貯藏溫度對β-環糊精穩定南極磷蝦油Pickering 乳液的影響

蔣長兵，黃 程，董 燁，鄭振霄*，戴志遠

（1 浙江工商大學管理工程與電子商務學院 杭州310018 2 綠城農科檢測技術有限公司 杭州310052 3 浙江工商大學海洋食品研究院 浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心 杭州 310012）

南極磷蝦是活動在南極海域的一種重要的甲殼類浮游生物。南極磷蝦繁育能力強，資源儲備量巨大[1]。據報道，全球南極磷蝦的生物存儲量可達5～10 億t，為了保持南極磷蝦資源的可持續性，南極海洋生物資源養護委員會對其設置了每年62萬t 的捕撈限制量[2]。然而，實際上南極磷蝦資源的年捕撈量僅為25 萬t 左右，遠遠達不到其捕撈限值[3]。研發南極磷蝦資源系列產品，是促進南極磷蝦資源開發利用的重要途徑。近年來，隨著人們對南極磷蝦營養組分及功效認識的深入，南極磷蝦油越來越受到消費者的青睞，成為南極磷蝦產品中的重要組成[4]。南極磷蝦油中富含磷脂構型的n-3 系列的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA），與魚油中的甘油酯型n-3PUFA 相比，磷脂型的n-3 PUFA 更加容易被人體吸收[5]。因此，南極磷蝦油成為人類獲取n-3 PUFA 的重要途徑。

南極磷蝦油的腥味重、黏度大，制約了其在功能食品中的應用。將南極磷蝦油制備成乳液可以有效緩解上述難題。Pickering 乳液是一種由固體粒子代替傳統有機表面活性劑穩定的新型乳液體系，具有安全性高、穩定性強、環境友好等特點，成為近年來的研究熱點[6-7]。β-環糊精具有內部疏水和外部親水的特性，可以作為穩定劑制備Pickering 乳液。隨著人們對食品安全重視程度的提高，食品從原料到產品的全產業鏈綠色制造成為當下食品加工的重點，β-環糊精作為一種綠色、天然的生物分子，具有生物相容性高、可降解等特點，是傳統乳化劑的潛在代替物[8-9]。Liu 等[10]采用β-環糊精作為穩定劑，葵花籽油為內相，制備得到水包油型的Pickering 乳液，機制研究結果表明β-環糊精不僅在油-水界面發揮了乳化作用，還可以通過其在水相中的3D 空間網絡結構阻止油滴聚結。李學紅等[11]以β-環糊精為穩定劑，紫蘇油為內相，分別在不同油水比，β-環糊精添加量的條件下制備Pickering 乳液，并通過乳化系數、粒徑和電位等指標確定乳液制備的條件為油水比7∶3，β-環糊精的添加量為3%。關于β-環糊精穩定乳液的研究多數集中于制備工藝的優化，而關于不同貯藏溫度對β-環糊精穩定南極磷蝦油Pickering 乳液的影響還鮮見研究報道。此外，溫度為影響食品品質的重要因素，對食品加工及貯藏有著重要的影響。

本文以β-環糊精為穩定劑，制備南極磷蝦油Pickering 乳液，并對乳液的基本特性進行表征，然后通過乳液的外觀形貌、微觀、粒徑、ζ-電位、層析指數、離心穩定性、過氧化物值（Peroxide value，POV）和硫代巴比妥酸反應物（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）等指標研究乳液在4，25 ℃和37 ℃貯藏條件下的品質變化并確定其貨架期，以期推動南極磷蝦油乳液在功能食品中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油，遼漁集團有限公司；β-環糊精（98%），上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑購于國藥集團（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

T25 高速分散器，德國IKA 公司；Basic S025磁力攪拌器，德國IKA 公司；恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；MCR301 流變儀，奧地利anton paar 公司；倒置顯微鏡（AE2000），麥克奧迪實業集團中國有限公司；Zeta sizer Nano-ZS 電位儀，英國Malvern 公司；SYNC 激光粒度儀，美國麥奇克公司。

