綠茶中21 種黃酮醇糖苷類化合物的鑒別及地理溯源

黃永橋，高 亮，吳新文，李占彬，楊昌彪，毛敏霞*

（1 貴州省檢測技術研究應用中心 貴陽550014 2 貴州省分析測試研究院 貴陽 550014）

茶在中國有著悠久的飲用歷史，茶的各種生物活性、健康益處及獨特的口感使其成為世界上廣泛消費的飲料[1]。茶葉中富含兒茶素、黃酮醇、茶黃素等酚類化合物，其中黃酮醇糖苷類化合物（Flavonol glycosides，FGs）主要以糖苷的形式存在，在黃酮醇母體苷元的C-3 位有糖分子部分，黃酮醇母體苷元主要有楊梅素苷、槲皮素苷和山奈素苷，糖分子分為單糖（葡萄糖、半乳糖、鼠李唐等）、二糖和三糖[2-3]。迄今為止，已報道的茶葉中黃酮醇苷類化合物有20 多種[4-6]。

黃酮醇糖苷類化合物在生理活性方面有一定的功效，如抗氧化、降血脂、清除自由基、抵御紫外線、抗菌、抗癌、體重調節、維持骨密度和神經保護活性等生理功能[7-9]。有研究發現黃酮醇糖苷類化合物味覺閾值極低，呈苦澀味，對茶湯的苦澀味貢獻較大，對茶湯中咖啡因的苦味具有正向增強作用；同時對茶湯的滋味和色澤等感官品質具有重要作用[10-12]。有學者提出黃酮醇糖苷類化合物與兒茶素相比，它們的穩定性相對較高，被認為是1 組有研究價值的生物標志物，用于區分茶葉的產地或品種[13-14]。

液相色譜-紫外檢測因成本低且易操作，被廣泛用于茶葉和飲料中酚類化合物的識別和定量分析[15-16]。然而，由于液相色譜法靈敏度較差且易受干擾，很難對茶葉中低含量的黃酮醇糖苷類化合物進行有效分離和準確定量。液相色譜-質譜聯用儀技術具有選擇性好、靈敏度高、分辨率好、重復性好等優點，是茶葉中黃酮醇糖苷類化合物分析常用的檢測方法[17-18]。三重四極桿質譜儀（Triple quadrupole mass spectrometry，QQQ-MS/MS）可以產生分子、離子的特征產物離子，有良好的靈敏度和選擇性，適用于目標物的定量分析[4，18-19]。四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（Quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry，Q -Orbitrap HRMS）是一種高分辨率、寬質量范圍和高靈敏度的方法，能對化合物進行精確質量數測定，適用于目標物與未知物的識別和篩查[20-21]。

本研究探討用黃酮醇苷類化合物含量來分析綠茶地理溯源的可行性，通過高分辨質譜儀結合三重四極桿質譜儀，建立UPLC-Q-Orbitrap HRMS 結合UPLC-QQQ-MS/MS 分析茶葉中21 種黃酮醇苷類化合物的鑒別和定量方法。對不同地區綠茶中黃酮醇苷類化合物含量進行測定和比較，分析綠茶中黃酮醇苷類化合物的差異性及相關性。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）、方向傳播算法-人工神經網絡（Back pagation-artificial neural network，BPANN）、偏最小二乘法判別（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、線性判別（Linear discriminant analysis，LSD）等化學計量學分析模型，探究黃酮醇苷類化合物的差異性及相關性對綠茶產地判別及溯源的可行性分析，篩選重要化學標記，以期為茶葉指紋圖譜和化學判別提供依據，為茶葉地理溯源研究和化學分類提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純級），德國默克公司；甲酸（色譜純級），上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗室用水為Milli-Q 純水機制備。

槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖糖苷（Q-glurha）標準品、槲皮素-3-O-半乳糖糖苷（Q-gal）標準品、槲皮素-3-O-葡萄糖糖苷（Q-glu）標準品、山奈素-3-O-葡萄糖-鼠李糖糖苷（K-glu-rha）標準品、山奈素-3-O-葡萄糖糖苷（K-glu）標準品，均≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

