基于IL-25/NF-κB 信號通路探討益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥的改善作用

夏阿信，向雙娣，蘇小璞，黃帥亮，余建瑋

（1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004； 2.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006）

支氣管哮喘是一種常見慢性氣道炎癥疾病，全球哮喘患者超過3 億人，我國成年哮喘患者約4 000萬人，其發病率逐年升高［1］。支氣管哮喘不能根治，但可通過規范化治療有效控制癥狀。支氣管哮喘的本質是由多種炎癥細胞、炎癥介質、細胞因子等相互作用產生的慢性氣道炎癥［2］，因此控制氣道炎癥是治療支氣管哮喘的關鍵。IL-25 是Th2 免疫應答的放大器，可以誘導Th2 細胞釋放細胞因子如IL-4、IL-5 和IL-13 來增強2 型免疫應答，誘導IgE 產生和嗜酸性粒細胞增多，在策劃和放大哮喘的過敏性炎癥中起著關鍵作用［3］。NF-κB 是IL-25 的下游信號通路，可以調控多種炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-13 的表達來達到調節炎癥反應的作用［4］。益氣溫陽護衛湯是國醫大師洪廣祥根據哮喘發病內因“氣陽虛弱，衛氣不足” 理論創制的防治支氣管哮喘的臨床有效方。以往研究表明，益氣溫陽護衛湯可以降低炎癥因子水平，控制氣道炎癥達到防治哮喘的目的［5-6］，但其作用機制尚不明確。本研究旨在探究益氣溫陽護衛湯抑制哮喘大鼠氣道炎癥的作用機制是否與IL-25/NF-κB 信號通路相關。

1 材料

1.1 動物 6 周齡SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體質量180～200 g，購自斯貝福（北京） 生物技術有限公司 ［實驗動物生產許可證號SCXK （京）2019-0010］，于江西中醫藥大學標準動物房內飼養，溫度20～24 ℃，相對濕度40% ～60%，通風良好，自由飲食飲水。本研究經江西中醫藥大學倫理委員會批準（倫理號JZLLSC20220786）。

1.2 藥物 益氣溫陽護衛湯由黃芪200 g、白術150 g、防風150 g、白芍100 g、桂枝100 g、生姜100 g、大棗100 g、炙甘草50 g、仙茅100 g、仙靈脾150 g 組成，共取生藥1 200 g，藥材由江西中醫藥大學附屬醫院陳浩副主任鑒定為正品。白術、防風、桂枝、白芍、生姜提取揮發油，其余藥材先加8 倍量冷水浸泡30 min，沸后再煎煮1 h； 第2 次加6 倍量水，煎煮40 min，去渣后過濾，合并濾液，濃縮，與揮發油混合成合劑，調至生藥量2 g/mL，于4 ℃冰箱密封保存。醋酸地塞米松片（國藥準字H35020394，規格0.75 mg/片，批號LB2198） 購自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.3 試劑 卵清蛋白（OVA） （美國Sigma 公司，貨號A5503）； 氫氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司，批號20210528）； 蘇木素-伊紅（HE） 染色試劑盒 （南昌雨露實驗器材有限公司，批號220608）； IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號 MM-0191R1、MM-0094R1、MM-0085R1）； IL-25 抗體（美國SAB 公司，批號5312）； TRAF6 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號A16991）； DAB 顯色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號G1212-200T）； IκBα 抗體、p-IκBα 抗體、NF-κB p65 抗體、p-NF-κB p65 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號4812S、2859S、8242S、3033S）。

1.4 儀器 PARI Turbo BOY 型超聲霧化器（德國百瑞公司）； KD-TS3A 全自動脫水機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）； DM2500 生物顯微鏡［徠卡顯微系統（上海） 有限公司］； XT-2000i 全自動血液分析儀（日本希森美康公司）； CFX 熒光定量PCR 儀、Chemi Doc XRS 凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）； M200PRO-多功能酶標儀（江西華科精密儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將60 只SD 大鼠適應性喂養7 d 后，隨機分為對照組、模型組、地塞米松組和益氣溫陽護衛湯低、中、高劑量組，每組10只，參考文獻［7］ 報道建立哮喘模型。第1 天，對照組大鼠腹腔注射1 mL 生理鹽水注射液，其余各組大鼠分別腹腔注射新鮮配制的卵清蛋白氫氧化鋁混懸液1 mL （含卵清蛋白100 mg 及氫氧化鋁100 mg） 致敏，并于第8 天重復第1 天的操作注射1 次。第15 天開始予以2% OVA 霧化吸入激發哮喘，每天霧化1 次，每次30 min，持續2 周。每天霧化OVA 前1 h，根據人和大鼠體表面積換算給藥劑量，按照5 mL/kg 灌胃，對照組給予生理鹽水，益氣溫陽護衛湯低、中、高劑量組分別給予1、2、4 g/mL 藥液，地塞米松組給予0.2 mg/mL 藥液，持續2 周。最后1 次霧化吸入后24 h 內，用20%烏拉坦（6 mL/kg） 腹腔注射麻醉。

