MDCK 細胞無血清懸浮培養技術在流感疫苗研究與生產中的應用進展

靳莉武 張震宇 靳冬武 馬花 馬玉梅 喬自林 王家敏

（1.西北民族大學生物醫學研究中心 細胞基質疫苗關鍵技術與產業化教育部工程研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；4.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030；5.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，蘭州 730030）

流感，全稱為流行性感冒，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，它通過空氣飛沫傳播，具有易變性和強傳染性，大多數人易感染。流感的發病率通常較高，歷史上已多次爆發全球性流行［1］。流感疫苗的接種被認為是一種重要的公共衛生措施，能夠顯著降低流感疾病對社會和經濟的影響，它是預防流感、減少流感相關重癥和死亡的有效手段，可以減少疫情的傳播和流行范圍，從而降低社會的疾病負擔和醫療資源的壓力［2］。

自1945 年以來，基于雞胚培養的傳統流感疫苗一直發揮著重要的作用，該技術成熟，生產規模較大，是目前價格最為便宜的流感疫苗［3-4］。但是由于其疫苗工藝難以實現全面自動化（圖1），且易受禽流感及其他家禽疾病爆發的風險影響而導致雞胚供應不足，限制了疫苗的產量，存在極大的問題［5］；另外有研究結果表明，用于疫苗生產的雞胚適應流感病毒株本身與世界衛生組織推薦的原型株在抗原位點B［H156Q，G186V］和D［S219Y］上有3 個氨基酸突變，這些突變也可能導致疫苗的抗原性、免疫原性和效力發生顯著改變。這一發現對流行病學和疫苗設計具有重要意義，提醒人們在疫苗生產過程中需要更加關注病毒株的適應性突變，以提高疫苗的效果［6］。1995 年，WHO 建議使用哺乳動物細胞培養代替雞胚培養來生產流感疫苗，如MDCK 細胞、Vero 細胞［7-8］、PER.C6 細胞［9］、EB66 細胞［10］等。其中MDCK 細胞的受體與人類細胞表面的受體更相似，與流感病毒的結合更為緊密。因此，人流感病毒在MDCK 細胞中不需要適應細胞受體的變化，從而減少了突變的可能性，這也意味著在MDCK 細胞中培養的病毒更接近于原始病毒株，從而提高了疫苗的有效性［11］；而且相比其他細胞系，MDCK 細胞具有較好的細胞生長特性和易于操作的優勢，能夠產生更高的病毒滴度，是經證實適用于生產流感病毒的細胞之一［12-13］。MDCK 細胞主要以貼壁形式培養，但這種方式存在細胞損傷、細胞密度低和病毒產量不穩定等問題（圖2）。無血清懸浮培養技術的出現解決了這些問題，使得MDCK 細胞能夠在懸浮狀態下進行大規模培養并提高病毒產量。

圖1 雞胚流感疫苗工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of chicken embryo influenza vaccine

圖2 細胞流感疫苗工藝流程圖Fig.2 Process flow diagram of cellular influenza vaccine

因此，建立能夠滿足流感病毒疫苗的大規模生產的MDCK 全懸浮細胞系，成為制備安全、有效、質量可控的流感疫苗的關鍵。

1 MDCK 細胞

MDCK 細胞英文全稱為Madin-Darby Canine Kidney Cells，為犬腎細胞，呈上皮樣，貼壁培養型連續傳代細胞。1958 年，由來自美國加州大學伯克利分校海軍研究實驗室的SH Madin 和NB Darby 建立，取材于健康Cocker Spaniel 犬的腎臟，原代培養時呈成纖維樣，經過不斷的傳代純化，上皮樣細胞逐漸成優勢群體［14］。1964 年，在培養至49 代時提交給美國典型培養物保藏中心（ATCC），并被編號為Certified Cell Line 34（CCL-34）［15］。Gaush、Leighton 等對MDCK 細胞進行了生長特性、免疫學及細胞遺傳學特性等一系列研究，表明該細胞形態一般較為規則，細胞較大，呈扁平狀，梭形或多邊形，其中央有扁圓形的細胞核，在平板上培養時會合成緊密連接蛋白形成單細胞層，具有接觸抑制的特性［16-18］。