1.3 方法

1.3.1 乳液的制備 量取40 mL 的去離子水和60 mL 的南極磷蝦油放置于燒杯中，添加3% β-環糊精，然后采用高速剪切的方法對其進行乳化，高速剪切的轉速為15 000 r/min，每次剪切1 min，間歇30 s，循環3 次。

1.3.2 粒徑和ζ-電位 采用去離子水將乳液稀釋到合適的倍數，乳液的粒徑采用激光粒度儀進行測定，乳液的ζ-電位采用動態光散射儀進行測定，設定平行試驗的次數為3 次，乳液的粒徑和ζ-電位值取其平均值。

1.3.3 微觀形貌 采用去離子水將乳液稀釋至合適倍數，用移液器吸取10 μL 乳液放置在載玻片上，并用蓋玻片將樣品覆蓋完全，之后在光學顯微鏡下對乳液的微觀形態進行觀察。

1.3.4 流變特性 乳液的流變特性采用動態流變儀進行測定，分別對其進行應變掃描測試，頻率掃描測試和剪切掃描測試，其中應變掃描測試時，設置應變的范圍為0.01%～100%，頻率為1 Hz，頻率掃描測試時，設置頻率的范圍為0.1～100 Hz，應變值為0.5%，剪切掃描測試時，設置應變為0.5%，頻率為0.1 Hz，剪切速率的變化范圍為1～100 s-1。

1.3.5 離心穩定性 乳液的離心穩定性采用分光光度法來進行表征。取一定體積的乳液稀釋至合適的倍數，然后將乳液放置于比色皿中，在波長600 nm 處測定其光吸收值Aa，而后將乳液在3 000 r/min 條件下離心10 min，收集上清，在波長600 nm 處測其光吸收值Ab，根據公式（1）計算其離心穩定性。

1.3.6 層析指數（Creaming index，CI）乳液層析指數的測定參考Surh 等[12]的方法有所修改。采用乳清層高度與乳液總高度的比值來反映。

1.3.7 POV 和TBARS POV 值的測定參考GB/T 5538-2005《動植物油脂 過氧化物值的測定》中的方法；TBARS 值的測定參照Mcdonald 等[13]的方法，1.0 mL 的乳液和2.0 mL 的硫代巴比妥酸混合后，沸水浴15 min，然后，把樣品置于冰浴中快速冷卻，再在1 000 r/min 條件下離心10 min，在波長532 nm 處測定其吸光值，標準曲線采用1，1，3，3-四乙氧基硅烷進行校準，單位采用每kg 樣品中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的mg 數來反映。

1.4 數據統計分析

數據結果采用平均值±標準偏差的形式展現，顯著性分析采用SPSS 21.0 進行，圖片采用Origin 9.0 和Photoshop CC2015.5 進行繪制。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦油Pickering 乳液基本特性指標分析

粒徑是乳液的一個重要指標，它與乳液的穩定性和功能組分在乳液中的吸收率密切相關。通常情況下，乳液的粒徑越小，說明乳液的分散度越高，乳液越穩定，人體吸收率越高[14]。ζ-電位反映乳滴之間的斥力大小，乳液的ζ-電位越高，乳滴之間越不容易發生聚結，乳液越穩定[15]。本試驗制得乳液的粒徑為13.64 μm，ζ-電位為-38.14 mV，劉忠博等[16]采用β-CD 為穩定劑，中鏈脂肪酸甘油三酯為油相，制備得到了Pickering 乳液，該乳液的粒徑為5.50 μm，Xiao 等[17]以薰衣草油為內相，采用β-CD 為穩定劑，制得了納米級別的Pickering 乳液。相比之下，本試驗制得乳液的粒徑偏大，這可能和油相的選擇有關，南極磷蝦油中富含磷脂型n-3 PUFA，分子質量較大且空間結構復雜，導致南極磷蝦油在與β-CD 發生自組裝所需的客體的物質的量數增加，增大了乳液的平均粒徑。本試驗制得乳液的電位處在較高水平，說明β-CD制備的南極磷蝦油乳液的穩定性較好。乳液的POV 和TBARS 值分別為1.20 mmol/kg 和3.55 mg MDA/kg，根據SCT 3502-2000《魚油》中的規定，樣品的等級為一級，說明樣品的氧化水平低，品質好。