2.2 肺泡灌洗液收集及炎癥細胞分類計數 結扎左側支氣管，用1 mL 生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，重復3 次。將回收的支氣管肺泡灌洗液（BALF） 使用全自動血液分析儀進行炎癥細胞分類計數； 剩余BALF 于4 ℃、1 500 r/min 離心10 min，取上清液于－80 ℃保存，待進行ELISA 檢測。

2.3 HE 染色觀察肺組織病理變化 取大鼠右肺中葉置于4%多聚甲醛中浸泡固定。將固定好的肺組織流水沖洗過夜，全自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片機切4 μm 厚的石蠟切片，60 ℃烤片2 h，行HE 染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察肺組織病理狀態。

2.4 免疫組化法檢測肺組織IL-25 蛋白表達 石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸抗原修復緩沖液高溫修復，3%雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶，3%BSA 封閉，一抗4 ℃孵育過夜，孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，脫水封片，于顯微鏡下觀察，細胞核為藍色，陽性表達為棕黃色，用Image J 軟件分析陽性表達面積所占的比例。

2.5 ELISA 法檢測BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 水平 按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測。根據標準物的濃度繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度。

2.6 RT-qPCR 法檢測肺組織IL-25、TRAF6 mRNA表達 采用TRIzol 法提取肺組織總mRNA，根據逆轉錄試劑盒說明書，將提取的RNA 反轉錄成cDNA，再使用熒光定量PCR 儀進行擴增，以βactin為內參，采用2－ΔΔCT公式進行分析，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 Western blot 法檢測肺組織IL-25/NF-κB 信號通路相關蛋白表達 提取肺組織總蛋白，按照BCA 蛋白濃度測定法進行蛋白定量，95 ℃金屬浴進行蛋白變性，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，5%BSA 溶液封閉，加一抗于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜30 min，孵育二抗1 h，再次洗膜30 min，條帶滴加顯影液，放入化學凝膠成像儀顯影，用Image J 軟件分析和處理蛋白條帶的灰度值。

2.8 統計學分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD 檢驗，以α＝0.05 為檢驗水準。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀態及行為學觀察 除對照組外，模型組和給藥組大鼠在致敏第8 天后均出現輕微的咳嗽。第15 天霧化吸入OVA 后不久大鼠出現四肢撓鼻抓耳，咳嗽喘息，四處竄動，過一會就靜臥不動。大鼠霧化后，毛發逐漸粗糙，失去光澤，食欲不振，食量變小，喜臥，精神不佳等現象。對照組大鼠無異常表現。給藥組經地塞米松和益氣溫陽護衛湯干預后，大鼠一般狀態及行為改變較模型組均有不同程度的改善。

3.2 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠BALF 中炎癥細胞的影響 與對照組比較，模型組中的白細胞（WBC）、嗜酸性粒細胞（EOS）、嗜堿性粒細胞（BAS）、中性粒細胞 （NEU）、淋巴細胞（LYM） 及單核細胞 （MON） 數量升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和益氣溫陽護衛湯各劑量組上述炎癥細胞數量均減少（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠BALF 中炎癥細胞數量比較（×109/mL，±s，n＝9）Tab.2 Comparison of inflammatory cells in BALF of rats in each group （×109/mL，±s，n＝9）

表2 各組大鼠BALF 中炎癥細胞數量比較（×109/mL，±s，n＝9）Tab.2 Comparison of inflammatory cells in BALF of rats in each group （×109/mL，±s，n＝9）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別WBCEOSNEULYMMONBAS正常組0.65±0.210.21±0.120.10±0.030.26±0.110.08±0.040.00±0.00模型組5.93±0.22??1.27±0.27??0.79±0.19??2.45±0.44??1.35±0.34??0.07±0.02??地塞米松組1.53±0.08＃＃0.33±0.08＃＃0.21±0.06＃＃0.78±0.10＃＃0.20±0.08＃＃0.01±0.00＃＃益氣溫陽護衛湯低劑量組4.32±0.46＃＃0.81±0.11＃＃0.65±0.08＃1.91±0.62＃0.89±0.17＃＃0.05±0.02＃益氣溫陽護衛湯中劑量組2.91±0.42＃＃0.57±0.13＃＃0.35±0.10＃＃1.45±0.41＃＃0.52±0.12＃＃0.03±0.02＃＃益氣溫陽護衛湯高劑量組2.29±0.24＃＃0.45±0.14＃＃0.34±0.08＃＃1.05±0.25＃＃0.42±0.23＃＃0.03±0.01＃＃

