蛹蟲草有效成分提取及活性分析

蘆 葉 李 麗 劉舒欣 曲葉麗 姜雯琪* 王作新 趙洪新*

（1浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江杭州 310018；2上海特萊維護膚品股份有限公司，上海 201706）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱黃金草、北蟲草，是寄生于昆蟲中食用、藥用兼具的真菌，屬于蛹草科和子囊菌科，與著名中藥冬蟲夏草具有相似的藥理活性[1]，是一種藥用價值很高的珍稀大型食藥用真菌。蛹蟲草富含多糖、生物堿、氨基酸、蟲草素、蟲草酸、甾醇等[2]活性物質，具有保濕、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖以及免疫調節等功效。蛹蟲草多糖可用于化妝品中，且制作的蛹蟲草多糖護膚化妝品穩定、安全、高效[3]。

目前，蛹蟲草提取物（Cordyceps militarisextract，CME）的提取方法較多，常用方法有水提法[4]、醇提法[5]、超臨界CO2提取法[6]、超聲輔助提取法[7]、微波輔助提取法[8]等。通過不同提取方法獲取的提取物成分及含量也不同，對應的功效也有所差異?，F有文獻中，CME的提取方法多采用超聲輔助提取法，此法更加簡便高效[9]。

筆者采用超聲輔助提取制備CME，通過單因素試驗和L9正交試驗法優化CME提取條件，檢測CME中多糖、總黃酮含量并探究其抗氧化性能、保濕性能，為開發蛹蟲草系列等特色化妝品奠定理論基礎及技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蛹蟲草（C.militaris）子實體干品，沈陽蟲林密寶北蟲草食品科技有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

試劑：羥自由基清除能力檢測試劑盒Fenton比色法（北京雷根生物技術有限公司）；葡萄糖（優級純，上海麥克林生化科技股份有限公司）；蘆?。▋灱壖?，上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

主要儀器：SW 30 H超聲波清洗器（Elma Schmidt Bauer Limited）、RE-52 AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-Ⅲ循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、ROTINA 380R高速離心機（德國Hettich科學儀器有限公司）、UV756RT紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、10 A真空冷凍干燥機（賽飛（中國）有限公司）、GDN-300 A恒溫恒濕培養箱（寧波揚輝儀器有限公司）、PB-10 pH計（賽多利斯科學儀器有限公司）、Synergy HTX多功能酶標檢測儀（美國BIOTEX公司）。

1.3 CME提取工藝優化

1.3.1 單因素提取工藝優化

蛹蟲草干品粉碎后過篩（孔徑0.178 mm），稱1 g蛹蟲草粉，與一定體積去離子水混合于錐形瓶中，室溫下浸泡24 h。選取適當的提取溫度、水料比、提取時間和提取次數進行超聲波輔助（35 kHz）提取，提取液真空抽濾，取濾液真空旋蒸，旋蒸后的濃縮液緩慢滴加無水乙醇（濃縮液∶無水乙醇體積（mL）比=1∶4），于4 ℃冰箱靜置約12 h。將靜置液離心，棄上清，用丙酮充分洗滌沉淀，室溫下靜置過夜。再用無水乙醇充分洗滌沉淀，后過濾、干燥。將干燥物溶解于40 mL去離子水中，置于-80 ℃冰箱反復凍融，使蛋白質變性、降解，離心后棄沉淀取上清，重復以上操作直至離心后無沉淀析出，初步去除蛋白質。提取液按照體積（mL）比4∶1與sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）混合，在搖床上充分振蕩后離心取上清液，上述操作重復5次以上，離心至溶液無中間層出現，徹底去除剩余雜質蛋白。上清液經冷凍干燥處理即可得到蛹蟲草提取物（CME）。

以CME提取率為評價指標，比較分析超聲輔助提取法提取過程中水（mL）料（g）比（25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1），提取次數（1次、2次、3次、4次、5次），提取時間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min），提取溫度（65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃）。CME得率計算公式如下：

CME提取率（%）=M1/M2×100%

注：M1為CME的質量，單位為g；M2為蛹蟲草干品的質量，單位為g。

1.3.2 正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，以水料比、提取次數、提取時間、提取溫度4個因素為自變量設計正交試驗，確定最佳提取條件。