2.2 南極磷蝦油Pickering 乳液流變特性指標分析

乳液的流變行為可以反映乳液的黏彈特性，在本研究中，采用應變掃描試驗、頻率掃描試驗和剪切速率掃描試驗分析乳液的流變特性。乳液的應變掃描測試結果如圖1a 所示，當應變低于2.51%時，乳液的儲能模量（G′）隨著應變的增加而逐漸下降，當應變在2.51%～9.98%范圍內，G′隨著應變的增加出現快速下降的趨勢，當應變超過9.98%時，乳液的G′幾乎沒有變化。相對于G′，乳液的損耗模量（G″）受應變變化的影響較小。此外，當應變小于2.51%時，乳液的G′值大于G″，乳液以彈性為主，當應變超過2.51%后，乳液的G″大于G′，乳液以黏性為主。乳液的頻率掃描測試結果如圖1b 所示，當頻率低于2.24 Hz 時，乳液的G″大于對應的G′值，表明乳液表現為凝膠狀彈性特征，而當頻率高于2.24 Hz 后，乳液的G′值大于對應的G″值，表明乳液表現為凝膠狀黏性特征。乳液的剪切速率掃描試驗如圖1c 所示，乳液的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，表現為假塑性流體的流變行為。劉幻幻[18]以β-CD 為穩定劑，大豆油為油相，制備了Pickering 乳液，該乳液的表觀黏度也呈現出假塑性流體的特性，即黏度隨著剪切速率的增加而減少。具有假塑性流動性質的液體食品大多含有高分子的膠體粒子，這些粒子多由鏈狀高分子構成，在靜止或低流速時，相互鉤掛纏結，黏度較大，顯得黏稠。然而，當流速增大時，由于流層之間剪切應力的作用，使比較散亂的鏈狀粒子滾動旋轉收縮成團，減少了互相的鉤掛，這就出現了剪切稀化的現象[19]。

圖1 乳液的應變掃描測試（a）、頻率掃描測試（b）和剪切掃描測試圖（c）Fig. 1 The strain sweep test（a），frequency sweep test（b），and shear rate sweep test（c）of the emulison