茶葉樣品分別購自貴州省6 個地州市茶葉生產企業生產的40 批次綠茶，均選取當地茶葉進行生產的綠茶，其中遵義地區13 批次；銅仁地區4批次；黔南地區6 批次；黔西南地區4 批次；貴陽地區5 批次；黔東南地區8 批次。

1.2 儀器與設備

6470A 三重四級桿質譜儀、1290 超高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；Q-Exactive HF-X 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統及Dionex UltiMate 3000 快速高效液相色譜系統，美國Thermo-Fisher 公司；GM200 刀式研磨粉碎儀，德國Retsch 公司；超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；UMV-2 多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q 純水機，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 準確稱取Q-glu-rha、Qgal、Q-glu、K-glu-rha 和K-glu 標準品，分別用甲醇配制成質量濃度為1.0 mg/mL 的儲備液；于-18℃保存。儲備液用70%甲醇溶液稀釋至質量濃度為0.02，0.05，0.2，0.5，1，2，5，10 μg/mL 制備標 準工作液，臨用現配。

1.3.2 UPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析條件

1.3.2.1 色譜 ZORBAX Eclipse Plus-C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%乙酸水溶液，B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5.0 μL；梯度洗脫：0.0～2.0 min，2% B；2.0～8.0 min，2%～20% B；8.0～28.0 min，20%～65% B；28.0～35.0 min，65%～98% B；35.0～37.0 min，98%B；37.0～37.1 min，98%～2% B；37.1～40.0 min，2%B。

1.3.2.2 質譜 加熱電噴霧離子源（HESI），負離子模式；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：325℃；噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：180 mL/min，輔助氣：45 mL/min；掃描模式：Full MS-ddMS2；采集范圍：m/z 100～900；一級掃描分辨率：70 000；二級子離子掃描分辨率：17 500；歸一化碰撞能量（NCEs）：40 eV，黃酮醇糖苷類化合物質譜信息見表1。

1.3.3 UPLC-QQQ-MS/MS 分析條件

1.3.3.1 色譜 ZORBAX Eclipse Plus-C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%乙酸水溶液，B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2.0 μL；梯度洗脫：0～0.5 min，5% B；0.5～2.0 min，5%～16% B；2.0～3.0 min，16% B；3.0～13.0 min，16%～18.5% B；13.0～13.5 min，18.5%～20.0%B；13.5～14.5 min，20%～60% B；14.5～15.0 min，60%～90% B；15.0～17.0 min，90% B；17.0～17.1 min，90%～5% B；17.1～20.0 min，5% B。

1.3.3.2 質譜 電噴霧離子源（ESI），負離子掃描模式；多反應監測（MRM）；毛細管電壓：-3.5 kV；霧化器壓力：68.95 kPa；干燥氣和鞘氣流速：10 L/min；干燥氣和鞘氣溫度：300 ℃；子離子均選取脫去糖苷后的骨架苷元離子。

1.3.4 樣品前處理 茶葉樣品經粉碎后過425 μm 孔徑的篩子，稱取試樣1.00 g 于50 mL 離心管中，準確加入30 mL 70%甲醇溶液，超聲15 min，渦旋振蕩10 min，5 000 r/min 離心10 min，取上清液過膜上機。

1.3.5 數據處理 試驗數據計算采用Excel 2016版；圖譜繪制和主成分分析采用Origin 2018 版；化學結構式繪制采用ChemDraw 7.0 版；差異顯著性分析、方向傳播算法-人工神經網絡分析和線性判別采用SPSS 22.0 版；偏最小二乘判別分析使用SIMCA 14.1 版。

2 結果與討論

2.1 黃酮醇糖苷類化合物的色譜分離

茶葉中富含較多氨基酸、有機酸、茶多酚（如兒茶素、茶黃素類、黃酮類及黃酮醇類）等成分。為了有效地對茶葉中的黃酮醇糖苷類化合物進行分離，試驗選用150 mm×1.8 μm 的色譜柱，并對流動相組成進及其洗脫梯度行了對比優化，當使用乙腈-0.1%乙酸水做為流動相，采用梯度洗脫21 種化合物全部洗脫出來，且有較好的分離度，圖1 為綠茶樣品色譜圖。