研究表明，MDCK 細胞系在多種病毒的增殖和純化中得到了廣泛的應用，包括呼腸孤病毒（reovirus）、犬細小病毒（adenovirus）、腺病毒（canine parvovirus，CPV）、貓粒細胞缺少癥病毒（feline panleukopenia virus，FPLV）及禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）等［19-21］，尤其是對于流感病毒感染表現出高效的感染性和快速的增殖能力［22］，被公認為是最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產的3種細胞系之一［23］。20 世紀90 年代中期被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推薦為第一批用于替代雞胚生產季節性流感疫苗的傳代細胞系之一［24］。

MDCK 細胞在傳統的培養方法中存在多個問題，包括生長速度緩慢、高度分化、易感染性低和穩定性差等，此外它需要附著在培養基中的載體表面上生長，容易受到基質表面積的限制，難以實現大規模生產［25］。另外，貼壁培養MDCK 細胞需要添加動物血清來提供細胞貼壁、增殖和維持生長所需的生物因子和營養成分。然而，動物血清存在潛在的生物安全風險，可能攜帶外源微生物和病原體因子，同時也增加了工藝成本［26］。鑒于上述問題，尋找新的培養方法以改善MDCK 細胞的生長和穩定性，并替代動物血清，是解決現有問題的重要方向（圖2）。這將為更有效、安全和經濟的大規模生產流感疫苗提供可能性。

2 MDCK 細胞懸浮培養馴化技術

在實際生產中，懸浮培養不受生長表面基質和面積的限制，無需貼壁和消化，易于擴大細胞培養規模，降低了成本，可利用生物反應器大規模、高效率生產生物制品，具有生產效率高、操作簡單、質量與生物安全易控制等優點［12,27］。

在懸浮馴化過程中，研究人員采用先進的細胞生物學手段，通過逐步降低細胞對基質附著的依賴性，逐漸讓MDCK 細胞在懸浮狀態下生長和繁殖。這有助于減少細胞的機械損傷和減少細胞間的接觸，降低死亡率，并提高細胞的生理活性和生命周期。通過優化培養基的組成，可以提供充足的營養物質、生長因子和適當的環境條件，以促進MDCK細胞的生長和代謝活動。此外，在懸浮馴化和篩選過程中，研究人員還需要仔細評估細胞株的穩定性、遺傳特性和表達產物的一致性。只有經過詳細的篩選和驗證，才能選擇最合適的細胞株用于進一步的研究和生產應用。2002 年，Novartis 公司采用 ATCC的MDCK CCL-34 細胞株進行馴化篩選，經過數月得到了第一株懸浮細胞MDCK 33016-PF，可在無血清無蛋白條件下懸浮生長［12］。另外，目前已馴化為全懸浮培養的MDCK 細胞株還有MDCK-SFM2、siat7eexpressing MDCK［28］、MDCKSUS2［29］等。

目前，針對MDCK 懸浮細胞的馴化方法主要包括以下幾種途徑：（1）在將MDCK 細胞轉化為懸浮細胞之前，首先使其適應于某種已知成分的無血清培養基中進行培養。這個過程可以通過直接法和間接法來實現。直接法是完全替換培養基的方法。具體而言，直接法馴化MDCK 細胞的方法是將傳統的血清含量較高的培養基逐漸轉變為無血清培養基。這一過程可以分步進行，逐漸減少血清的配比，同時增加無血清培養基的配比（圖3）。通過這種方法，可以逐漸使MDCK 細胞適應無血清條件下的培養。間接法馴化MDCK 細胞的方法是在馴化過程中，引入特定的生物因子和小分子化合物，以促進細胞適應無血清培養條件。這些生物因子和化合物可以模擬血清中存在的生長因子和細胞信號通路，并幫助MDCK 細胞適應無血清環境。這些馴化方法的目的是降低或消除MDCK 細胞對血清的依賴性，并使其適應無血清培養條件。通過這種方式，可以滿足生物安全性要求，減少外源致病因子的潛在風險，并降低生產成本?？傊?，MDCK 懸浮細胞的馴化方法主要包括直接法和間接法，在無血清培養條件下培養，以逐步減少對血清的依賴性，為進一步的研究和生產提供更適用的細胞株。

