瓜氨酸對輻射致小鼠腸道損傷的防護作用及機制研究

豐俊東 劉亮 劉雯倩 李騫 田劉欣 何承宇 薄宏宇王維泰 楊穎清

1（南京航空航天大學 南京 210016）

2（山東省濰坊市人民醫院 濰坊 261000）

現如今，電離輻射在多個領域展現出良好的發展與應用前景，尤其是醫療領域［1］。伴隨著電離輻射的發展，研究發現其對多個領域的從業人員都可能存在潛在危害［2-3］，電離輻射對人體的不同組織都會產生損傷，包括生殖器官損傷［4］、脾臟損傷［5］、胃腸道損傷等。由于胃腸道對電離輻射的敏感性，其導致了復雜的病理過程，如吸收不良、細菌性腸炎、腹瀉等，阻礙治療進展，甚至導致死亡［6］，因此，輻射防護尤為重要。在我們早期研究中發現，電離輻射損傷引起的敏感代謝物有瓜氨酸（Citrulline，Cit）、肌酸、脯氨酸和尿酸。瓜氨酸為α氨基酸，主要產生于腸道。由于瓜氨酸與腸道有較為緊密的相關性，血漿瓜氨酸水平與X射線誘導小腸上皮細胞損傷和小腸形態具有密切聯系，其可能作為評估電離輻射致小腸損傷最有前途的生物標志物之一，具有較好的應用前景［7-8］。瓜氨酸對于急性腸損傷狀態下的小鼠腸黏膜上皮細胞形態及功能有促進作用［9］，補充外源性瓜氨酸對于潰瘍性結腸炎的腸道炎癥損傷具有保護作用［10］，也可以抑制膿毒癥早期促炎因子的釋放，減輕心、肝、腎等機體重要臟器的炎癥反應程度［11-12］，減輕腸黏膜組織炎癥反應，降低受損腸黏膜的通透性，同時口服瓜氨酸可以保護腸道黏膜的破壞和腸道屏障功能［13］。因此，瓜氨酸可能是一種很有潛力針對輻射致腸道損傷的防護藥物。

瓜氨酸是精氨酸（Arginine，ARG）的代謝產物［14］。其作為一種有機補充劑，在恢復敗血癥危重患者精氨酸代謝方面具有治療潛力［15-16］，補充L-瓜氨酸可通過促進腸道形態發育和氨基酸轉運而產生節約精氨酸的效果［17］，并且口服瓜氨酸不會為胃腸道帶來更多負擔［18］。此外，長期給用瓜氨酸治療尿素循環缺陷患者沒有任何副作用［19］?？诜习彼嵩诟纳品蔷凭灾靖?、腸道疾病、心血管疾病等方面都有一定的作用［20-21］。一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和誘導型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）在瓜氨酸代謝循環中起到了重要作用，黏著斑激酶（Focal Adhesion Kinase，FAK）為腸細胞遷移的信號分子，可以促進腸道黏膜修復，Occludin是一種腸道緊密連接蛋白，可以維持腸道屏障功能，我們通過上述指標來論述瓜氨酸對腸道的保護作用。

本文擬利用γ射線對小鼠進行全身照射，構建急性輻射致腸道損傷動物模型，并通過補充外源性瓜氨酸，研究瓜氨酸對輻射致腸道損傷的影響，探討瓜氨酸對輻射致腸道損傷治療的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗動物：ICR小鼠（Institute of Cancer Research Mouse）起源于美國的癌癥研究機構，本研究中ICR小鼠（SPF級）購自南京市江寧區青龍山動物養殖場（江蘇南京）。許可證號為：SCXK（豫）2020-0001。體重約為20 g，周齡在8～10周，動物室籠中飼養1周，動物室的條件為：溫度23 ℃左右、濕度55%左右、明暗周期12 h。實驗符合倫理要求，在保證實驗能夠正常進行的條件下，盡量減少實驗小鼠的使用數量以及實驗過程中盡量減輕其痛苦。

材料與試劑：L-瓜氨酸（純度>99%）購買于上海Macklin公司；NO測定試劑盒、iNOS分型試劑盒均購自南京建成公司；β-actin一抗、山羊抗兔二抗、兔抗小鼠Occludin多克隆抗體、兔抗小鼠FAK多克隆抗體均購自英國Abcam公司。

