RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌組織中的表達及與其預后相關性

倪健彬 王 穎

隨著醫學進步及對乳腺癌的深入研究,目前已形成局部治療與全身治療并重治療模式[1]。多環節作用機制的分析靶向治療已成為近年最活躍研究領域之一,多項研究表明癌細胞內某些基因或的表達與疾病發生、發展及預后密切相關[2-3]。最新文獻認為RNA XIST、mir-130b-3p在多種惡性腫瘤細胞中均有表達,mir-130b-3p可抑制乳腺上皮細胞正常分化、增殖、細胞間信號轉導、及細胞間粘附等過程,RNA XIST可促進腫瘤生長、侵襲及轉移[4],提示RNA XIST、mir-130b-3p可能對乳腺癌患者疾病轉歸及短期生存率影響較大。本文將研究RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌細胞中的表達及相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

經醫院醫學倫理會討論通過,選取2014年1月至2016年1月于我院收治并確診的120例乳腺癌患者,收集患者癌組織和癌旁正常組織。入選標準:①符合中國抗癌協會提出乳腺癌診斷標準[5];②女性;③年齡18～90歲;④未接受過治療;⑤預計存活期超過1年。排除標準:①惡性腫瘤;②依從性差,不能定期隨訪;③乳腺癌既往史;④合并精神疾病。剔除標準:①中途自愿退出;②未完成或進行其他治療;③隨訪資料不完整。其中年齡35～80歲,<55歲78例,≥55歲42例;BMI<18.5 kg/m259例、≥18.5 kg/m261例;平均KPS評分(80.65±2.11)分、70～80分50例、>80分70例;腫瘤直徑≤5 cm 56例,>5 cm 64例;Ⅰ～Ⅱ期54例、Ⅲ～Ⅳ期66例;有淋巴結轉移68例,無淋巴結轉移52例;低分化44例,高中分化76例。

1.2 方法

10%甲醛溶液(北京諾博萊德)固定乳腺癌組織和癌旁正常組織,經梯度濃度酒精(蘇州吉瑪基因股份有限公司)脫水后包埋成塊(山東佰仟化工包埋機);將組織切成5 μm的連續切片(深圳市匯沃科技切片機),依次采用二甲苯(桂林漓峰醫藥用品)、檸檬酸鈉(北京維欣儀奧科技)及3%過氧化氫(山東佰仟化工)進行脫蠟、修復及阻斷;PBS緩沖液(上海恒遠生物科技)漂洗3次后加山羊血清(上海田源生物技術)封閉,滴加經稀釋的鼠抗人mir-130b-3p多克隆抗體、鼠抗人RNA XIST單克隆抗體(上海立瑤生物);PBS漂洗3次后加入羊抗鼠IgG(四川訊麥科技)25 ℃孵育30 min漂洗;使用DAB顯色試劑盒(Solarlaio)顯色,蘇木精(上海長哲生物科技)復染、梯度酒精脫水及中性樹脂(南京森貝伽生物科技)封片,顯微鏡下觀察RNA XIST、mir-130b-3p表達。

判定標準。染色強度:0分為不著色,1分為淡黃色,2分為深黃色,3分為棕黃色;陽性細胞百分率:0分為0～5%,1分為5%～25%,2分為26%～50%,3分為51%～75%,4分為>75%。兩項之和≤ 3分為陰性,>3分為陽性[3]。

1.3 隨訪方式

采用電話及復查方式進行隨訪,納入本研究后第1年,每3個月隨訪1次,第2年開始每6個月隨訪1次,隨訪至患者死亡或60個月止。隨訪期間無人失訪。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌組織和癌旁組織中表達水平比較

RNA XIST主要定位于細胞質中,呈黃色或棕黃色顆粒;RNA XIST在乳腺癌組織中表達量較高(P<0.05);mir-130b-3p主要定位于細胞核中,呈黃色或棕黃色顆粒;mir-130b-3p在乳腺癌組織中的表達量較低(P<0.05),見表1。

表1 mir-130b-3p、RNA XIST在乳腺癌和癌旁組織中表達量

2.2 RNA XIST、mir-130b-3p表達相關性

RNA XIST與mir-130b-3p表達呈顯著負相關關系(γ=-0.277,P=0.002,圖1)。

圖1 RNA XIST與mir-130b-3p表達相關性

2.3 RNA XIST、mir-130b-3p表達量與其臨床病理特征的關系

RNA XIST、mir-130b-3p表達量與患者年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結轉移、分化程度呈顯著相關關系(P<0.05),RNA XIST、mir-130b-3p表達量與BMI、KPS評分不相關(P>0.05)(表2)。