圖3 MDCK 細胞直接法馴化流程Fig.3 Process of direct domestication of MDCK cells

（2）基因改造。有文獻表明，人類的Siat7e 全長基因的表達與細胞的貼壁依賴性相關，Siat7e 基因編碼人的唾液酸轉移酶ST6GalNAc V，該蛋白質負責從GM1b（單唾液酸神經節苷脂）合成GD1α（二唾液酸甘苷），相對于貼壁依賴性HeLa 細胞，非貼壁依賴性的HeLa 細胞表現出了較高水平的Siat7e 基因表達，而當使用SiRNA 技術抑制Siat7e 基因的表達后，觀察到這些細胞的貼壁性能得到了明顯的增強［30］。這意味著Siat7e 基因在細胞貼壁過程中可能存在一定的抑制作用。這一發現進一步揭示了Siat7e在細胞黏附和貼壁性能中的重要作用，并為深入研究細胞黏附機制提供了新的線索。Chu 等［28］通過基因工程方法改變MDCK 細胞的貼壁依賴性，構建了穩定表達Siat7e 的MDCK 細胞系，使其能夠懸浮培養；他們將人類的Siat7e 全長基因的真核表達質粒轉化大腸桿菌DH5α，經QIAprep Spin Miniprep kit（Qiagen）純化提取轉染用質粒ST6GalNac V，使用轉染試劑 Lipofectamine2000 Regent 轉染MDCK 細胞，表達Siat7e 的MDCK 細胞系改變為非貼壁依賴性。并且在后續用B/ Victoria/ 504/ 2000 型流感病毒感染改良細胞后的生產實驗中結果表明，細胞源性病毒與雞胚源性病毒具有相似的抗原性，其核苷酸序列完全相同。從表達Siat7e 的細胞中產生的血球凝集素（以每106個細胞的血球凝集單位表達）比親代MDCK 細胞產生的血球凝集素的特異性產量高約20 倍。

3 無血清培養基的研發與應用

培養基是細胞培養的關鍵因素之一，它是細胞體外生長的環境基礎。據培養基成分的差異，可將其分為有血清培養基和無血清培養基［31］。

傳統的細胞培養通常使用含有動物血清的培養基，通過血清向細胞提供貼壁因子、生長因子、激素和營養物質等。然而，血清作為添加劑存在以下缺點：首先，其成分復雜且不確定，批次之間存在差異，這增加了疫苗等細胞產品的生產和質量控制難度；其次，血清容易引起細菌、真菌、內外源性病毒以及支原體等微生物的污染風險，增加了疫苗生產的安全問題；第三，血清本身價格較高且供應量有限，同時也增加了生物制品的下游純化難度。因此，開發無血清培養基勢在必行，旨在解決上述問題。

無血清培養基的發展歷史可以追溯到20 世紀50 年代。起初，使用傳統的培養基來維持細胞生長和增殖是常見的做法，但血清成分的不確定性和批次之間的差異使科學家們開始尋求替代方案。在20世紀60 年代，人們意識到細胞可以在人工合成的培養基中存活，并開始嘗試去除血清成分。然而，初期的無血清培養基并非完全成功，因為細胞的生長和分化受到了限制。隨著時間的推移，科學家們不斷改進培養基的配方和優化條件。他們試驗不同的組分和添加物，以提供細胞所需的營養和生長因子。此外，細胞外基質蛋白和細胞因子的添加也起到了重要的作用，幫助細胞附著和生長。在20 世紀80年代和90 年代，隨著細胞生物學和生物技術的進步，無血清培養基的開發取得了重大突破?？茖W家們發現，通過應用特定的生長因子和信號通路激活劑，能夠實現細胞的無血清培養和增殖。隨著分子生物學和基因工程技術的快速發展，無血清培養基的配方也不斷更新和改進。1979 年，Taub 等［32］在基礎培養基中添加了胰島素、前列腺素、氫化可的松、轉鐵蛋白和三碘甲狀腺激素作為血清替代品，使MDCK 細胞在其中生長一個月，生長速度與細胞在添加血清培養基中生長的速度相當。