3.3 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠肺組織病理形態學的影響 與對照組比較，模型組肺組織支氣管管壁增厚，管腔狹窄變形，平滑肌增生，杯狀細胞化生，黏性分泌物增多，大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，益氣溫陽護衛湯各劑量組及地塞米松組肺組織炎癥浸潤情況得到不同程度改善，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of rat lung tissue in each group （HE，×200）

3.4 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠肺組織IL-25 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織切片顯示棕色細胞增多，IL-25 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和益氣溫陽護衛湯各劑量組肺組織IL-25 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織IL-25 蛋白表達（IHC，±s，×200，n＝3）Fig.2 Expression of IL-25 protein in rat lung tissue of each group （IHC，±s，×200，n＝3）

3.5 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和益氣溫陽護衛湯各劑量組大鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13水平降低（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（ng/L，±s，n＝9）Tab.3 Comparison of IL-4，IL-5 and IL-13 levels in rat BALF of each group （ng/L，±s，n＝9）

表3 各組大鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（ng/L，±s，n＝9）Tab.3 Comparison of IL-4，IL-5 and IL-13 levels in rat BALF of each group （ng/L，±s，n＝9）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-4IL-5IL-13正常組116.70±7.1724.12±1.1626.55±1.65模型組199.10±9.70??45.40±1.32??61.10±1.50??地塞米松組129.90±6.40＃＃26.90±0.94＃＃33.63±1.88＃＃益氣溫陽護衛湯低劑量組173.50±6.75＃＃39.42±1.75＃＃53.28±3.38＃＃益氣溫陽護衛湯中劑量組165.60±6.57＃＃35.17±1.36＃＃45.13±3.59＃＃益氣溫陽護衛湯高劑量組146.00±7.94＃＃31.50±1.60＃＃38.63±2.37＃＃

3.6 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和益氣溫陽護衛湯各劑量組大鼠肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 表達降低（P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 表達比較（±s，n＝3）Tab.4 Comparison of IL-25 and TRAF6 mRNA expressions in rat lung tissue of each group （±s，n＝3）

表4 各組大鼠肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 表達比較（±s，n＝3）Tab.4 Comparison of IL-25 and TRAF6 mRNA expressions in rat lung tissue of each group （±s，n＝3）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-25TRAF6對照組1.01±0.011.00±0.01模型組5.67±2.09??2.06±0.34??地塞米松組1.28±0.02＃＃1.18±0.02＃＃益氣溫陽護衛湯低劑量組4.64±0.57＃＃1.48±0.03＃＃益氣溫陽護衛湯中劑量組3.31±0.33＃＃1.34±0.02＃＃益氣溫陽護衛湯高劑量組2.29±0.25＃＃1.28±0.03＃＃

3.7 益氣溫陽護衛湯對支氣管哮喘大鼠肺組織IL-25/NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織IL-25、TRAF6、p-IκBα/IκBα、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和益氣溫陽護衛湯各劑量組大鼠肺組織IL-25、TRAF6、p-IκBα/IκBα、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達均降低（P＜0.01），見圖3、表5。

圖3 各組大鼠肺組織IL-25/NF-κB 信號通路相關蛋白條帶圖Fig.3 Protein bands of IL-25/NF-κB signaling pathway in rat lung tissue of each group

表5 各組大鼠肺組織IL-25/NF-κB 信號通路相關蛋白表達比較（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of expressions of IL-25/NF-κB signaling pathway related proteins in rat lung tissue of each group （±s，n＝3）