2.3 乳液外觀形貌變化及微觀變化

不同貯藏溫度條件下，乳液的外觀變化及微觀結構變化如圖2～4 所示。圖2a～2f 為4 ℃條件下乳液的外觀變化，制得乳液的外觀呈乳液特有的乳白色，且乳液呈均一穩定的體系，在貯藏的前8 d 內，乳液的外觀沒有發生明顯變化，16 d 后，乳液逐漸出現了水乳分離和分層現象，且乳液分離的程度隨著時間的推移而加劇，貯藏32 d 后，乳液出現了嚴重的的分層現象，且成乳部分出現塌陷，不再為穩定的乳液體系。圖2g～2l 為4 ℃條件下乳液的微觀變化，貯藏開始時，乳液中乳滴呈球形均勻分布且粒徑較小，隨著貯藏時間的推移，乳滴的尺寸不斷增加，且出現了乳滴大小分布不均、互相聚結的現象，貯藏32 d 后，乳滴的尺寸大幅增加，多數乳滴不再為球形結構，說明乳滴出現了嚴重的相互聚結現象，穩定的乳液體系遭到了嚴重的破壞。圖3a～3d 為25 ℃貯藏條件下乳液的外觀變化，貯藏開始時，乳液為均一穩定的乳白色體系，貯藏8 d 后，乳液出現了水乳分離的現象，貯藏20 d 后，乳液發生了嚴重的分層，且乳相呈現出一種松散的狀態，說明穩定乳液力學體系已被嚴重破壞，乳液不再呈現為均一穩定的狀態。圖3e～3h 為25 ℃貯藏條件下乳液的微觀變化，貯藏前8 d，乳液的乳滴為大小均一的球狀，且尺寸較小，隨著貯藏時間的延長，乳滴之間開始相互聚結，乳滴的尺寸開始增大，貯藏20 d 后，乳滴之間出現了嚴重的聚結，乳滴變大，穩定乳滴的界面膜遭到了嚴重破壞，油相從界面膜溢出，乳滴已經不能保持原有的球狀結構。圖4a～4d 和圖4e～4h 為37 ℃貯藏條件下乳液的外觀變化和微觀變化，貯藏開始時，乳液為均一穩定的乳白色乳液體系，乳滴的尺寸較小呈球狀且大小均勻分布。隨著貯藏時間的延長，乳液逐漸發生水乳分離，乳滴之間出現了相互聚結，乳滴變大，貯藏10 d 后，乳液出現了嚴重的水乳分離，乳相出現了塌陷，乳滴之間相互聚結，乳滴不再呈現為均一的球狀。綜合乳液的外觀和微觀變化，初步判定本研究中4，25 ℃和37℃條件下乳液貨架期為28，16 d 和8 d。

圖2 4 ℃貯藏期間乳液的外觀和微觀變化Fig. 2 Morphology and microscopy changes of the emulsion during 4 ℃storage

圖3 25 ℃貯藏期間乳液的外觀和微觀變化Fig. 3 Morphology and microscopy changes of the emulsion during 25 ℃storage

圖4 37 ℃貯藏期間乳液的外觀和微觀變化Fig. 4 Morphology and microscopy changes of the emulsion during 37 ℃storage

2.4 乳液的粒徑變化和ζ-電位變化

不同貯藏溫度條件下，乳液的粒徑和ζ-電位變化如圖5a 和圖5b 所示。乳液粒徑隨著貯藏時間的延長逐漸增大，溫度越高，乳液粒徑的增加速度越快，4 ℃條件下，乳液的粒徑從13.64 μm 增加到183.64 μm 所需的時間為28 d，25 ℃條件下，乳液粒徑增加到186.36 μm 所需的時間縮短為16 d，37 ℃條件下，乳液粒徑增加到195.38 μm 所需的時間僅為8 d。乳液ζ-電位絕對值的變化則呈現了相反的趨勢，貯藏初期乳液ζ-電位絕對值為38.14 mV，隨著貯藏時間的延長，ζ-電位絕對值出現了不同程度的下降，且溫度越高，下降的趨勢越快。乳液粒徑是反映乳滴聚結程度的重要指標，乳液在貯藏過程中，乳滴由于布朗運動處于連續運動狀態，乳滴之間發生相互碰到后逐漸聚結在一起，導致乳液粒徑的增大，而溫度對布朗運動的影響較大，溫度越高，乳滴分子的無規則運動越激烈，相互發生碰撞的幾率越大，越容易發生凝結[20]。ζ-電位反映乳滴表面的電荷分布情況，與乳液的穩定性具有較強的關聯，通常來講，乳液的ζ-電位值越大，表明乳滴之間的排斥力越大，乳滴越不容易發生聚結，乳液體系越穩定[21]。乳液在貯藏過程中，由于奧氏熟化等因素，乳滴的數量減少而乳滴的粒徑增大，改變了乳滴表面電荷的分布，使得乳液ζ-電位絕對值減少，乳液的穩定性下降。

圖5 乳液貯藏期間的粒徑（a）和ζ-電位絕對值（b）變化Fig. 5 Particle size（a）and the absolute ζ-potential（b）changes of the emulsion during the storage