現在，人們已經成功地開發了許多特定于不同細胞類型和應用的無血清培養基。無血清培養基的發展歷程是通過不斷的實驗和探索，研究人員逐漸揭示了細胞生長和增殖的復雜機制，并找到了能夠代替血清的替代品［33］。這不僅改變了細胞培養的方式，也推動了細胞生物學和生物醫學研究的進步。隨著技術的不斷演進，無血清培養基的發展仍在繼續，并為許多生命科學領域的研究提供了更好的工具和平臺。在2003 年召開的“改進體外培養方法,減少胎牛血清使用”的會議中，專注于改善體外培養方法并減少對胎牛血清的依賴。與會者一致呼吁全球減少血清的使用，并積極推動無血清培養細胞技術的發展。這一會議的召開為無血清培養細胞技術的逐漸興起提供了契機［34］?，F已有許多公司已逐步研發出了適用于MDCK 懸浮細胞培養的無血清培養基，例如Ultra-MDCK 培養基、MDSS2N 培養基、Invitrogen 公司的EpiSerf 培養基及Sigma-Aldrich 公司的 MDCK-LP、MDCK-LPM 培養基等［19,35-37］。

4 MDCK 細胞懸浮馴化技術的應用

近年來，MDCK 細胞懸浮馴化技術在細胞生物學和生物醫學領域引起了廣泛的關注和研究。通過馴化MDCK 細胞，可以實現大規模生產、快速復制和高效表達特定蛋白質等目標。這為病毒研究、藥物開發、基因工程等方面提供了重要工具和平臺。

4.1 流感疫苗制備

MDCK 細胞懸浮馴化技術可應用于流感疫苗的制備。傳統的流感疫苗制備通常使用雞胚進行病毒繁殖和疫苗生產，但病毒利用雞胚進行繁殖存在繁雜的操作、變異和污染等問題。而MDCK 懸浮細胞基質生產工藝可以避免這些問題，具有生產效率高、病毒感染效率高、適應多種流感病毒株、穩定性高、安全性高等優勢，可替代傳統病毒培養方法，提高疫苗的生產效率。

目前以MDCK 細胞為基質生產并已獲準上市的疫苗如表1 所示。其中，Novartis 公司使用懸浮細胞MDCK 33016-PF 生產，商名為Optaflu?/Flucelvax?。臨床數據顯示，與傳統的雞胚流感疫苗相比，Optaflu?/Flucelvax?在免疫原性、安全性和有效性等方面表現出更好的性能。這一疫苗的上市為流感疫苗的生產提供了一種更先進和可靠的方法［12］。韓國SK Chemicals 公司生產的SKYCellflu 三價和四價亞單位疫苗由MDCK-Sky3851 細胞生產，在韓國獲得6 個月及以上的許可，在馬來西亞和泰國獲得3 年及以上的許可［38］。

表1 國際上已獲批上市的MDCK 細胞基質流感疫苗Table1 Internationally approved MDCK cells matrix influenza vaccine