圖1 綠茶中21 種黃酮醇糖苷類化合物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 21 flavonol glycosides in green tea

2.2 黃酮醇糖苷類化合物的識別

根據化合物的結構規律及裂解規律，結構式中減少不同的取代基，其質量數會相應減少。如羥基減少16 u、葡萄糖及半乳糖減少162 u、鼠李糖減少146 u、阿拉伯糖減少132 u 等[5，22-24]。研究表明[2-3，18，25]，半乳糖和葡 萄糖為同分異構體，在 液相色譜有效的分離條件下，半乳糖的糖苷色譜峰時間會早于葡萄糖的糖苷，說明在極性上半乳糖＞葡萄糖。

研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 對黃酮醇糖苷類化合物進行分析，根據其結構規律及裂解規律、與有標準物質的化合物進行比較（色譜圖上的保留時間、母離子及其特征碎片離子）分析，并與相關文獻進行比對，最終對21 種黃酮醇糖苷類化合物進行識別確認。圖2 為Q-glu-rha-glu 二級質譜圖。

圖2 Q-glu-rha-glu 二級質譜圖Fig. 2 MS2 spectra of Q-glu-rha-glu

2.3 UHPLC-QQQ-MS/MS 方法學驗證

使用購買的5 種標準物質建立的定量方法進行方法學驗證，選取同一茶樣，按建立的分析方法分別進行標準曲線、重復性和加標回收試驗。結果表明，在質量濃度0.02～10.00 μg/mL 的范圍內，相關系數均大于0.99；加入相同加標量的標準品進行6 次平行試驗，加標回收率在79.3%～106.5%之間，相對標準偏差在3.6%～7.9%之間，說明建立的定量分析方法有較好的回收率和重復性。

2.4 黃酮醇糖苷類化合物的定量方法

現階段商品化的黃酮醇糖苷類化合物的標準品較少，文獻報道[17-18，24，26-28]多采用相對定量的方法對其進行定量，即用已有標準品的黃酮醇糖苷類化合物對其它黃酮醇糖苷類化合物進行相對定量。本研究以Q-glu-rha 為標準品對其它沒有標準品黃酮醇糖苷類化合物進行相對定量。配置有標準物質的5 種黃酮醇糖苷類化合物系列標準工作溶液，對其在茶葉中的含量進行準確定量分析。

2.5 茶葉中黃酮醇糖苷類化合物的含量

表2 顯示不同地區綠茶中21 種黃酮醇糖苷類化合物的組成及含量，根據單因素ANOVA 檢驗分析結果，每批次樣品均測定2 次。由表2 可知，不同地區的綠茶中總黃酮醇糖苷類化合物的含量存在差異，黔西南地區綠茶中總黃酮醇糖苷含量最高，黔南地區綠茶總黃酮醇糖苷含量最低。在21 種糖苷中K-glu-rha-glu 含量最高，占總含量的33.1%～57.8%；Q-gal-rha-rha 平均含量最低；3 種糖苷中以山奈素糖苷含量最高，其次為槲皮素糖苷，楊梅素糖苷含量最低；不同茶葉中以三糖苷的平均含量最高，二糖苷次之，平均含量最低的為單糖苷。

差異性分析結果顯示，黔西南地區綠茶茶葉中總黃酮醇糖苷、槲皮素糖苷、山奈素糖苷、單糖苷、二糖苷含量顯著高于其它地區（P＜0.05），貴陽地區綠茶和黔東南地區綠茶中總黃酮醇糖苷、山奈素糖苷、單糖苷、二糖苷、三糖苷無顯著差異（P＞0.05）；黔西南地區綠茶和黔東南地區綠茶中楊梅素糖苷含量顯著高于其它地區（P＜0.05）；貴陽地區綠茶中三糖苷含量顯著高于其它地區（P＜0.05）；遵義地區綠茶和黔南地區綠茶在總黃酮醇糖苷、楊梅素糖苷、槲皮素糖苷、山奈素糖苷、單糖苷、二糖苷、三糖苷含量無顯著差異（P＞0.05）。

