益智對TREM2 調控小膠質細胞表型轉化的調節作用

彭 景，楊云方，張 悅，吳 博，賈 英，顏廷旭

（沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，遼寧 沈陽 110016）

小膠質細胞在神經系統性疾病的發生、發展和終止過程中起著重要調節作用，活化的小膠質細胞有M1 型（促炎性） 和M2 型（抗炎型） 2 種表型［1］。M1 型小膠質細胞會誘導腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（iNOS） 等促炎細胞因子及促炎蛋白釋放量的增加，它們均為M1 型小膠質細胞激活的標記物［2-3］?；罨腗2 型小膠質細胞會促進抗炎介質白細胞介素-10 （IL-10）、精氨酸酶-1 （Arg-1） 等以及神經營養因子的表達，從而促進神經系統的恢復和重塑進行神經保護，這些蛋白也均為M2 型小膠質細胞標記物［4-7］，且這些促炎和抗炎介質的水平反應了小膠質細胞的激活狀態。在正常生理條件下，小膠質細胞呈現一種相對靜止的監測表型，然而當免疫穩態受到干擾或神經炎癥發生時，小膠質細胞就會進行無數次涉及細胞表型的調節過程，并分泌多種細胞因子以反映腦內狀態［8-10］。研究表明，益智提取物可以通過抑制神經炎癥發揮神經保護作用［11-16］。但目前沒有關于益智是否可以抑制M1 型小膠質細胞活化并促進M2 型小膠質細胞激活的相關研究。故本實驗以益智為研究對象，探討其對小膠質細胞表型轉化的調節作用，以期為其深入研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物 益智購于北京同仁堂遼寧藥店有限責任公司，產地海南，生產廠家為亳州市京皖中藥飲片廠，經沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院賈英教授鑒定為Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實。

1.2 細胞 小鼠神經膠質細胞BV2 由沈陽藥科大學續繁星老師提供。

1.3 試劑 DMEM 高糖培養基、BCA 蛋白定量試劑盒、放射性免疫沉淀分析 （RIPA） 裂解液、苯甲基磺酰氯（PMSF） 蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑復合物（×100）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速配制試劑盒、超敏ECL 發光劑、BSA、脂多糖（LPS）購自大連美侖生物技術有限公司（批號MA0212、MA0082、MA0153、MA0001、MB12707-1、MA0159、MA0186、MB4219、MB5198）； 上樣緩沖液（5×） 購自上海碧云天生物技術有限公司（批號P0015L）； Arg-1 抗體、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K） 抗體、蛋白激酶（Akt） 抗體、磷酸化蛋白激酶 （p-Akt） 抗體購自美國ProteinTech 公司 （批號66129-1-Ig、67121-1-Ig、60203-2-Ig、66444-1-Ig）； 鈣離子結合受體分子-1 （Iba-1） 抗體、iNOS 抗體、β-actin 抗體、FITC 山羊抗兔、CY3 山羊抗兔、488 山羊抗兔購自英國Abcam 公司（批號ab178846、ab178945、ab8226、ab6717、ab6939、ab150077）； siRNA 轉染試劑購自長春金傳科技有限公司（批號R19425015）。

1.4 儀器 CO2恒溫培養箱、生物超凈工作臺、Spectra Max M2 型多功能酶標儀（美國Thermo 公司）； 冷凍離心機、高壓滅菌鍋（長沙市湘儀離心機儀器有限公司）； 轉膜裝置、電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 益智提取物制備 取益智粉碎，過4 號篩，95%乙醇回流提取3 次（液料比10 ∶1），每次2 h，用八層紗布過濾提取液，減壓旋蒸、干燥，得益智干燥浸膏，得率16.47%，于涼暗處保存。取適量浸膏溶于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS） 中，制成質量濃度為1 mg/mL （生藥量） 的溶液，分裝于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光儲存。取適量LPS 溶于DMSO 中，制成質量濃度為5 mg/mL 的溶液，分裝于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光保存。

2.2 細胞培養 將于－80 ℃或液氮中冷凍保存的BV2 小膠質細胞復蘇后，取細胞培養瓶于顯微鏡下觀察，當BV2 細胞貼壁生長至培養瓶底面積的90%時進行傳代，傳代后于細胞培養箱中培養。選擇生長狀態良好的細胞冷凍保存，條件為4 ℃30 min，－20 ℃1 h，－80 ℃冷凍。以復蘇后的細胞作為第一代細胞，選擇第3 ～15 代BV2 小膠質細胞進行實驗。