1.4 生物活性成分測定

1.4.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]（以葡萄糖為多糖標準品）制作標準曲線，根據標準曲線計算CME的多糖含量。

配制待測液：將0.01 g CME溶于1 mL去離子水中。0.2 mL 5%苯酚溶液加入待測溶液中搖勻，加入1 mL濃硫酸溶液混勻，放入沸水內煮15 min，然后立即放入冰盒中冷卻5 min。于紫外分光光度計490 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值。根據標準曲線，計算CME的多糖含量。

1.4.2 總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉硝酸鋁比色法[11]（以蘆丁為黃酮標準品）制作標準曲線，根據標準曲線計算CME的總黃酮含量。

配制待測液：將0.01 g CME溶于1 mL 70%乙醇中。60 μL 5%NaNO2溶液加到待測溶液中搖勻并靜置5 min，加入60 μL 10%Al（NO3）3溶液混勻，靜置5 min，再加入0.8 mL 4%NaOH溶液混勻，最后加入80 μL 70%乙醇混勻，靜置15 min。96孔板中每孔加入200 μL，設置3個復孔。于酶標儀510 nm處測定OD值，從而計算出CME的總黃酮成分的含量。

1.5 抗氧化能力測定

1.5.1 羥自由基清除能力測定

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的CME和0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的L-抗壞血酸，測定其羥基自由基清除率。根據羥自由基清除能力檢測試劑盒Fenton比色法說明書操作，于紫外分光光度計536 nm處測定OD值，三組平行測定后取平均值。根據公式計算各質量濃度L-抗壞血酸和CME的羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=（A2-A1）/（A0-A1）×100%

注：A2為測定組OD值；A1為對照組的OD值；A0為空白組的OD值

1.5.2 DPPH自由基清除能力測定[12]

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的CME與0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的L-抗壞血酸，測定其DPPH自由基清除率。A2組：1 mL樣品溶液和1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。A1組：1 mL樣品溶液和1 mL乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。A0組：1 mL去離子水和1 mL DPPH-乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。充分混勻后避光反應0.5 h，于紫外分光光度計517 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值，以L-抗壞血酸作為陽性對照。計算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A2-A1）/A0]×100%

1.5.3 ABTS自由基清除能力的測定[13]

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的CME與0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質量濃度的L-抗壞血酸測定其ABTS自由基清除率。按1∶1混合7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，室溫避光反應（14±2）h。使用前用無水乙醇稀釋約30倍使其在734 nm處OD值為0.68～0.72。A1組：30 μL樣品溶液和2.4 mL稀釋后的ABTS溶液混合。A2組：30 μL樣品溶液和2.4 mL無水乙醇混合。A0組：30 μL無水乙醇和2.4 mL稀釋后的ABTS溶液混合。充分混勻后室溫下避光孵育10 min，于紫外分光光度計734 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值，以L-抗壞血酸作為陽性對照。計算公式如下：

ABTS自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.4 總抗氧化能力測定（FRAP法）[14]

采用FRAP法測定CME的總抗氧化能力。配制300 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液、10 mmol/LTPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3，按照10∶1∶1混合成FRAP工作液（現配現用），FRAP工作液使用前放入37 ℃水浴鍋中孵育5 min。將80 μL濃度為50～800 μmol/L的FeSO4和0.72 mL FRAP工作液混合，37 ℃孵育4 min，于593 nm處測定OD值，并繪制標準曲線（圖1）。測得的FeSO4標準曲線為y=0.0012x-0.0045，相關系數R2=0.9995，其中x為FeSO4濃度，y為吸光值。

圖1 FeSO4標準曲線

分別以0.08 mL的體積質量濃度分別為0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L的CME樣品溶液替代FeSO4標準液，與FRAP工作液混合均勻；同時用0.72 mL無水乙醇替代FRAP工作液，與0.08 mL不同質量濃度的CME樣品溶液反應，振蕩，37 ℃孵育4 min，于593 nm處測OD值，根據FeSO4標準曲線，求出的相應濃度即為FRAP值[15]。設置3組平行，以L-抗壞血酸作陽性對照。

1.6 保濕能力測定

根據QB/T 4256—2011[16]方法，化妝品及其原料保濕能力通常采取體外法的物理化分析法進行研究，采用稱重法評判CME的保濕性。精確稱量5.0 000 g去離子水、10% CME、10%甘油于稱量瓶中，將稱重后的樣品分別放入20 ℃相對濕度43%、20 ℃相對濕度85%恒溫恒濕培養箱內，分別在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h時稱取三者質量，設置3組平行進行測定。保濕率計算公式如下：

