沙眼衣原體外膜復合物蛋白B的研究進展

孫悠嫻, 齊蔓莉

1.天津醫科大學總醫院,天津 300052; 2.天津市人民醫院,天津 300000

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,CT)是性傳播感染的主要病原體之一。據世界衛生組織發布的報告[1],CT每年約有1.285億新增病例,男性約6 990萬,女性約5 860萬。CT感染目前已是最常見的性傳播疾病之一。在女性群體中約有70%～80%呈無癥狀感染,若不加以治療控制,會引起女性上生殖道的瘢痕,并最終導致盆腔炎、異位妊娠、不孕癥等嚴重的后遺癥[2-3]。此外,有研究表明CT與HPV感染相關的宮頸癌有所關聯[4];CT感染還會使人類免疫缺陷病毒感染和傳播的風險增加3～4倍[5]。因此,CT感染的防治需引起足夠重視。CT有嚴格胞內寄生的特性且擁有獨特的雙相發育周期[6-7],一種是形態較小的(直徑約200 nm)、具有感染性和非復制性的原體(elementary bodies, EBs),另一種是形態較大的(直徑約800 nm)、非感染性和具有繁殖復制能力的網狀體(reticulate bodies, RBs)。在CT的發育周期中,EBs通過內吞作用附著并進入宿主粘膜細胞后,被內化在細胞內包涵體中。內化后約2 h,EBs經二硫化物還原擴大,分化成RBs。RBs在感染后約6 h經過幾輪復制重新分化為EBs。在發育周期末,包涵體占據了宿主細胞大部分細胞質。感染48～72 h后,大量感染性EBs從宿主細胞中釋放出來,感染鄰近的上皮細胞并使得CT感染的過程持續存在。CT的感染依賴于其對宿主細胞的黏附和入侵機制,該機制與CT的免疫優勢蛋白息息相關[8],這些蛋白包括主要外膜蛋白(MOMP)、熱休克蛋白70(HSP70)、質粒蛋白pgp3以及外膜復合物蛋白B(OmcB)等。OmcB在衣原體中是含量第二豐富的外膜蛋白[9-10],在衣原體感染過程中表現出強大的免疫原性[11],在幫助CT感染的診斷以及疫苗研發方面具有很好的應用前景。因此,本文對OmcB的結構、定位及作用機理等相關研究進行綜述。

1 外膜復合物蛋白B的結構

外膜復合物蛋白B(outer membrane complex protein,OmcB),也被稱為CT443,其基因長度為1 659 bp,分子質量約為60 kD。OmcB是一類富含24個半胱氨酸殘基的外膜多肽,在衣原體中是第二豐富的外膜蛋白,含量僅次于MOMP[9-10]。OmcB可以被分為一個具有高度保守性的C端部分,以及一個具有物種特異性的N端部分[12]。衣原體的所有OmcB蛋白在其N端結構域中都至少有一個XBBXBX序列(圖1),該序列已被證實與介導衣原體黏附相關。OmcB C端CD8表位的鑒定表明C端可進入宿主細胞的細胞質[13]。OmcB蛋白在不同種衣原體之間具有高度保守性[14],Wang等[11]通過分析血清型D CT OmcB開放閱讀框序列,并與其他衣原體序列進行BLAST分析,發現血清型D與H、G和K之間同源性為100%,與血清型B和C有99%同源性,與L1-L3之間亦有98%的同源性,表明OmcB在衣原體感染過程中起重要作用。這意味著OmcB或許在衣原體疫苗的研究上具有一定潛力。

SS:信號序列;BD:OmcB結合結構域;N-terminus:OmcB N末端,為OmcB結合結構域,具有物種特異性;C-terminus:OmcB C末端,具有高度保守性;標紅區域為OmcB結合結構域(OmcB-BD),內含至少一個XBBXBX基本序列(B代表一種堿性氨基酸),可與肝素結合。