2.5 乳液的層析指數變化和離心穩定性變化

不同貯藏溫度條件下，乳液的層析指數和離心穩定性變化如圖6a 和圖6b 所示。4 ℃條件下，乳液貯藏12 d 內，未發現分層現象，貯藏16 d 后乳液在重力等因素的作用下，出現了分層現象，乳液的層析指數為8.17%，貯藏32 d 后，乳液出現了嚴重的分層現象，層析指數為35.16%。25 ℃條件下，乳液在貯藏的前4 d 內，未發現分層現象，貯藏8 d 后，乳液出現了水乳分離的現象，乳液的層析指數為7.28%，貯藏20 d 后，乳液層析指數達到38.42%。37 ℃條件下，乳液貯藏僅2 d 后，就出現了分層現象，層析指數為6.25%，貯藏10 d 后，層析指數達到32.15%。離心穩定性反映乳液中油相和水相之間的結合能力，是體現乳液穩定性的重要方面。貯藏初期乳液的離心穩定性為85.34%，隨著貯藏時間的延長，乳液的離心穩定性逐漸減小，且溫度越高，乳液離心穩定性下降的速度越快。4，25 ℃和37 ℃貯藏32，20 d 和10 d 后，乳液的離心穩定性分別下降到了53.68%，57.34%和55.17%。乳液貯藏期間，受布朗運動的影響，乳滴之間頻繁發生碰撞，小乳滴逐漸長大為大乳滴，奧氏熟化進一步加劇了這種現象，逐漸出現相分離，在重力的作用下，水相逐漸在底部積累而乳相則浮在上層，導致乳液出現分層，此外，布朗運動隨著溫度的升高而加劇，所以高溫加劇了乳液層析指數的升高和離心穩定性的下降。

圖6 乳液貯藏期間的層析指數（a）和離心穩定性（b）變化Fig. 6 Creaming index（a）and the centrifugal stability（b）changes of the emulsion during the storage

2.6 乳液POV 和TBARS 變化

不同貯藏溫度條件下，乳液的POV 和TBARS變化如圖7a 和圖7b 所示。貯藏初期乳液的POV值為1.20 mmol/kg，在貯藏期內，4 ℃和25 ℃條件下，乳液的POV 值隨著貯藏時間的延長呈現先逐漸增大后保持穩定的趨勢，而37 ℃條件下乳液的POV 值則隨貯藏時間快速增加。貯藏結束后，4，25 ℃和37 ℃條件下，乳液的POV 值分別達到了2.44，2.56 mmol/kg 和2.53 mmol/kg，根據SCT 3502-2000《魚油》中的規定，貯藏結束后乳液POV值還處于一級品的范圍內。TBARS 的變化和POV的變化趨勢相似，貯藏初期TBARS 的值為3.55 mg MDA/kg，4 ℃貯 藏32 d 后 增加到16.43 mg MDA/kg，25 ℃貯藏20 d 后增加到15.24 mg MDA/kg，37 ℃貯藏10 d 后增加到14.52 mg MDA/kg。本試驗中，乳液保存在離心管中且為密閉，含氧量有限，低溫條件下（4 ℃和25 ℃），離心管中氧氣與乳液發生氧化反應的速度較慢，POV 和TBARS 值的增加幅度較小，隨著反應的進行，當氧被耗盡后，由于反應物的缺失，乳液的氧化反應停止，POV 和TBARS 在后期保持相對恒定。高溫條件下（37℃），乳液與氧發生氧化反應的速度較快，因而乳液中POV 和TBARS 值的增加迅速，氧的耗盡時刻和貯藏末期的時刻相近，因此在整個貯藏過程中，乳液的POV 和TBARS 值都保持增加。

圖7 乳液貯藏期間POV（a）和TBARS（b）變化Fig. 7 POV（a）and the TBARS（b）changes of the emulsion during the storage