2.3 MTT 法檢測細胞活力 取BV2 細胞，以1×104/mL 密度接種于無菌96 孔板中，培養24 h。待細胞長至96 孔板底面積的70%時，設置對照組、模型組和給藥組，每組3個復孔，繼續培養4 h，除對照組外，每孔均加入5 mg/mL LPS，使其質量濃度為1 μg/mL，繼續培養24 h。收集細胞，給藥組加入 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 益智提取物溶液。作用24 h 后每孔均加入20 μL MTT （5 mg/mL） 培養4 h，加入100 μL 由SDS 10 g、異丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1 mL 配制的溶液，于細胞培養箱中培養過夜。次日，將96 孔板放在搖床上快速振蕩5 min，待紫色結晶充分溶解，于570 nm 波長處檢測吸光度，計算細胞存活率。

2.4 Griess 比色法檢測NO 水平 按“2.3” 項下方法處理并收集細胞。取每孔細胞上清液50 μL 轉移至另一無菌96孔板中。設置標準曲線組，將3×9 個孔分別加入50 μL 細胞完全培養液，每孔均加入不同體積的標準液，標準曲線組濃度梯度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。每孔按順序加入50 μL 2 種顯色液，于540 nm 波長處檢測吸光度。

2.5 Western blot 法檢測iNOS、Arg-1、Akt、p-Akt、PI3K蛋白表達 取BV2 細胞，以5×105/mL 密度接種于無菌6孔板中，培養24 h。按“2.3” 項下方法處理并收集細胞，加入RIPA 裂解液，每孔100 μL，收集蛋白上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒將各組蛋白濃度調整一致，加上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱3～5 min 使蛋白變性。將蛋白經SDS-PAGE 電泳后轉移至NC 膜或PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉2 h，加入iNOS （1 ∶1 000）、Arg-1 （1 ∶5 000）、Akt （1 ∶800）、p-Akt （1 ∶800）、PI3K （1 ∶1 000）、βactin （1 ∶2 500） 一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，加入相應二抗室溫孵育1.5 ～2 h，洗滌3 次。顯影、定影、沖洗、晾干，以β-actin 為內參，對各組條帶進行分析，計算蛋白相對表達量。

2.6 ELISA 法檢測IL-10、TNF-α 水平 按“2.3” 項下方法處理并收集細胞，使用BCA 蛋白定量試劑盒定量，按照相關試劑盒說明書檢測IL-10、TNF-α 水平。

2.7 細胞免疫熒光法檢測Iba-1、Arg-1 水平 取BV2 細胞，以1×105/mL 密度接種于無菌6 孔板中，待細胞長至96 孔板底面積的6%時，按“2.3” 項下方法處理并收集細胞，去除上清液后每孔加入1 mL PBS，清洗細胞2 次。4%多聚甲醛透化，PBS 清洗3 次。室溫下加入5%牛血清白蛋白（BSA） 封閉細胞1 h，每孔加入100 μL Iba-1 （1 ∶300）、Arg-1 （1 ∶400） 抗體，4 ℃孵育過夜，清洗3 次。每孔加入100 μL 二抗稀釋液（1 ∶300），室溫作用1 h。在暗室中，載玻片上滴加含DAPI 的抗熒光衰減劑2 滴，取出爬片，倒扣至抗熒光衰減劑上，避光條件下使用正置熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.8 髓樣細胞表達觸發受體-2 （TREM2） 轉染實驗 取BV2 細胞，以1×105/mL 密度接種于無菌6 孔板中，每孔加入完全培養基2 mL，培養24 h，待細胞密度為60%時，將完全培養液更換為基礎培養基，繼續培養4 h。設置對照組、LPS 組、益智組 （益智提取物＋LPS）、轉染對照組（NC＋益智提取物＋LPS）、轉染實驗組（5 μL TREM2-siRNA＋益智提取物＋LPS）。按照相關試劑盒說明書操作，培養4 h，加入LPS （5 mg/mL） 使每孔LPS 質量濃度為1 μg/mL，繼續培養24 h，去除細胞培養液，收集細胞用于實驗。

2.9 RT-qPCR 法檢測IL-10、Arg-1、TNF-α、Iba-1 mRNA 表達 按“2.3” 項下方法處理并收集細胞，益智給藥質量濃度為100 μg/mL，每個濃度設置3 個復孔。按照試劑盒說明書提取細胞總RNA 并合成cDNA，反應體系為95 ℃35 s，60 ℃30 s，共40 個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.10 統計學分析 通過GraphPad Prism 8 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 益智提取物對BV2 細胞活力的影響 如圖1 所示，在0～100 μg/mL 范圍內，益智提取物對BV2 細胞的存活率無影響。因此，選擇0～100 μg/mL 濃度范圍內的益智提取物進行實驗。

圖1 益智提取物對BV2 細胞活力的影響（±s，n＝3）

3.2 益智提取物對LPS 誘導的BV2 細胞NO 水平的影響 如圖2 所示，與對照組比較，1 μg/mL LPS 處理的BV2 細胞中NO 水平升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，3.125 ～25 μg/mL 益智提取物對LPS 誘導的BV2 細胞釋放的NO 無抑制作用，當質量濃度為50、100 μg/mL 時，可抑制NO 釋放（P＜0.01），并呈劑量依賴性。提示益智提取物可抑制LPS 誘導的BV2 細胞中NO 的釋放。因此，選擇50、100 μg/mL 益智提取物進行后續實驗。