表5 各組大鼠肺組織IL-25/NF-κB 信號通路相關蛋白表達比較（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of expressions of IL-25/NF-κB signaling pathway related proteins in rat lung tissue of each group （±s，n＝3）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-25TRAF6p-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65對照組0.36±0.050.52±0.010.32±0.030.36±0.01模型組0.78±0.03??0.82±0.02??0.82±0.82??0.72±0.09??益氣溫陽護衛湯低劑量組0.58±0.10＃＃0.73±0.01＃＃0.63±0.14＃＃0.56±0.03＃＃益氣溫陽護衛湯中劑量組0.48±0.05＃＃0.68±0.04＃＃0.46±0.02＃＃0.50±0.02＃＃益氣溫陽護衛湯高劑量組0.43±0.07＃＃0.67±0.01＃＃0.44±0.03＃＃0.47±0.01＃＃地塞米松組0.36±0.03＃＃0.62±0.02＃＃0.39±0.03＃＃0.43±0.02＃＃

4 討論

支氣管哮喘中醫學稱“哮病”，國醫大師洪廣祥指出“氣陽虛弱是哮喘發作的重要內因”。氣陽虛弱重在肺、脾、腎三臟，肺失宣降，脾失運化，腎失蒸化水液，形成痰瘀互結，內伏于肺，導致哮喘發病。洪廣祥根據眾多古代醫籍記載和長期臨床經驗提出“益氣溫陽護衛法” 防治哮喘的觀點，并擬定了益氣溫陽護衛湯，該方通過溫補肺脾腎三臟陽氣，使肺的宣發肅降功能、脾之運化水濕功能、腎之蒸化水液功能得以正常，使痰消瘀散，氣道炎癥減輕，氣道反應性降低，以減少或控制哮喘的反復發作，從而達到防治哮喘的目的［8］。

支氣管哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，可導致咳嗽、喘息、呼吸急促和胸悶等癥狀［9］。哮喘癥狀是主要由氣道炎癥引起的，炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜充血水腫，黏液分泌增多，導致氣道重塑和氣道高反應性［10］。大量研究表明，細胞因子在支氣管哮喘發病機制中產生重要的作用［11］。當受到過敏原刺激時，抗原被樹突狀細胞捕獲后，誘導Th0 細胞向Th2 細胞分化并激活產生炎癥因子，如IL-4、IL-5 和IL-13［12］。IL-4 和IL-13可以誘導B 細胞合成IgE，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞致敏，從而釋放促炎介質，刺激黏液高分泌和氣道高反應性，而IL-5 主要負責嗜酸性粒細胞的成熟和募集［13］。本研究發現，益氣溫陽護衛湯可以改善大鼠哮喘癥狀； 降低哮喘大鼠BALF 中炎癥細胞數量及IL-4、IL-5 和IL-13 水平； 改善肺組織支氣管結構及炎癥細胞浸潤情況，減少黏液分泌和上皮杯狀細胞化生，抑制氣道炎癥反應。

IL-25 也稱為IL-17E，是IL-17 細胞因子家族的獨特成員，可以局部或全身地促進和增強輔助性T 型2 （Th2） 反應［14］。研究表明，IL-25 及其同源受體IL-17RB/RA 的表達在哮喘病癥中顯著上調［15］。研究還發現IL-25 可以誘導典型的嗜酸性粒細胞炎癥、氣道高反應性和氣道重塑，表現為杯狀細胞增生，上皮下膠原沉積和血管生成［16］。IL-25在與IL-17RB/IL-17RA 復合物結合后，ACT1 被招募到IL-17RB 的SEFIR 結構域上，ACT1 再招募TRAF6 至受體IL-17RB 上激活下游NF-κB 信號通路［17］。NF-κB 通路是參與生理過程和疾病發生的重要細胞信號通路之一，它在控制免疫功能、炎癥、應激反應、分化、凋亡和細胞存活方面起重要作用［18］。在細胞未受到刺激時，NF-κB 與抑制性IκBα 蛋白結合，以非活性狀態存在于細胞質中［19］，當機體受到過敏原刺激時，IκBα 會迅速磷酸化并被降解，與NF-κB 解離，然后NF-κB 轉位進入核內并激活靶基因，誘導Th2 細胞應答分泌促炎細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13，從而參與調控炎癥反應［20］。本實驗結果顯示，益氣溫陽護衛湯能夠下調肺組織IL-25、TRAF6 mRNA 和蛋白表達，抑制IκBα、NF-κB p65 磷酸化，說明益氣溫陽護衛湯能夠有效抑制IL-25/NF-κB 信號通路活化，抑制炎癥反應。

綜上所述，益氣溫陽護衛湯可有效緩解哮喘大鼠的哮喘癥狀，抑制氣道炎癥，其作用與抑制IL-25/NF-κB 信號通路活化，減少炎癥因子表達有關。