2 外膜復合物蛋白B的定位

關于OmcB的定位曾存在一定爭議。Everett等[15]認為OmcB完全位于周質而非暴露于表面或定位于外膜上。相較之下,Ting等[16]發現鸚鵡熱衣原體的 OmcB也對EBs的胰蛋白酶消化敏感,并提出OmcB可能是暴露在細胞表面的。Mygind等[17]試圖通過免疫電子顯微鏡觀察OmcB特異性抗體解決沙眼OmcB表面定位問題,發現OmcB位于外膜內表面,只有在用還原試劑和蛋白裂解酶處理后才能到達細胞表面。然而在此前的研究中,由于表面暴露的OmcB區域有限,或是由于針對整個OmcB蛋白產生的抗體無法識別OmcB的構象表位,導致這些抗體無法與完整的EBs結合。Fadel等[8]從血清型LGV1中將OmcB分離并測序,克隆表達于大腸桿菌,最終蛋白酶裂解的結果表明重組OmcB蛋白的部分位于大腸桿菌的外膜內表面上,其余部分位于周質中;體外感染抑制試驗表明使用抗OmcB有效抑制LGV1的感染,提示在沙眼衣原體表面確有OmcB蛋白暴露,并且在免疫功能方面可與抗體發生結合。

3 外膜復合物蛋白B的作用機理

得益于OmcB在CT感染中的豐富性和免疫原性,在診斷和疫苗研發方面,OmcB一直被視作一個重要研究靶點。鑒于CT感染癥狀的隱匿性及其并發癥的危害性,CT感染者的早期篩查和后續充分治療對CT感染的防控工作具有重要意義。然而目前國內各種檢測方法存在一定缺陷,如侵入性檢查在取材時給患者造成痛苦、耗時費力、檢測結果敏感性不高和特異性不高等問題[18]。血清學檢查中血清中pgp3、MOMP、HSP60抗體在臨床應用中同樣存在局限性[3,9,19]。已有研究驗證,在感染衣原體患者的血清中可檢測出高滴度的抗MOMP、衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF)、易位肌動蛋白募集磷酸化蛋白 (translocated actin recrui-ting phosphoprotein, Tarp)等特異性抗體,這些免疫優勢蛋白已被運用于疫苗的研發之中[20-22]。同樣提示OmcB作為一類免疫優勢蛋白,在衣原體感染的早期檢測、診斷和疫苗研發方面或許存在著可期的研究空間與前景。

3.1 OmcB是一種免疫優勢蛋白

在CT感染過程中,OmcB已被證實是一種免疫優勢抗原。不管是在動物還是在人類CT感染中都可介導產生強烈的免疫反應。

CD8+T細胞通過裂解受感染細胞以及分泌細胞因子的機制在解決多種胞內細菌感染方面發揮效應。有研究發現人類CD8+T細胞可以識別OmcB,第一次運用CT感染的樹突狀細胞獲得克隆的人類CD8+T細胞,驗證出OmcB為CT的一種抗原,通過MHC Ⅰ類加工途徑并以此刺激人類CD8+T細胞,這是人類對此病原體產生免疫反應的第一步,激活CD8+T細胞免疫反應也是抵抗CT感染所必需的步驟[13]。Telyatnikova等[23]通過從CT誘導的反應性關節炎患者的滑液淋巴細胞中克隆并表達了CT特異性CD4+T細胞,發現人類CD4+T細胞可以識別OmcB。這些結果說明OmcB在T細胞介導的CT感染的免疫過程中發揮了作用。