主要儀器與設備：γ射線采用南京航空航天大學輻照中心60Co源，輻射源活度為6.1124×1015Bq，劑量場采用重鉻酸銀劑量計（量程0.5～5 kGy）測量，劑量率為1.06 Gy?min-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物與分組

設置空白對照組、單純輻照組（全身照射，Total Body Irradiation，TBI）、輻照+瓜氨酸組，每組15只。瓜氨酸腹腔注射0.15 mL，注射劑量為1 g?kg-1?d-1［22］，輻照后每天注射一次，持續一周。對照組給予生理鹽水，腹腔注射0.15 mL，每天一次，其他環境均相同。輻射劑量為8 Gy、10 Gy和12 Gy，全身照射。記錄各組小鼠體重、毛發、糞便、生存狀態和生存期，于輻照后第8天取材，檢測小鼠腸道組織形態學、血漿內毒素、腸道NO與iNOS、腸道組織黏著斑激酶和腸道緊密連接蛋白水平開展機制研究。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察腸道組織

在全身輻照后的第8天對小鼠取材，將取得的小腸組織浸泡至磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶液中。為保存小腸組織的形態，將小鼠小腸固定在10%的中性福爾馬林溶液中，隨后在濃度為10%的乙二胺三乙酸微波脫鈣，并進行石蠟包埋、連續切片展片的操作。最后將石蠟切片染色晾干，鏡下觀察。

1.2.3 血漿中內毒素(Lipopolysaccharide，LPS)檢測

眼球取血，迅速于3000 r?min-1的離心機中離心2 min，吸出富含血小板的血漿上清液，置于2～8 ℃備用。將血漿和樣本處理液按照1∶9混勻，制成10倍稀釋液備用。將10倍稀釋液于70 ℃水浴鍋中加熱10 min，然后用冰水冷卻3 min。血漿內毒素試劑盒具體步驟如下：配置細菌內毒素標準溶液，溶解試劑盒中的試劑，將上述稀釋液和空白對照組（內毒素檢查用水）按照試劑盒中的步驟添加混勻和溫育，最后靜置5 min，在酶標儀545 nm處讀取吸光度。

1.2.4 腸道組織NO、iNOS檢測

小鼠麻醉后頸椎脫臼法致死，剪開腹部取小鼠腸道組織一段，用冷生理鹽水沖洗掉腸道內容物和表面血液，按照重量∶體積=1∶9加入預冷生理鹽水后低溫研磨，制成10%的腸道組織勻漿，離心，按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書操作。

1.2.5 免疫印跡法檢測FAK和Occludin

用PBS溶液沖洗腸道組織，裂解，提取蛋白。使用聚氰基丙烯酸正丁酯（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白試劑盒測定溶液蛋白濃度。蛋白質在200 V下分離，在100 V下電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）上。用含0.4%Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液（Tris Buffered Saline，TBST）和5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜，分別加入FAK和Occludin的一抗工作液，后加入用TBST按照1∶5000的比例進行稀釋的二抗。最后用化學發光底物（Enhanced Chemiluminescence，ECL）試劑盒對整張膜進行顯影定型。用ImageJ程序對實驗結果進行數據量化。

1.3 數據統計與分析

各組數據采用平均數±標準差（Mean±SD）表示，使用GraphPad Prism 9.0軟件（GraphPad，San Diego，CA，United States）。采用單因素方差分析（One-way variance，ANOVA）和Tukey的多重比較檢驗比較兩組間的差異。p＜0.05視為統計學上有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重和生存時間變化

對照組小鼠行為敏捷，反應迅速，飲食正常，排便正常。受照射小鼠出現精神萎靡，毛發凌亂，排便較稀。10 Gy輻照生存時間如圖1所示（藍色箭頭表示10 Gy組中位生存期，紅色箭頭表示10 Gy+Cit組的中位生存期），瓜氨酸給藥組的中位生存期為13 d，與單純輻照組相比，中位生存期延長3 d（p＜0.05）（圖1）。8 Gy與12 Gy輻照小鼠體重如圖2所示（*表示p＜0.05，**表示p＜0.001），輻照后小鼠體重顯著降低，與單純輻照組相比，腹腔注射瓜氨酸能夠顯著增加輻照小鼠的體重。