6 個地區的綠茶中21 種糖苷中Q-gal 和Kgal 含量雖有差異但不顯著（P＞0.05）；黔西南地區綠茶中Q-glu、M-glu、K-glu-rha 和K-glu 的含量顯著高于其它幾個地區綠茶（P＜0.05）。貴陽地區綠茶中K-glu-rha-glu 含量顯著高于其它幾個地區，且為21 種糖苷化合物中含量最高。

2.6 不同地區綠茶的識別分析

2.6.1 主成分分析（PCA）在進行主成分分析之前，先對綠茶樣本是否存在異常樣本進行判定。Hotelling's T2Range 算法是常用一種常用的判定方法，當樣本的值超過T2臨界（99%）值時，說明該樣本與其它樣本間存在較大差異。結果如圖3 所示，綠茶樣本的值均未超過T2臨界（99%）值，說明選取的綠茶樣本可用于主成分分析模型的建立。

圖3 綠茶樣品的Hotelling's T2 Range 圖Fig. 3 Hotelling's T2 Range plot of green tea samples

根據表2 計算出的每個茶葉中單個黃酮醇苷類化合物的含量，使用主成分分析PCA 來闡明每個茶葉中黃酮醇苷類化合物組成的貢獻，以反映通過程序鑒別的茶葉樣品的聚類。圖4 顯示了分配給不同程序的茶葉的得分圖。前兩個主成分分別代表6 個地區的茶葉樣品的可變性的方差貢獻率的42.1%和20.2%，累計方差貢獻率為62.3%。

圖4 依據21 種黃酮醇苷類化合物的含量對不同產地綠茶進行主成分分析Fig. 4 PCA plots of green tea from different producing area based on the content of 21 flavonol glycosides

從圖4a 中可知，6 個地區的綠茶樣品對應的分值有明顯差異，各地區的茶樣有較好的聚集且茶樣且無重疊部分，PC1 和PC2 平面中6 個地區綠茶樣品得到有效的聚類，樣品的區分度較好。從圖4b 的加載圖中可以觀察到變量的方向，PC1 和PC2 中除K-gal 和Q-gal 貢獻較小外，其它化合物貢獻均大于0.2，但不存在突出貢獻變量。綜上，不同產地綠茶樣品可根據黃酮醇苷類化合物的含量進行PCA 聚類分析。

2.6.2 BP 人工神經網絡分析（BP-ANN）使用SPSS 軟件進行BP 人工神經網絡分析，隨機抽取70%的茶葉樣本作為訓練集，剩余的30%茶葉樣本作為測試集，對BP 人工神經網絡分析模型的識別能力和預測能力進行了評價。結果表明，該模型的輸入層神經元為21 個、隱藏層神經元為13 個和輸出層神經元為6 個，隱藏層層數為1。

從表3 可知，在模型訓練和測試過程中，代表6 個不同地區的所有茶葉樣品識別的準確率均為100.0%，說明BP 人工神經網絡分析模型具有較好的適用性。根據模型中的重要性和規范化的重要性得知（圖5），規范化的重要性大于80%的化學標記有9 個，分別為K-gal-rha-rha、K-glu-rha、K-gal、K-glu、K-glu-rha-rha、K-gal-rha-glu、Mgal-rha-glu、Q-gal-rha-glu 和Q-gal-rha-rha，其中K-gal-rha-rha 和K-glu-rha 的重要性達到100%。

表3 BP-ANN 的訓練和測試結果Table 3 Model training and prediction results of the BP-ANN model

2.6.3 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）為確定分組樣品的差異，進一步采用PLS-DA，以21種黃酮醇苷類化合物為自變量（X），6 個地區綠茶作為因變量（Y），建立PLS-DA 分析模型。結果表明，分析模型的擬合指數分別為R2X（cum）=0.992、R2Y（cum）=0.942，預測指標Q2（cum）=0.782，表明該模型能反映總自變量的99.2%，能反映總因變量的94.2%，預測能力為78.2%，說明建立的PLSDA 分析模型結果可靠。