3.3 TREM2-siRNA 序列篩選 本實驗設計了3 條TREM2-siRNA 序列，分別標為251、411、430。通過RT-qPCR 和Western blot 法檢測TREM2 mRNA 和蛋白表達，篩選抑制TREM2 表達效率最高的序列。如圖3 所示，與對照組比較，NC 組（一段不會對目的基因有影響的si-RNA 序列，是TREM2-siRNA 轉染組的對照組） 并沒有對TREM2 mRNA 的轉錄產生影響； 與NC 組比較，在TREM2-siRNA的3 個序列中，只有siT2-430 組TREM2 mRNA 的轉錄被抑制，抑制效率大概為50%； 與對照組比較，NC 組同樣沒有對TREM2 蛋白表達產生影響（P＞0.05）； 與NC 組比較，siT2-411 組和siT2-430 組TREM2 蛋白的表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中siT2-430 更加有效地抑制了TREM2蛋白表達。因此，將選擇siT2-430 的TREM2-siRNA 進行后續實驗。

圖3 轉染TREM2-siRNA BV2 細胞的TREM2 表達（±s，n＝3）

3.4 益智對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞M1 和M2型標記物mRNA 表達的影響 如圖4 所示，與對照組比較，LPS 組BV2 細胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達降低（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達升高（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表達降低（P＜0.01）； 與轉染對照組比較，轉染實驗組BV2 細胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-αmRNA 表達升高（P＜0.01）。

圖4 益智提取物對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞TNF-α、IL-10、Arg-1、Iba-1 mRNA 表達的影響（±s，n＝7）

3.5 益智對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞M1 和M2型標記蛋白表達的影響 如圖5 所示，與對照組比較，LPS組Iba-1 蛋白表達增加，Arg-1 蛋白的表達無影響； 與轉染對照組比較，轉染實驗組對Iba-1 蛋白表達的抑制作用和對Arg-1 蛋白表達的促進作用均被部分抑制。如圖6 所示，與對照組比較，LPS 組BV2 細胞IL-10、Arg-1 蛋白表達降低（P＜0.01），M1 型標記蛋白TNF-α、iNOS 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細胞IL-10、Arg-1蛋白表達升高（P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與轉染對照組比較，轉染實驗組BV2細胞IL-10、Arg-1 蛋白表達降低 （P＜0.05，P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 益智提取物對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞Arg-1、Iba-1 蛋白表達的影響

圖6 益智提取物對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞TNF-α、IL-10、iNOS、Arg-1 蛋白表達的影響（±s，n＝7）

3.6 益智對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞PI3K/Akt信號通路的影響 如圖7 所示，與對照組比較，LPS 組BV2細胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與轉染對照組比較，轉染實驗組BV2 細胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），表明益智可通過TREM2 膜蛋白，激活PI3K/Akt 信號通路以調節小膠質細胞表型轉化。

圖7 益智提取物對LPS 誘導的TREM2-siRNA BV2 細胞PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

小膠質細胞作為中樞神經系統內的巨噬細胞，對神經炎癥具有調節作用。本實驗發現，益智可以改變M1 和M2型小膠質細胞標記蛋白的表達以調節小膠質細胞表型。有研究表明，TREM2 是一種細胞跨膜蛋白，并且該蛋白高度表達于小膠質細胞中［17］。小膠質細胞的表型轉化在很大程度上依賴于TREM2 受體蛋白，該蛋白表達提高后的抗炎作用已經在幾種不同的細胞系和組織中得到證實。

通過TREM2-siRNA 轉染實驗，檢測益智對不同表型小膠質細胞標記物Arg-1、Iba-1、TNF-α、IL-10 mRNA 表達以及小膠質細胞標記物蛋白表達的影響。結果表明M1 向M2型小膠質細胞轉化是由TREM2 蛋白調控的。TREM2 可以激活PI3K/Akt 通路，促進抗炎細胞因子的表達，從而調節小膠質細胞的表型轉化［18-19］。進一步對PI3K/Akt 通路的蛋白表達進行檢測，發現益智可能介導TREM2 蛋白進而激活PI3K/Akt 信號通路發揮抗炎作用。

益智為四大南藥之一，主要分布于廣東和海南。益智含有多種化合物，包括萜類、庚烷類、甾醇類以及具有抗炎生物活性的黃酮類成分，如白楊素和楊芽黃素等［20］。有研究表明，白楊素通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路發揮抗炎作用［21-22］，由此猜測白楊素可能是益智中主要調節小膠質細胞的表型轉化的主要成分。但是白楊素是否具有這種作用還需進一步研究驗證。