圖1 瓜氨酸對輻照小鼠生存時間的影響（彩圖見網絡版）Fig.1 The effect of citrulline on the survival time of irradiated mice (color online)

圖2 瓜氨酸對輻照小鼠體重的影響Fig.2 The effect of citrulline on the body weight of irradiated mice

2.2 腸道組織形態學變化與血漿內毒素含量

對照組腸道光滑無黏連、腸管紅潤有光澤，腹腔中無積液，肉眼可見腸壁完整無出血點；單純輻照組小鼠的腸道顏色偏深紫色，出現腸黏連，腹腔中有積液，肉眼可見部分腸管狹窄，腸壁出現明顯的出血點，且腸道內容物呈水樣便；而瓜氨酸給藥組的腸道顏色較輻照組紫色較淺，腸壁出血點明顯減少。HE染色的結果如圖3所示，8 Gy輻照后腸黏膜上皮細胞出現變性，無明顯壞死，無潰瘍形成，12 Gy輻照后損傷程度較8 Gy有較為明顯的加重，出現炎細胞。給予瓜氨酸8 d后的HE染色結果發現，不同劑量輻照組均出現一定程度的損傷修復。

圖3 輻照組小鼠和瓜氨酸給藥組小鼠的腸道組織HE染色（×200）Fig.3 HE staining of the intestinal tissue from irradiated mice and citrulline-treated mice (×200)

血漿中內毒素的含量可以用來表征腸道屏障的通透性，血漿中內毒素的含量檢測結果如圖4所示（**表示p＜0.01，****表示p＜0.0001），結果表明輻照組內毒素含量與對照組相比顯著升高（p＜0.05），腹腔注射瓜氨酸后能顯著降低血漿中內毒素的含量（p＜0.05），達到與對照組相比無顯著性差異（p＞0.05），這一結果提示，瓜氨酸能夠調節輻照小鼠腸道屏障的通透性。

圖4 輻照小鼠和腹腔注射瓜氨酸給藥組小鼠血漿中內毒素含量Fig.4 Endotoxin content in the plasma of irradiated mice and the mice treated with intraperitoneal injection of citrulline

2.3 腸道組織NO、iNOS、FAK、Occludin蛋白含量檢測

檢測了小鼠腸道中NO和iNOS的表達情況。結果如圖5所示（***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001），輻照后小鼠腸道的NO和iNOS的表達上升，而瓜氨酸腹腔注射后顯著降低了NO和iNOS的表達量，提示補充瓜氨酸使代謝循環中iNOS依賴的NO合成正?；?。

圖5 輻照小鼠腸道組織中NO和iNOS的含量Fig.5 The content of NO and iNOS in the intestinal tissue of irradiated mice

通過免疫印跡檢測了FAK和Occludin在小鼠腸道組織的表達情況。結果如圖6所示（**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001），輻照后FAK表達量出現顯著下降，下降趨勢有劑量依賴性，而腹腔注射瓜氨酸后，表達量出現顯著的上升；輻照后Occludin蛋白表達量顯著下降，下降趨勢隨著輻照劑量增大而降低，而瓜氨酸注射后，表達量出現顯著上升。實驗結果提示，瓜氨酸對輻射損傷后腸黏膜屏障有修復和保護的作用。

圖6 輻照小鼠腸道組織FAK和Occludin表達量的變化Fig.6 The changes of FAK and Occludin expression in the intestinal tissue of irradiated mice

3 討論

本研究采用γ射線對小鼠進行全身照射，構建急性輻射致腸道損傷動物模型，補充外源性瓜氨酸，探討瓜氨酸對輻射致腸道損傷的修復作用。結果顯示，輻射加瓜氨酸組與對照組和單純輻照組相比，瓜氨酸可以顯著提高急性輻射損傷小鼠的存活時間，并且能夠有效減緩輻照損傷帶來的體重下降。Villareal等［23］的一項研究表明，口服瓜氨酸15 d可以顯著提高小鼠骨骼肌的重量，增強小鼠的運動能力。瓜氨酸導致體重增長的原因可能與瓜氨酸促進生長相關激素分泌以及瓜氨酸的生理代謝過程有關，瓜氨酸能夠促進肌肉蛋白質合成［23-24］，飼糧中添加不同劑量的瓜氨酸能夠顯著增加肉雞、黃顙魚幼魚、小鼠、湖羊母羊及肉兔的體重［25-26］。此外，在結腸炎小鼠模型中，給予瓜氨酸能夠顯著提高小鼠的存活率［27］，這與我們的研究結果相近。