克隆表達OmcB全長基因存在一定困難。Wang等[11]以OmcB的C端為研究對象,采用PCR技術從基因組中擴增C端序列,構建OmcBc重組質粒,成功誘導表達重組OmcBc融合蛋白;同時該研究收集120例CT感染患者血清,并對家兔和小鼠進行免疫接種或感染,獲得7份兔免疫血清、9份腹腔免疫小鼠血清、5份滴鼻感染小鼠血清,對倍稀釋后用IFA檢測各份免疫血清效價,結果顯示,在1 ∶5 000稀釋下的人免疫血清中,CT的包涵體依然可以清晰著色,而兔和小鼠的血清效價均大于1 ∶10 000;ELISA檢測結果表明在120例患者免疫血清中,重組OmcBc融合蛋白反應陽性率為87.5%;家兔和小鼠免疫血清與重組OmcBc融合蛋白均可發生強烈的抗原抗體反應,反應頻率為100%。由此可見重組OmcBc蛋白具有很強的抗原性。此項研究證明無論CT的增殖過程是否發生在宿主細胞內,免疫細胞對OmcB的呈遞過程依然可以照常進行并進一步誘導機體產生特異性免疫應答。

OmcB屬于晚期基因[24]。Qi等[25]為監測全長OmcB蛋白的表達,用1%SDS透化CT感染的細胞,在感染后2 h可檢測到EBs中預先存在的OmcB,但在感染后12 h和18 h消失,在24 h可檢測出新合成的OmcB,感染后36 h檢測到OmcB與生物體廣泛重疊;用2%皂苷透化后可明顯觀察到在感染后24 h,有OmcBc分泌到宿主細胞胞質中,這表明分泌的OmcBc可能是由新合成的OmcB主動加工而成的。

Qi等[25]針對OmcB C端和N端片段分別構建抗OmcBc抗體和抗OmcBn抗體,在宿主細胞被CT感染后,在其細胞質中檢測到很強的抗OmcBc抗體信號,而抗OmcBn抗體只在衣原體包涵體內部檢測出信號;經各項試驗證明,OmcBc片段被釋放到宿主細胞胞質中,而OmcBn片段和剩余的全長OmcB被保留在衣原體包涵體中;同時該研究為驗證CT感染期間OmcBc具有高度免疫原性,使用了20例感染沙眼衣原體女性的抗血清,通過ELISA和免疫印跡法繪制OmcB的免疫顯性區域。在ELISA中,這20例中抗血清均陽性識別全長OmcB,匯集20種人抗血清時也得到相似的結果;使用蛋白質印跡分析也證實了人抗體對 OmcBc片段的顯性識別。實驗中,即使人抗血清的稀釋度很低,合并的陽性抗血清也能識別 OmcB 的所有C末端片段而非N末端片段,這證實了OmcBc的免疫優勢。OmcBc片段表現出與全長OmcB相似的抗原性,這表明OmcBc在OmcB的免疫原性表達方面占絕大部分作用。而OmcBc在CT感染期間被釋放到宿主細胞胞質中,同時分泌的OmcBc可以方便提取到溶液中以進行抗體的識別,也表明其可以用于研發一種基于免疫組化的OmcBc快速檢測方法。

Hou等[26]研究發現CPAF在處理OmcB使其裂解成OmcBc的過程中發揮重要作用。CPAF是一種絲氨酸蛋白酶,由包涵體內CT分泌后可通過Sec依賴性途徑[25]進入宿主細胞周質空間,這表明CPAF可能是切割 OmcB 的候選蛋白酶。OmcB在CT感染晚期的加工處理發生在CPAF合成并活化之后,監測CPAF的表達可發現在檢測到加工后的OmcBc之前檢測到了活性CPAF,表明CPAF處理OmcB的可能性。并且CPAF在經CPAF特異性抗體消耗之后以及被一種CPAF特異性抗體抑制肽處理之后,OmcB的處理也得到抑制。在該研究中Hou等還監測了宿主細胞的完整性以及感染時間過程,未發現明顯的細胞膜通透性變化,這表明OmcB加工確實發生在活細胞中,而非細胞死亡。Chen等[27]發現CPAF可能通過外膜囊泡(OMV)出芽機制分泌出CT并進入宿主細胞。而OmcBc也被證明可以釋放到宿主細胞的細胞質中。因此,OmcBc有可能通過與CPAF共同包裝到OMV中并進入宿主細胞的細胞質發揮作用。