3 討論

本文以食品級別的多糖分子β-環糊精為穩定劑，以南極磷蝦油為油相，制備了Pickering 乳液，并通過乳液的流變特性分析、粒徑、ζ-電位、離心穩定性等指標表征了所得乳液的特性，結果表明所得乳液具備假塑性流體的特性，乳液的粒徑和電位分別為13.64 μm，-38.14 mV，離心穩定性為85.34%，表明乳液的穩定性較好，乳液的POV和TBARS 為1.20 mmol/kg 和3.55 mg MDA/kg，均處在較低水平，說明乳液的氧化水平低，品質較好。此外，由于溫度是影響乳液運輸和貯藏過程中的穩定性的重要因素，本文以乳液的外觀和微觀變化、粒徑、ζ-電位、離心穩定性、層析指數、POV和TBARS 為指標，研究了不同貯藏溫度（4，25 ℃和37 ℃）對乳液的影響，結果表明溫度越高，乳液粒徑、層析指數、POV 和TBARS 的增大速度以及ζ-電位、離心穩定性的下降速度越快，宏觀表現為乳液出現水乳分離和分層現象，綜合評價4，25 ℃和37 ℃條件下，乳液貯存的貨架期為28，16 d 和8 d。本文首次以β-環糊精這一綠色環保的生物分子制備得到了南極磷蝦油Pickering 乳液，并探究了不同貯藏溫度對乳液貯藏期間品質變化的影響，確定了乳液的貨架期，進一步拓展了南極磷蝦資源的利用形式，為南極磷蝦資源的開發和利用提供了借鑒。

乳液作為一種高度分散的體系，在制作過程中為使分散相均勻分布于連續相中，需要通過高速剪切、超聲、均質等方式對其進行做功，在分散相分散開來的同時，乳化劑在油水界面吸附形成界面膜，保護分散相液滴之間不相互碰撞而合并，以保持乳液的穩定性。由此可以看出，乳液的形成過程為熱力學不自發過程，需要外界對體系做功，乳液液滴在相互碰撞合并的過程是體系界面自由能下降過程，屬于熱力學自發過程，因此，乳液是熱力學不穩定體系，這樣就導致乳液在貯藏過程中會逐漸失去穩定性[22]。在乳液失穩的過程中，首先乳液中的分散相相互聚集成團，形成三維的液滴簇，此過程謂之絮凝；之后絮凝物的液滴發生凝并，小液滴的液膜破壞，形成較大的液珠，這一過程稱為聚結。聚結過程是不可逆過程，它會導致液滴數目的減少和相分離；由于分散相和連續相的密度不同，在重力作用下密度大的一相下沉而密度小的一相上浮，最終導致乳液的分層[23-24]。在本試驗中，溫度越高，乳液失穩的速度越快，這可能是由于溫度的升高會加劇乳液液滴分子的布朗運動，增加了分散相液滴之間相互碰撞的概率，使得小的分散相液滴相互靠近發生黏結并相互碰撞導致界面膜破裂，發生聚結，乳滴的粒徑增加，而較大顆粒的液滴的移動速度更快，更容易發生聚集，此外奧氏熟化作用也進一步加劇了這種現象，最終的結果是較高溫度貯藏的乳液發生分層失去穩定性的時間縮短。

4 結論與展望

本研究首次采用β-環糊精這一生物分子制備了南極磷蝦油Pickering 乳液，并通過乳液的外觀和微觀變化、粒徑、ζ-電位、離心穩定性、層析指數、POV 和TBARS 研究了不同貯藏溫度（4，25 ℃和37 ℃）對乳液的影響，確定了乳液的貨架期，結果表明溫度越高，乳液失穩所需的時間越短，4，25℃和37 ℃條件下，乳液貯存的貨架期分別為28，16 d 和8 d。本研究為南極磷蝦資源的開發和綠色利用提供了借鑒，后期的研究將會從溫度與乳液熱力學特性變化的角度出發探索乳液失穩的機制。