紋兜蘭帶縱條紋的背萼片和新月形退化雄蕊特征在兜蘭屬較為少見，可以作為兜蘭亞屬單花斑葉組和多花無耳組聯系的紐帶，其親緣關系值得繼續探究。（2）紫紋兜蘭在花蕾期和開放花時的合蕊柱結構差異說明花器官發生過程中，可育雄蕊和退化雄蕊以及雌蕊柱頭的形態建成發生在花發育后期，即花蕾期，并且三者之間的生長速度存在明顯分化，可育雄蕊的花藥發育早于退化雄蕊和柱頭。（3）紫紋兜蘭的花藥具有一對側生花藥室和不育隔膜組織的分化，與同屬植物記錄的各有4室花藥和4個小孢子囊的結果均不同，值得關注。（4）絨氈層細胞核數目或許可用于兜蘭屬和杓蘭屬間界限劃分的依據之一，前者為雙核，后者為單核。（5）紫紋兜蘭花藥發育的胚胎學特征與相關蘭科類群存在明顯異同，具有一定的分類學意義，包括花藥室的數目、花藥壁的發育類型、絨氈層的細胞核數目、胞質分裂類型、小孢子四分體的排列形式等。（6）現有資料表明花形態和花藥發育胚胎學特征在蘭科不同分類群間均有明顯差異（Aybeke， 2012; Sriyot et al.， 2015; 譚慶琴等，2020），但研究過的類群不足200種（作者初步統計）。因此，有必要選擇種以上的分類群（組、亞屬、屬、亞族、族、亞科）為代表開展研究，逐步積累資料，為解決有爭議的分類系統學問題提供花形態和胚胎學證據（Swamy， 1949; Kant， 2010; Kant & Goel， 2013; Valencia-Nieto et al.， 2016）。

致謝 ?云南豐春坊生物科技有限公司王曉云女士和徐志峰先生提供實驗材料，西南林業大學云南生物多樣性研究院提供實驗平臺，古旭老師提供實驗指導，在此一并謹表謝意。

參考文獻：

AT WOOD J， 1984. The relationships of the slipper orchids （Subfamily Cypripedioideae） ?［J］. Selbyana， 7： 129-247.

AYBEKE M， 2012. Anther wall and pollen development in Ophrys mammosa L. （Orchidaceae） ?［J］. Plant Syst Evol， 298（6）： 1015-1023.

BHANWRA RK， VIJ SP， 2003. The development of anther and male gametophyte in Eulophia hormusjii Duthie （Orchidaceae） ［J］. J Orchid Soc Ind， 17（1-2）： 87-91.

BHANWRA RK， VIJ SP， KANT R， et al.， 2006a. Pollinium development in Epipactis veratrifolia ?［J］. J Orchid Soc India， 20（1-2）： 1-6.

BHANWRA RK， VIJ SP， CHANDEL V， et al.， 2006b. Development of polliniumin two epidendroid orchids ?［J］. Curr Sci， 90： 1384-1387.

BROWN RC， LEMMON BE， 1996. Nuclear cytoplasmic domains， microtubules and organelles in microsporocytes of the slipper orchid Cypripedium californicum A. Gray dividing by simultaneous cytokinesis ?［J］. Sex Plant Reprod， 9（3）： 145-152.

BURNS BALOGH P， BERNHARDT P， 1985. Evolutionary trends in the androecium of the Orchidaceae ?［J］. Plant Syst Evol， 149（1）： 119-134.

CHASE MW， CAMERON KM， FREUDENSTEINET JV， et al.， 2015. An updated classification of Orchidaceae ?［J］. Bot J Linn Soc， 177（2）： 151-174.

CHEN XQ（SC）， LIU ZJ， LUO YB， 2009. A field guide to the orchids of China ?［M］. Beijing： China Forestry Publishing House. ［陳心啟， 劉仲健， 羅毅波， 2009. 中國蘭科植物鑒別手冊 ［M］. 北京： 中國林業出版社.］

CHOCHAI A， LEITCH IJ， INGROUILLE MJ， et al.， 2012. Molecular phylogenetics of Paphiopedilum （Cypripedioideae; Orchidaceae） based on nuclear ribosomal ITS and plastid sequences ?［J］. Bot J Linn Soc， 170： 176-196.