保濕率（%）=（M2-M1）/M0×100

注：M2為稱量瓶與樣品總質量；M1為稱量瓶質量；M0為樣品質量

1.7 數據處理與分析

均采用Graphpad Prism、Origin 2021處理數據并分析作圖，Adobe Illustrator 2020進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 水料比對CME提取率的影響

隨著水料比的增加，CME提取率先升高后降低，由圖2a可知，當水（mL）料（g）比從25∶1上升至40∶1時，CME提取率呈逐漸上升趨勢，CME提取率從3.88%增加到最大提取率5.33%。但若水料比繼續增加，提取率呈下降趨勢，其原因可能是水料比的增加使提取體系的傳熱功能降低，從而不利于提取物的成分溶解[17]。因此選取水料比（mL∶g）35∶1、40∶1和45∶1進行后續正交試驗。

圖2 CME提取單因素試驗結果

圖3 葡萄糖標準曲線

圖4 蘆丁標準曲線

2.1.2 提取次數對CME得率的影響

隨著提取次數的增加，CME提取率先升高后降低，由圖2b可知，提取次數≤3次時，CME提取率隨提取次數的增加而增加，提取3次時，CME提取率達5.10%，顯著高于提取2次時的CME提取率；提取次數超過3次，CME提取率會隨著提取次數的增加而略有下降，其原因可能是超過一定提取次數后，CME無法進一步溶解[18]。因此選取提取次數為2次、3次、4次進行后續正交試驗。

2.1.3 提取時間對CME提取率的影響

隨著提取時間的增加，CME得率先升高后降低，由圖2c可知，提取時間從35 min增加到75 min，CME提取率呈逐步上升趨勢，由3.88%上升到最大提取率5.01%，呈明顯上升趨勢。提取時間大于75 min，隨提取時間的延長，提取率反而下降?？赡茉谔崛r間小于75 min時，超聲波的破碎作用可以提高CME的提取率，同時超聲波對CME的降解作用影響較小，因此在此時間內CME提取率隨時間增加而提高[19]。但在75 min后，較長的時間使CME的降解作用影響變大，反而導致CME得率下降。因此選取提取時間60 min、75 min、90 min進行后續正交試驗。

2.1.4 提取溫度對CME提取率的影響

隨著提取溫度的升高，CME提取率先升高后降低，由圖2 d可知，隨著提取溫度升高，CME提取率先上升后下降，提取溫度為80 ℃時，CME提取率達到最高，為5.79%?？赡茉蚴?0～80 ℃時，隨著溫度不斷升高，溶質分子溶出的速度加快，從而提取率升高[20]。但隨著溫度繼續升高，可能CME結構發生改變，發生副反應等。因此，選取提取溫度為75 ℃、80 ℃、85 ℃進行后續正交試驗。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果設計正交試驗，見表1。由表2可知，對CME提取率影響最大的是提取溫度，其次是水料比、提取次數，提取時間對CME提取率的影響最小。超聲輔助提取CME的最佳提取工藝參數為A2B2C2D2，但因為正交試驗中沒有出現A2B2C2D2，所以進行該條件的補充實驗：在A2B2C2D2條件下提取CME，提取率為7.51%，均高于正交試驗的所有組合。因此超聲波輔助提取CME最佳的提取條件：提取溫度為80 ℃、水（mL）料（g）比為40∶1、提取次數為3次、提取時間為75 min為。

表1 試驗因素水平及編碼

表2 CME正交試驗結果

2.3 活性成分測定結果

2.3.1 多糖含量測定

葡萄糖的標準曲線為y=0.1228x+0.0839，R2=0.9877。根據葡萄糖標準曲線，計算CME的多糖含量為67.29%±0.58%。

2.3.2 總黃酮含量測定

蘆丁標準曲線為y=5.193 1x+0.063 8，R2=0.998 7。根據蘆丁標準曲線，CME總黃酮含量為1.93%±0.06%。

2.4 抗氧化能力測定結果

2.4.1 羥自由基清除能力測定

由圖5a可知，在質量濃度為0.06～1.92 g/L時，CME和L-抗壞血酸對羥自由基的清除能力均有明顯提升。CME對羥自由基的清除率從53.79%增加到65.04%，L-抗壞血酸對羥自由基的清除率從90.59%增加到98.77%。CME羥自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸羥自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升的趨勢變化較小。試驗結果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對羥自由基的清除率較弱，但CME依然表現出較強的清除羥自由基的能力。