腸道損傷會導致腸道黏膜通透性升高，屏障功能障礙，最終使得腸腔內的革蘭氏陰性菌及其產物（內毒素）易位入血［28］。本實驗發現，輻照后小鼠腸道受損，血漿中內毒素含量增高。瓜氨酸給藥一周后，輻射致腸道損傷得到緩解，血漿內毒素含量下降。Sellmann等［29］也報道了類似的結果，他們采用非酒精性脂肪肝模型，發現口服瓜氨酸可以保護腸道黏膜和腸道屏障功能。Batista等［30］在細菌移位小鼠模型中也證明了瓜氨酸能夠降低小鼠腸道黏膜損傷，且保存了更多的完整絨毛結構。Zoghroban等［31］在蘭氏賈第蟲感染的小鼠模型中加入瓜氨酸發現腸道刷狀緣恢復，炎癥浸潤減少。5-氟尿嘧啶致腸黏膜炎模型的小鼠中，瓜氨酸保護小腸黏膜結構完整性，降低腸道通透［32］。FAK為腸細胞遷移的信號分子，可以促進腸道黏膜修復；Occludin是一種腸道緊密連接蛋白，可以維持腸道屏障功能。在Ho等［33］的研究中，富含L-瓜氨酸的發酵乳與瑞士乳桿菌可恢復右旋糖酐硫酸誘導的Occludin在內的腸道緊密連接蛋白水平下降。本實驗結果顯示，輻照后FAK、Occludin表達量顯著下降，腹腔注射瓜氨酸后，表達量出現顯著的上升，進一步提示瓜氨酸對輻射損傷后腸黏膜屏障具有修復作用。

一方面瓜氨酸參與精氨酸合成，另一方面精氨酸可以在iNOS的誘導下，生成瓜氨酸，同時伴有大量NO的生成。電離輻射損傷可通過自由基介導，此外有研究表明，電離輻射可以增強體內精氨酸參與的iNOS對NO的生物合成［34-35］。NO能與氧自由基快速反應形成過氧亞硝酸根離子，這是一種強細胞毒性氧化劑，可以攻擊DNA、脂質和蛋白質等成分，導致細胞功能受損同時增強炎癥反應［36］。已有研究提出，ROS是啟動子，NO是響應電離輻射激活細胞信號轉導途徑的效應因子之一［37］?；诠习彼岬拇x循環通路以及輻射損傷的特點，我們研究了瓜氨酸對iNOS和NO的表達量的影響。結果顯示，電離輻射引起小鼠iNOS和NO表達大量升高，瓜氨酸能夠顯著降低iNOS和NO的表達，從而減弱過量NO介導的細胞毒性。有研究證實，瓜氨酸可以促進肝臟、大腦等器官iNOS和NO合成正?；?8］，Rajcic等［39］證明給予非酒精性脂肪肝小鼠瓜氨酸，同樣也能夠使小鼠小腸中亞硝酸鹽和iNOS的含量降低，這與我們的發現一致。提示瓜氨酸有望起到輻射防護的作用。

綜上所述，在本實驗的研究條件下，輻照后持續一周腹腔注射1 g?kg-1?d-1的瓜氨酸，能顯著增加小鼠體重、存活率，降低血漿中內毒素、腸道中NO和iNOS的含量，提高FAK和Occludin的表達，提示我們瓜氨酸可能通過增強腸道屏障功能、代謝循環正?；途徑鈦喯趸瘧て鸬捷椛鋼p傷的防護作用，有望作為一種有效的有潛力針對輻射腸道損傷的治療藥物。

作者貢獻聲明豐俊東負責文章統籌規劃和審閱；劉亮進行文章撰寫、實驗；劉雯倩提供文章整體思路及實驗流程；李騫負責對實驗流程審核以及文章的修改；田劉欣、何承宇、薄宏宇、王維泰、楊穎清參與實驗，處理數據等。