COX AV， PRIDGEON AM， ALBERT VA， et al.， 1997. Phylogenetics of the slipper orchids （Cypripedioideae， Orchidaceae）： nuclear rDNA ITS sequences ?［J］. Plant Syst Evol， 208（3）： 197-223.

CRIBB PJ， 1987. The genus Paphiopedilum ?［M］. London： Collingridge.

CRIBB PJ， 1998. The genus Paphiopedilum ?［M］. Kota Kinabalu： Natural History Publications （Borneo） in Association with Royal Botanic Gardens Kew.

DRESSLER RL， 1986. Features of pollinaria and orchid classification ?［J］. Lindleyana， 1（2）： 125-130.

DRESSLER RL， 1993. Phylogeny and classification of the orchid family ?［M］. Cambridge： Cambridge University Press.

FREUDENSTEIN JV， HARRIS EM， RASMUSSEN FN， 2002. The evolution of anther morphology in orchids： incumbent anthers， superposed pollinia， and the vandoid complex ?［J］. Am J Bot， 89（11）： 1747-1755.

FREUDENSTEIN JV， RASMUSSEN FN， 1996. Pollinium development and number in the Orchidaceae ?［J］. Amer J Bot， 83（7）： 813-824.

FREUDENSTEIN JV， RASMUSSEN FN， 1997. Sectile pollinia and relationships in the Orchidaceae ?［J］. Plant Syst Evol， 205： 125-146.

FURNESS CA， RUDALL PJ， 1999. Microsporogenesis in monocotyledons ?［J］. Ann Bot， 84（4）： 475-499.

FURNESS CA， RUDALL PJ， SAMPSON FB， 2002. Evolution of microsporogenesis in angiosperms ?［J］. Int J Plant Sci， 163（2）： 235-260.

GHIMIRE B， SON SW， KIM JH， et al.， 2020. Gametophyte and embryonic ontogeny： understanding the reproductive calendar of Cypripedium japonicum Thunb. （Cypripedoideae， Orchidaceae）， a ladys slipper orchid endemic to East Asia ?［J］. BMC Plant Biol， 20（20）： 426.

GUIGNARD L， 1882. Recherches sur le d6veloppement de l'anth6re et du pollen chez les Orchid6es ?［J］. Ann Sci Natur-Bot Biol Veg， 6. s6r， 14： 26-45.

HARDER LD， JOHNSON SD， 2008. Function and evolution of aggregated pollen in angiosperms ?［J］. Int J Plant Sci， 169（1）： 59-78.

HU SY， 1982. Embryology of angiosperms ?［M］. Beijing： Higher Education Press. ?［胡適宜， 1982. 被子植物胚胎學 ［M］. 北京： 高等教育出版社.］

HU SY， 2005. Reproductive biology of angiosperms ?［M］. Beijing： Higher Education Press： 29-92. ［胡適宜， 2005. 被子植物生殖生物學 ［M］. 北京： 高等教育出版社： 25-92.］

JOHNSON SD， EDWARDS TJ， 2000. The structure and function of orchid pollinaria ?［J］. Plant Syst Evol， 222： 243-269.

JOHRI BM， AMBEGAOKAR KB， SRIWASTAVA PS， 1992. Comparative embryology of angiosperm ?［M］. Berlin Heidelberg： Springer.

KANT R， 2011. Development of monads and associated changes in anther in Cypripedium cordigerum D. Don： A rare orchid ?［J］. Vegetos， 24（1）： 103-110.

KANT R， 2019. Development of pollinium and associated changes in anther of Calanthe tricarinata Lindl.， an epidendroid orchid ?［J］. Taiwania， 64（3）： 269-279.

KANT R， 2023. Development of anther and sectile pollinium in Herminium lanceum （Thunb. ex Sw.） Vuijk — a massulate orchid ?［J］. Isr J Plant Sci， 1（aop）： 1-8.

KANT R， BHANWRA RK， 2010. Development of anther in relation to sectile pollinium in Zeuxine strateumatica （Lindl.） Schltr ?［J］. J Biol Life Sci， 1（1）： 5-12.