表2 RNA XIST、mir-130b-3p表達量與其臨床病理特征的關系

2.4 隨訪結果

所有患者均從治療起隨訪60個月,6例于治療后24～36個月復發,8例全身轉移,54例死亡(12～18個月死亡4例,18～24個月死亡3例,24～30個月死亡4例,30～36個月死亡7例,36～42個月死亡8例,42～48個月死亡9例,48～54個月死亡9例,54～60個月死亡10例)。結果存活患者RNA XIST表達量低于死亡患者(P<0.05)、mir-130b-3p表達量高于死亡患者(P<0.05),見表3和圖2。

圖2 總生存率圖

表3 RNA XIST、mir-130b-3p表達量比較

2.5 乳腺癌患者死亡危險因素Logistic回歸分析

應用獨立因子(年齡、BMI、KPS評分、腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結轉移、分化程度及RNA XIST、mir-130b-3p表達量)建立Logistic回歸模型,以>0.5時預報為惡性,≤0.5時預報為良性,結果顯示建立該模型準確率90.11%,提示預報準確性較高。此時,RNA XIST表達量最佳截斷值為7.23,>7.23 提示高表達,≤7.23 提示低表達;mir-130b-3p表達量最佳截斷值為6.15,>6.15 提示高表達,≤6.15 提示低表達。進一步將乳腺癌患者死亡作為因變量,有預測意義的因子作為自變量,分析發現,年齡≥55歲、腫瘤直徑>5 cm、腫瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、RNA XIST高表達、mir-130b-3p低表達為乳腺癌患者死亡危險因素(P<0.05),見表4,表5。

表4 賦值表

表5 危險因素Logistic回歸分析

3 討論

腫瘤轉移、復發是乳腺癌患者死亡主要原因[6]。參考國內外研究得出,癌細胞轉移是一個多因素、多步驟、多階段發展過程,涉及基因改變[7-8]。目前國際上指出乳腺癌致病相關基因較多,抑癌基因和促癌基因在不同組織中扮演著不同角色,其中較敏感的分子主要有微小RNA(MicroRNA, miRNAs)[9-10]。這一理論也提示基因的表達存在組織和個體特異性,可能對腫瘤最終發生、發展有著一定差異。

mir-130b-3p是miRNAs中一類調控基因表達的小RNA分子,在正常細胞中呈高表達水平[11-12]。相關研究證實,細胞一旦發生癌變或浸潤,mir-130b-3p表達量可異常下降,考慮其對乳腺癌病情發展和預后有較高價值[13]。目前已在動植物及病毒中發現大量RNA XIST,這些分子可促進癌細胞增殖、分化過程[14]。關于RNA XIST的較多報道是其可參與女性X染色體失活和男性X染色體調節,在基因突變型疾病中表現為異常上調[15]。且多項研究發現,RNA XIST在肺癌、結直腸癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中均有表達,考慮其異常上調對腫瘤繁殖與分化有促進作用[16-17]。本研究分析乳腺癌組織和癌旁正常組織中RNA XIST和mir-130b-3p的表達量發現,乳腺癌組織中RNA XIST呈高表達而mir-130b-3p呈低表達。已有研究報道,mir-130b-3p在乳腺癌中表達水平低于健康者,而相關性分析中發現其表達水平與病情進展呈顯著負相關[18],這與本研究結果一致。另外,有報道稱膀胱癌患者中檢測到大量RNA XIST,且晚期膀胱癌RNA XIST表達量顯著高于早期患者,提示其與癌細胞增殖呈顯著正相關關系[19]。相關性分析提示,RNA XIST與mir-130b-3p呈負相關,也說明兩者拮抗作用。

為進一步探討RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌細胞中的作用,本研究繼續分析了其與臨床病理特征及5年生存率的關系,發現RNA XIST、mir-130b-3p可影響乳腺癌疾病進展和總生存率。當RNA XIST呈高表達時,患者年齡、腫瘤直徑較小,而這與臨床一直以來認為年齡可影響化療效果契合,由于老年患者身體機能、免疫功能等各方面均處于低水平狀態,化療對自身影響較大而影響短期生存率[20-21]。本研究年齡≥55歲、腫瘤直徑>5 cm是影響乳腺癌患者預后高危因素,也進一步說明高水平的RNA XIST可降低生存率。另mir-130b-3p呈高表達時,腫瘤穩定性較好,主要表現為腫瘤分期早、無淋巴結轉移,而腫瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移為乳腺癌患者死亡危險因素,提示mir-130b-3p水平越高,疾病轉歸能力和預后越好。本研究生存率>5年患者RNA XIST表達量低于生存率<5年患者,mir-130b-3p表達量高于生存率<5年患者,說明RNA XIST可促進癌細胞增殖和分化、mir-130b-3p可促進癌細胞凋亡。

綜上,RNA XIST在乳腺癌細胞中呈高表達,mir-130b-3p在乳腺癌細胞中呈低表達,均與乳腺癌臨床病理特征和預后密切相關,提示應注意關注RNA XIST、mir-130b-3p表達量。但本研究研究時間較短、納入病例數較少,其具體機制尚不清楚,有待擴大樣本并針對其具體機制作進一步研究。