洛索洛芬鈉含量測定方法學研究

蔣曉勤 陳雨蕉 付金鳳

洛索洛芬鈉化學名為2-[4-（2-氧代環戊基甲基）苯基]丙酸鈉二水合物，為苯丙酸類非甾體消炎藥，于1986 年在日本上市。洛索洛芬鈉具有較好的鎮痛消炎解熱作用，鎮痛作用較強，應用范圍較廣，目前已廣泛應用于骨性關節炎[1-3]、強直性脊柱炎[4]、肩周炎[5]、拔牙后的疼痛[6]等。

洛索洛芬鈉目前的主要劑型有片劑、膠囊、分散片、顆粒劑和貼劑，溶出度、含量均勻度及含量測定檢測方法主要有紫外分光光度法[7]和高效液相色譜法[8]。筆者對市售的11 個廠家的多個批次的片劑和膠囊劑進行檢測，經過比較發現，不同廠家的溶出度、含量均勻度和含量測定方法均不相同，流動相比例、稀釋溶劑等不同。因此筆者開發了一種合適的檢測方法，可用于洛索洛芬鈉原料藥含量測定，片劑及膠囊溶出度、含量均勻度及含量測定等項目分析，并對其進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑與對照品 洛索洛芬鈉：中國食品藥品檢定研究院，批號：100638-202104，含量：87.5%；甲醇：色譜純，Fisher Chemical，批號：218273；冰醋酸，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20230509；三乙胺，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190909；色譜柱：Shim-Nex CS C18（4.6×150 mm，5 μm）（色譜柱1）；Xbridge?Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm）（色譜柱2）；Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm）（色譜柱3）。

1.1.2 儀器 電子天平：METTLER TOLEDO XP205、METTLER TOLEDO XPE205；高效液相色譜儀：島津LC-20AD，賽默飛UltiMate 3000，Waters e2695。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（如Shim-Nex CS C18（4.6×150 mm，5 μm））；流動相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（600∶400∶1∶1）；檢測波長：222 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；稀釋溶劑：水。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 標準曲線溶液的配制 對照品儲備溶液的制備：取洛索洛芬鈉對照品約69 mg，置100 ml 量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻（600 μg/ml）。

標準曲線溶液1～6 的制備：精密量取對照品儲備溶液5 ml、3.5 ml、4 ml、5 ml、6 ml、6.5 ml，分別置100 ml、50 ml、50 ml、50 ml、50 ml、50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。標曲1：30 μg/ml，50%含量測定濃度；標曲2：42 μg/ml，70%含量測定濃度；標曲3：48 μg/ml，80%含量測定濃度；標曲4：60 μg/ml，100%含量測定濃度；標曲5：72 μg/ml，120%含量測定濃度；標曲6：78 μg/ml，130%含量測定濃度。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 取洛索洛芬鈉對照品約14 mg，精密稱定，置200 ml 量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 取本品20 片，精密稱定，研細，精密稱取約1 片量（約相當于洛索洛芬鈉60 mg），置100 ml 量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，平行制備6 份。

1.2.2.4 系統適用性溶液的制備 取洛索洛芬鈉約12.5 mg，精密稱定，置50 ml 量瓶中，加4 mol/L 鹽酸溶液5 ml，98 ℃水浴加熱0.5 h，加4 mol/L 氫氧化鈉溶液中和，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2.5 加標回收率溶液的制備 低、中、高濃度加標回收率溶液的制備（80%含量測定濃度）：取生產企業A 提供的空白輔料約0.25 g，置100 ml 量瓶中，分別取洛索洛芬鈉對照品約55 mg、69 mg、82 mg置上述容量瓶中，混勻，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，過濾。精密量取續濾液 5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，每個濃度平行制備3 份。

1.2.2.6 專屬性溶液的制備 空白輔料溶液的制備（生產企業A）：取生產企業A 提供的空白輔料約0.25 g，置100 ml 量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

空白輔料溶液的制備（生產企業B）：取生產企業B 提供的空白輔料約0.25 g，置100 ml 量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