3.2 OmcB介導CT對宿主細胞的黏附

OmcB可以作為CT侵入宿主細胞的黏附素。在OmcB蛋白的N-端結構域中至少存在著一個XBBXBX序列(B代表一種堿性氨基酸),此序列以及N-端碎片所對應的的合成肽,被證實可與肝素相結合來阻斷某些沙眼衣原體血清型的感染性[28-29]。在宿主細胞膜上存在著硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG),屬于粘多糖(glycosaminoglycan,GAG)家族中的一員,現已被證實可與CT細胞外基質蛋白結合介導細胞黏附和遷移,是衣原體感染的必要條件[30]。Fadel等[8]研究發現血清型LGV1的重組OmcB蛋白與GAGs缺陷型宿主細胞的結合大大減少,表明OmcB可以與宿主細胞膜上的GAGs受體特異性結合從而增強衣原體對宿主細胞的黏附。

Fadel等[31]進一步研究發現,不同于血清型LGV1,在血清型E中,OmcB蛋白雖然也存在黏附性,但其與宿主細胞的結合并不依賴于GAGs。感染性抑制實驗顯示在保持同樣存在肝素這一相同條件下,只有表達了血清型LGV1的OmcB的大腸桿菌的黏附性被顯著抑制(68%),血清型LGV1的重組OmcB與GAGs缺陷型細胞的結合顯著減少,而對于同一缺陷細胞,來自血清型E的重組OmcB的結合數量與野生型細胞相當。

衣原體OmcB與宿主細胞的黏附是否依賴于GAGs取決于OmcB C端的3個可變氨基酸(第66、68、71位氨基酸)到保守的XBBXBX肝素結合結構域[12],其中,第66位氨基酸是決定其依賴性的最主要因素,當血清型E的OmcB蛋白的第66位亮氨酸被血清型LGV的OmcB中相應位置的脯氨酸所取代后,由肝素非依賴轉變成了肝素依賴。相對應地,當血清型LGV的OmcB蛋白的第66位脯氨酸被亮氨酸取代后,其肝素依賴性也同樣發生了改變。

3.3 OmcB維持EBs細胞壁剛性和滲透穩定性

EBs的細胞壁成分又被稱為衣原體外膜復合物(Chlamydia outer membrane complex, COMC)[32],它不溶于肌氨酸,除了含有主要外膜蛋白(MOMP)、富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich proteins, Crp)、多形態膜蛋白(polymorphic membrane proteins, Pmps)外,還具有一種剛性外膜,這種膜結構由二硫化物交聯的富含半胱氨酸的蛋白質網構成,即OmcB,有助于提高EBs對于外界環境壓力的抵抗力。Newhall等[33]表明OmcB可能參與RBs到EBs的轉化過程并且在維持EBs的細胞壁剛性和滲透穩定性方面發揮作用,其研究數據表明,在衣原體感染Hela細胞30 h后,細胞內RBs轉化為EBs時,才檢測到了OmcB蛋白的合成,這表明衣原體外膜蛋白的合成時間和程度受到調控,且這種調控在時間上與RBs到EBs的分化過程相吻合。此外,該項研究還顯示在外膜蛋白的生長周期內,OmcB蛋白的二硫鍵在大部分時間中廣泛交聯。

4 結語與展望

OmcB蛋白是衣原體中含量僅次于MOMP的外膜蛋白,其獨特結構可以幫助維持衣原體EBs的細胞壁剛性及滲透穩定性。在介導CT對宿主細胞的黏附與入侵過程中,OmcB蛋白發揮了重要作用,其與宿主細胞膜上的GAGs受體特異性結合從而增強衣原體對宿主細胞的黏附。同時對OmcB的研究也幫助我們對于衣原體致病機制的理解方面有所加深。多項體內外實驗結果已證實OmcB是一種免疫優勢抗原,不管是在動物還是在人類CT感染中都可介導產生強烈的免疫反應。但OmcB作為一類免疫優勢蛋白,其與宿主細胞的相互作用機制尚未完全明了,其在衣原體感染的早期檢測以及有效疫苗研制方面存在著可期的研究空間與前景,值得進一步研究。