PLS-DA 得分圖（圖6a）顯示了R2X 中特征值貢獻度最大的兩個，且兩個R2X 均沒有特征貢獻變量，說明21 種黃酮醇苷類化合物的值對該模型的總方差影響均衡。圖6b 顯示了在PLS-DA 預測模型中自變量對于分析結果的貢獻率，變量值與各糖苷對于模型貢獻率呈正相關。從圖中可知，VIP 值＞1 的變量有K-gal-rha-rha、K-glu-rhaglu、K-gal-rha、K-glu-rha-rha、Q-gal-rha-rha、Mgal-rha-glu、Q-glu-rha-rha 和K-glu-rha，該8 個變量可以作為綠茶中地理溯源的PLS-DA 模型最重要的化學標記成分。

圖6 不同產地綠茶樣品PLS-DA 分析結果圖Fig. 6 Comparison of the PLS-DA analysis results of green tea samples from different regions

2.6.4 線性判別分析（LSD）LSD 以21 種黃酮醇苷類化合物為自變量，6 個地區綠茶作為因變量，建立判別模型，分析方法采用Fisher 函數和交叉檢驗。由表4 可知，此模型對綠茶產地的整體判別準確率為100%，6 各地區茶葉的交叉驗證結果準確率為100%，其中銅仁綠茶的準確率為75%。說明使用線性判別對不同產地綠茶的判別效果較好。

表4 基于黃酮醇苷類化合物含量的茶葉分類判別結果Table 4 The discrimination results of tea based on the content of flavonol glycosides

3 結論

采用高分辨質譜儀結合三重四極桿質譜儀，建立了測定茶葉中黃酮醇糖苷類化合物的分析方法。通過與標準物質比對、分析黃酮醇糖苷類化合物組成及裂解規律，并結合高分辨質譜進行結果解析，共鑒定識別出茶葉中21 種黃酮醇糖苷類化合物，包括5 種楊梅素糖苷（三糖苷2 鐘、二糖苷1 種、單糖苷2 種）、8 種槲皮素糖苷（三糖苷4 鐘、二糖苷2 種、單糖苷2 種）和8 種山奈素糖苷（三糖苷4 鐘、二糖苷2 種、單糖苷2 種）。使用三重四極桿質譜儀對不同產地綠茶中的21 種黃酮醇糖苷類化合物進行測定，以Q-glu-rha 為標準品對其它沒有標準物質的黃酮醇糖苷類化合物進行相對定量。

結果表明，不同產地綠茶中黃酮醇糖苷類化合物的含量及分布存在差異，經化學計量學模型分析，采用21 種黃酮醇糖苷類化合物對綠茶地理溯源分析。PCA 顯示各地區的茶樣有較好的區分度，樣品得到有效的聚類。BP-ANN 顯示分析模型具有較好的適用性，對6 個地區的綠茶樣品識別的準確率均為100.0%，并得到2 種規范化的重要性為100%的黃酮醇苷類化合物標記物（P<0.05）。PLS-DA 顯示預測能力為78.2%，預測能力較好，分析結果可靠，判別出重要化學標記成分8 種（VIP>1）。LSD 表明對6 個地區整體判別準確率為100%，交叉驗證結果準確率為100%，判別效果較好。綜上，采用21 種黃酮醇糖苷類化合物的指紋技術對綠茶地理溯源分析是可行的。

研究開發建立的分析方法適用于分析茶葉中的黃酮醇糖苷類化合物，結合各分析模型成功對不同產地的茶葉進行了地理溯源分析。研究結果為茶葉指紋圖譜和化學判別提供參考指標，為茶葉地理溯源提供科學依據，為茶葉產品認證及建立質量追溯體系提供相應技術和理論支撐。在后續研究中應增加有統計意義和代表性的樣本量，構建出穩健、有效的產地判別模型，以進一步評價黃酮醇糖苷類化合物在茶葉品質中的適用性。