KANT R， GOEL S， 2013. Development of anther in Goodye rarepens （L.） R. Br.： A massulate orchid ?［J］. Vegetos， 26（1）： 9-18.

KANT R， HOSSAIN MM， 2010. Development of pollinium in Malaxis muscifera （Lindl.） Kuntze ?［J］. Bangladesh J Bot， 39（2）： 193-198.

KANT R， HOSSAIN MM， ATTRI LK， 2013. Pollinium development in Spiranthes sinensis （Pers.） Ames. and Cymbidium pendulum SW： A comparative study ?［J］. Bangladesh J Bot， 42（2）： 307-314.

KARASAWA KA， 1980. Karyomorphological studies on two species of Paphiopedilum ?［J］. Bull Hiroshima Bot Gard， 3： 69-74.

KARASAWA KA， 1982. revision of the genus Paphiopedilum （Orchidaceae） ?［J］. Bull Hiroshima Bot Gard， 5： 1-69.

KOCYAN A， ENDRESS PK， 2001. Floral structure and development and systematic aspects of some ‘lower Asparagales ?［J］. Plant Syst Evol， 229（3）： 187-216.

LANG KY， 1999. Flora Reipublicae Popularis Sinicae （Orchidaceae Ⅰ）： Vol. 17 （in Chinese） ?［M］. Beijing： Science Press： 54-71. ?［郎楷永， 1999. 中國植物志（蘭科一）： 第十七卷 ［M］. 北京： 科學出版社： 54-71.］

LI L， 2023. Research progress on diversity of androecium development of Orchidaceae ?［J］. Guihaia， 43（8）： 1537-1552. ［李璐， 2023. 蘭科雄蕊發育多樣性研究進展 ［J］. 廣西植物， 43（8）： 1537-1552.］

LI L， ZHANG J， LI CR， et al.， 2020. Pollinia development in a new species of Pennilabium yunnanense （Orchidaceae） ?［J］. Bull Bot Res， 40（2）： 161-171. ［李璐， 張錦， 李楚然， 等， 2020. 蘭科新種巾唇蘭的花粉團發育及分類學意義 ［J］. 植物研究， 40（2）： 161-171.］

LI P， LUO YB， DENG YX， et al.， 2008. Pollination of the ladys slipper Cypripedium henryi Rolfe （Orchidaceae） ?［J］. Bot J Linn Soc， 156： 491-499.

LIU ZJ， CHEN XQ（SC）， CHEN LJ， et al.， 2009. The genus Paphiopedilum in China ?［M］. Beijing： Science Press. ?［劉仲健， 陳心啟， 陳利君， 等， 2009. 中國兜蘭屬植物 ［M］. 北京： 科學出版社.］

MAHESHWARI P， NARAYANASWAMI S， 1952. Embryological studies on Spiranthes australis Lindl ?［J］. Bot J Linn Soc， 53（355）： 474-486.

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， State Forestry and grassland administration， 2021. List of national key protected wild plants in China ?［R］. Beijing： Ministry of Agriculture and Rural Affairs， State Forestry and Grassland Administration. ?［國家林業和草原局 農業農村部， 2021. 國家重點保護野生植物名錄 ［R］. 北京： 國家林業和草原局 農業農村部.］

PODDUBNAYA-ARNOLDI VA， 1960. Study of fertilization in the living material of some angiosperms ?［J］. Phytomorphology， 10（1）： 185-198.

PRIDGEON AM， CRIBB PJ， CHASE MW， et al.， 1999. Genera Orchidacearum： Vol. 1： Apostasioideae and Cypripedioideae ?［M］. Demand： Oxford University Press.

RAO PRM， SOOD SK， 1979. Life history of Satyrium nepalense （Orchidaceae） ?［J］. Norw J Bot， 26（4）： 285-294.