空白膠囊殼溶液的制備（生產企業C）：取生產企業C 的洛索洛芬鈉膠囊空白膠囊殼1 粒，置100 ml量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

空白膠囊殼溶液的制備（生產企業D）：取生產企業D 的洛索洛芬鈉膠囊空白膠囊殼1 粒，置100 ml量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

空白膠囊殼溶液的制備（生產企業E）：取生產企業E 的洛索洛芬鈉膠囊空白膠囊殼1 粒，置100 ml量瓶中，加水適量，超聲使洛索洛芬鈉溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2 結果

2.1 專屬性

取稀釋溶劑、空白輔料溶液（生產企業A）、空白輔料溶液（生產企業B）、空白膠囊殼溶液（生產企業C）、空白膠囊殼溶液（生產企業D）、空白膠囊殼溶液（生產企業E）、對照品溶液、系統適用性溶液分別按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖。

稀釋溶劑、空白輔料溶液（生產企業A）、空白輔料溶液（生產企業B）、空白膠囊殼溶液（生產企業C）、空白膠囊殼溶液（生產企業D）、空白膠囊殼溶液（生產企業E）在洛索洛芬鈉出峰處均無干擾峰；洛索洛芬鈉對照品溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，理論塔板數按洛索洛芬鈉峰計為7 840（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為6.1、14.1，完全分離，符合規定。見圖1～8。

圖1 稀釋溶劑色譜

圖2 空白輔料溶液（生產企業A）色譜

圖3 空白輔料溶液（生產企業B）色譜

圖4 空白膠囊殼溶液（生產企業C）色譜

圖5 空白膠囊殼溶液（生產企業D）色譜

圖6 空白膠囊殼溶液（生產企業E）色譜

圖7 洛索洛芬鈉對照品溶液色譜

圖8 系統適用性溶液色譜

2.2 精密度

2.2.1 重復性 取對照品溶液、供試品溶液分別按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。6 份供試品溶液含量的相對標準偏差（RSD）為0.4%，小于1.0%（《中華人民共和國藥典》2020 年版四部9101 分析方法驗證指導原則），符合規定。

2.2.2 中間精密度 由實驗人員1、實驗人員2 和實驗人員3 分別于2 d 按“對照品溶液的制備”及“供試品溶液的制備”方法制備溶液，并按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。18 份供試品溶液平均含量為98.53%，RSD 為0.5%，小于2.0%（《中華人民共和國藥典》2020 年版四部9101 分析方法驗證指導原則），符合規定。

2.3 范圍及線性

取標準曲線溶液1～6 分別按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，以對照品峰面積A作為Y軸，以濃度C作為X軸建立線性回歸方程，結果如下。A=2.554 13e-5C+0.0161 819，r=0.999 99。結果表明：洛索洛芬鈉在30～78 μg/ml 的范圍內線性關系良好，均符合要求。

2.4 檢測限及定量限

檢測限溶液的制備：精密量取標準曲線溶液4溶液4 ml，置 50 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 ml，置20 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.012 μg/ml 的溶液。

定量限溶液的制備：精密量取標準曲線溶液4溶液4 ml，置50 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.048 μg/ml 的溶液。

取檢測限溶液與定量限溶液，分別按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，計算信噪比。

結果表明定量限為0.048 μg/ml，洛索洛芬鈉的信噪比為10.27；檢測限為0.012 μg/ml，洛索洛芬鈉的信噪比為5.51，滿足檢測要求。

2.5 準確度（加標回收率）

取低濃度加標回收率溶液、中濃度加標回收率溶液、高濃度加標回收率溶液分別按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。低、中、高濃度加標回收率溶液的加標回收率依次為100.73%、100.49%、100.50%、100.29%、100.81%、100.33%、100.25%、100.58%、100.31%，均在98%～101%范圍內（《中華人民共和國藥典》2020 年版四部 9101 分析方法驗證指導原則），符合規定。