圖5 CME抗氧化活性測定結果

2.4.2 DPPH自由基清除能力測定

由圖5b可知，在質量濃度為0.06～1.92 g/L時，CME和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力均有明顯增強的趨勢。CME對DPPH自由基的清除率從21.20%增加到53.30%，L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率從95.09%增加到96.24%。CME對DPPH自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升的趨勢變化較小。結果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對DPPH自由基的清除率較弱，但CME依然表現出比較強的清除DPPH自由基的能力。

2.4.3 ABTS自由基清除能力測定

由圖5c可知，在質量濃度為0.06～1.92 g/L時，CME和L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力均有明顯增強的趨勢。CME對ABTS自由基的清除率從11.27%增加到19.98%，L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除率從20.27%增加到98.01%。CME對ABTS自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力隨質量濃度增加而上升的趨勢變化較小。結果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對ABTS自由基的清除率較弱，但CME依然表現出比較強的清除ABTS自由基的能力。

2.4.4 總抗氧化能力測定（FRAP法）

由圖5d可知，在質量濃度為0.06～1.92 g/L時，CME和L-抗壞血酸的總抗氧化能力均有明顯增強的趨勢。CME對FRAP鐵離子的還原能力從2 192.24 μmol/L增加到2 575.75 μmol/L，L-抗壞血酸對FRAP鐵離子的還原能力從1 158.62 μmol/L增加到2 782.83 μmol/L。在質量濃度為0.06～0.24 g/L時，CME對FRAP鐵離子的還原能力明顯強于L-抗壞血酸，但隨著質量濃度的增加，L-抗壞血酸對FRAP鐵離子的還原能力逐漸強于CME。結果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對FRAP鐵離子的還原能力較弱，但CME依然表現出比較強的FRAP鐵離子的還原能力。

2.5 保濕能力測定結果

含有3個羥基結構的甘油是非常優秀的保濕劑，以10%的甘油作為參照評價CME的保濕效果。由圖6可知，0～24 h，相對濕度為85%條件下，10%CME保濕效果始終優于去離子水但低于10%甘油溶液；在相對濕度為43%條件下，0～9 h，10%CME保濕效果優于去離子水且優于10%甘油溶液，9～24 h時，10%CME保濕效果優于去離子水但略低于10%甘油溶液。當時間為24 h，相對濕度為85%條件下，10%甘油保濕率為97.60%，10%CME保濕率為95.83%；當時間為24 h，相對濕度為43%條件下，10%甘油保濕率為90.60%，10%CME保濕率為87.74%。CME的保濕效果僅略低于甘油，說明CME表現出良好的保濕能力，可以作為良好的保濕劑。

圖6 CME保濕能力測定結果

3 小結

采用超聲輔助提取珍稀大型食藥用真菌蛹蟲草有效成分并優化提取條件，確定CME提取率最高達7.51%。影響CME提取率的最主要因素為提取溫度。測定CME中的活性成分表明，糖含量可達67.29%，總黃酮含量達1.93%，說明CME大部分組成成分為多糖，可預估CME有良好的保濕及抗氧化功效；CME對羥自由基、ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力及鐵離子還原能力測定結果表明，在質量濃度為0.06～1.92 g/L時，其清除自由基及還原能力均隨質量濃度增加呈上升趨勢。當質量濃度為1.92 g/L時，其羥自由基的清除率為65.04%，DPPH自由基的清除率為53.30%，ABTS自由基的清除率為19.98%，鐵離子還原能力達到2 575.75 μmol/L，CME表現出良好的抗氧化性。CME保濕效果始終略低于甘油，但在24 h、相對濕度85%條件下，CME保濕率也達到95.83%。說明CME的保濕效果良好。

研究獲取抗氧化、保濕效果良好的珍稀大型食藥用真菌提取物CME，為中草藥抗氧化及保濕能力的研究提供數據支撐，為中草藥在化妝品、保健品等領域的開發應用提供參考和借鑒。