REN L， WANG FX， 1987. Embryology of Paphiopedilum ?［J］. J Intedr Plant Biol， 29（1）： 14-22. ?［任玲， 王伏雄， 1987. 兜蘭胚胎學的研究 ［J］. 植物學報， 29（1）： 14-22.］

SHI J， CHENG J， LUO D， et al.， 2007. Pollination syndromes predict brood-site deceptive pollination by female hoverflies in Paphiopedilum dianthum （Orchidaceae） ?［J］. Acta Phytotaxon Sin， 45（4）： 551-560. ［史軍， 程瑾， 羅敦， 等， 2007. 利用傳粉綜合征預測： 長瓣兜蘭模擬繁殖地欺騙雌性食蚜蠅傳粉 ［J］. 植物分類學報， 45（4）： 551-560.］

SINGER RB， BARBARA G， CROSS H， et al.， 2008. The use of Orchid pollinia or pollinaria for taxonomic identification ?［J］. Selbyana， 29（1）： 6-19.

SOOD SK， 1986. Gametogenesis， integuments initiation and embryogeny in three species of Habenaria （Orchidaceae， Orchideae） ?［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 96（6）： 487-494.

SOOD SK， 1988. Development of gametophytes， embryogeny and pericarp in Goodye rarepens （Orchidaceae， Neottieae） ?［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 98（2）： 149-156．

SOOD SK， 1989. Embryology and systematic position of Liparis （Orchidaceae） ?［J］. Plant Syst Evol， （166）： 1-9.

SOOD SK， 1997. Gametogenesis， seed development and pericarp in Epipactis latifolia L. ?［J］. J Indian Bot Soc， 76： 11-15.

SOOD SK， RAO PRM， 1986. Development of male and female gametophytes in Herminium angustifolium （Orchidaceae） ?［J］. Phytomorphology， 36： 11-15.

SOOD SK， RAO PRM， 1988. Studies in the embryology of the diandrous orchid Cypripedium cordigerum （Cypripedieae， Orchidaceae） ?［J］. Plant Syst Evol， 160（3-4）： 159-168.

SRIYOT N， THAMMATHAWORN A， THEERAKULPISUT P， 2015. Embryology of Spathoglot tisplicata Blume： A reinvestigation and additional data ?［J］. Trop Nat Hist， 15（2）： 97-115.

SWAMY BGL， 1946. The embryology of Zeuxine sulcata Lindl ?［J］. New Phytol， 45（1）： 132-136.

SWAMY BGL， 1949. Embryological studies in Orchidaceae， I： Gametophytes ?［J］. Amer Midland Natur， 41： 184-201.

TAN QQ， LI L， ZHANG J， et al.， 2020. Pollinia development in ?Arundina graminifolia （Orchidaceae） with taxonomic implications ?［J］. Guihaia， 40（1）： 83-94. ［譚慶琴， 李璐， 張錦， 等， 2020. 傳統傣藥竹葉蘭的花粉團發育及分類學意義 ［J］. 廣西植物， 40（1）： 83-94.］

TSAI CC， LIAO PC， KO YZ， et al.， 2020. Phylogeny and historical biogeography of Paphiopedilum Pfitzer （Orchidaceae） based on nuclear and plastid DNA ?［J］. Front Plant Sci， 11： 126.

VALENCIA-NIETO B， SOSA V， MARQUEZ-GUZMAN J， 2016. Late stages of anther development and anther attributes in Microepidendrum differs from other genera of Epidendrum alliance （Orchidaceae） ?［J］. Flora Morphol Distrib Funct Ecol Plants， 218： 35-43.

VIJ SP， SHARMA M， 1987. Embryological studies in Orchidaceae. V. Epipactis Adams ?［J］. Phytomorphology， 37（1）： 81-86.

ZHANG J， ZHANG H， LI L， et al.， 2019. Pollinia development in rare orchid of Vanda coerulea with its taxonomic implications ?［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 39（7） ： 1143-1153. ?［張錦， 張輝， 李璐， 等， 2019. 珍稀瀕危植物大花萬代蘭的花粉團發育及其分類學意義 ?［J］. 西北植物學報， 39（7）： 1143-1153.］

（ 責任編輯 周翠鳴 ）

收稿日期： ??2023-09-01

基金項目： ??國家自然科學基金（32060049）; 云南省人社廳基層專家工作站。

第一作者： ?朱永（1997-），碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護研究，（E-mail）822512121@[KG-0.5mm]qq.com。

* 通信作者： ??李璐，博士，副研究員，研究方向為植物系統與進化、植物形態解剖學，（E-mail）lilusaraca@foxmail.com， lilu@swfu.edu.cn。