2.6 耐用性

2.6.1 柱溫耐用性

2.6.1.1 柱溫為30 ℃ 將柱溫改為30 ℃，其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

課題組歸納出一些具體的學生創新學習方法，如自主學習、問題學習、開放學習、案例學習、課題學習和網絡學習等方法[3]，增強學生探究和體驗的機會。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為7 531（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為6.3、14.5，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.03%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.4%，符合規定。

2.6.1.2 柱溫為40 ℃ 將柱溫改為40 ℃，其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為7 809（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為5.7、14.0，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.02%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.4%，符合規定。

2.6.2 流動相耐用性

2.6.2.1 流動相為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（55∶45∶1∶1） 將流動相改為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（55∶45∶1∶1），其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為8 610（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為7.9、22.7，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.05%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.4%，符合規定。

2.6.2.2 流動相為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（65∶35∶1∶1） 將流動相改為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（65∶35∶1∶1），其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為7 004（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為3.9、6.2，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.06%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.5%，符合規定。

2.6.3 色譜柱耐用性

2.6.3.1 Xbridge?Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm） 將色譜柱改為Xbridge?Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm），其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為10 845（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為2.2、12.5，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.10%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD為0.4%，符合規定。

2.6.3.2 Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm） 將色譜柱改為Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm），其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為11 173（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度依次為7.1、20.6，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.04%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.4%，符合規定。

2.6.4 儀器耐用性2.6.4.1 賽默飛UltiMate 3000 將高效液相色譜儀改為賽默飛UltiMate 3000，其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為9 795（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度為7.3，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.07%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.5%，符合規定。

2.6.4.2 Waters e2695 將高效液相色譜儀改為Waters e2695，其他色譜條件不變，依次取系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，按外標法計算含量。

對照品溶液中洛索洛芬鈉峰理論塔板數為7 418（應不低于5 000）；系統適用性溶液色譜圖中洛索洛芬鈉峰形良好，與相鄰雜質峰分離度為5.3，完全分離；對照品溶液連續進樣5 針，RSD 為0.5%，符合規定。6 份供試品溶液含量RSD 為0.4%，符合規定。

2.7 對照品溶液穩定性

依次于0、24、48、96、120、144 h 取對照品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，計算f值。對照品溶液24、48、96、120、144 h 的f值與0 h 的f值比值均在0.98～1.02 范圍內，表明對照品溶液在144 h 內穩定。見表1。

表1 溶液穩定性實驗結果

2.8 膜過濾實驗

取供試品溶液10 ml，過濾，依次取初濾液、棄去2 ml 濾液、棄去4 ml 濾液、棄去6 ml 濾液、棄去8 ml 濾液按“1.2.1”項下色譜條件進樣，采集色譜圖，比較峰面積變化。

較初濾液中洛索洛芬鈉峰面積，棄去2 ml 濾液、棄去4 ml 濾液、棄去6 ml 濾液、棄去8 ml 濾液中洛索洛芬鈉峰面積均未明顯降低，表明洛索洛芬鈉無明顯膜吸附作用。

3 討論

3.1 關于溶劑的選擇

綜合查閱文獻資料及洛索洛芬鈉自身的性質，可以考慮水和流動相作為溶解溶劑，筆者比較了市售多個廠家洛索洛芬鈉片、洛索洛芬鈉膠囊分別采用水及流動相溶解制樣后的含量（雙樣本雙平行，對照品溶解同供試品），結果表明采用水及流動相溶解的對照品f值無明顯差異，采用水及流動相溶解的供試品含量無明顯差異?；谏鲜鰞牲c原因，筆者選擇更環保且易得的水作為溶解溶劑。

3.2 關于系統適用性

筆者在“1.2.1”項色譜條件下測試了多個洛索洛芬鈉中的已知雜質，上述雜質在此條件下均可以與洛索洛芬鈉完全分離（雜質之間無法完全分離）。同時，筆者也分析了多個廠家洛索洛芬鈉原料藥，其雜質含量均較低。因此，筆者未設置分離度系統適用性條件。

該方法范圍及線性，精密度，準確度，耐用性等均良好，適用于洛索洛芬鈉原料藥含量測定，洛索洛芬鈉片及膠囊溶出度、含量均勻度及含量測定等項目分析。