此外，其他研究者也對于MDCK 懸浮細胞培養流感病毒做了相關的研究。2009 年，黃錠［43］成功開發了適合MDCK 單細胞懸浮培養的無血清培養基MDCK-SLP、MDCK-SHP，通過使用硅化方瓶-搖床體系與調整培養基配方相結合的方法，成功馴化得到適合單細胞懸浮培養的ssf-MDCK 細胞，并對MDCK 無血清懸浮培養體系生產流感病毒的過程條件進行了初步優化，在優化條件下比較含血清培養基與無血清培養基的產毒情況；實驗結果表明，無血清培養基MDCK-SLP 和MDCK-SHP 中病毒的產量均高于含血清培養基中的病毒產量，二者的最大病毒TCID50滴度值為10（9.37±0.83）TCID50/mL、10（2.85±0.81）TCID50/mL。

在2013 年，張良艷等［44］進行了一項研究，采用直接法和間接法對MDCK 細胞進行馴化，使其適應于已知成分的無血清培養液SFM4MEGAvir，再通過細胞旋動培養器Cellspin 進行懸浮培養，成功地獲得了MDCKS 懸浮培養細胞。該細胞在營養充足的條件下生長良好，并可以進行大規模培養，滿足流感病毒培養的需求。在接種H5N1 疫苗株VN 株后，MDCKS 細胞能夠產生較高滴度的流感病毒。2021 年，Bissinger 等［45］用MDCK 懸浮細胞以單細胞懸浮方式生長，接種H1N1 流感病毒，測定各個時期的細胞活力及代謝產物，及接毒后的TCID50滴度。結果表明，TCID50滴度在接毒后18-27 h 內能夠達到最大值（2.7±0.5）×109TCID50/mL。趙彩紅等［46］通過直接適應的馴化方式獲得了一株懸浮細胞命名為MDCK-XF03，并且實現了從5 L 生物反應器到75 L生物反應器的擴大培養。2022 年，李樂凱等［47］在經無血清懸浮馴化得到的MDCK 細胞上分別接種4 種型別流感病毒，結果表明，H1N1 的血凝滴度7 log2（HAU/25 μL），HA 含量達到20 μg/mL；H3N2的血凝滴度達11 log2（HAU/25 μL），HA 含量達到40 μg/mL；BV 的血凝滴度達9 log2（HAU/25 μL），HA含量達30 μg/mL；BY 的血凝滴度達9 log2（HAU/25 μL），HA 含量達40 μg/mL；4 種型別的流感病毒培養效果均可達到預期。另外中國生物上海生物制品研究所的四價流感病毒裂解疫苗（MDCK 細胞）于2023 年1 月獲得了國家藥品監督管理局簽發的《藥物臨床試驗批準通知書》［48］。該疫苗是國內首個基于無血清全懸浮細胞培養技術的流感疫苗，獲得了進入臨床試驗的批準。這意味著它可以進一步進行臨床試驗，并為未來的流感防控提供新的和潛在的可行選擇。

4.2 細胞工程和基因表達

MDCK 細胞懸浮馴化技術在基因工程領域也得到了廣泛的應用。通過基因編輯和轉染技術，可以在MDCK 細胞中引入特定基因或刪除目標基因，從而實現對特定蛋白質的過表達或沉默，提供了一種靈活和可控的工具，用于研究細胞信號通路、蛋白質功能以及疾病模型的建立［49-50］。舉例來說，通過轉染MDCK 細胞的特定基因，可以構建與疾病相關的細胞模型，用于研究疾病的發病機制和新藥的篩選。通過引入與特定疾病相關的突變基因或表達特定蛋白質，可以模擬疾病的發生過程并研究其相關的生物學效應。這為疾病研究領域提供了一種可控的實驗平臺，有助于更好地理解疾病的發生機制以及尋找新的治療方法。同時，MDCK 細胞懸浮培養的優勢使得基因工程研究更具可行性。相比于傳統的MDCK 細胞貼壁培養方式，懸浮細胞培養能夠提供更大的細胞產量和更方便的操作。這對于大規模表達目標蛋白質或進行高通量篩選實驗十分重要。通過MDCK 細胞的懸浮馴化技術，科學家們可以更好地利用該細胞系統進行基因工程實驗，加速藥物研發和疾病機制研究的進程。MDCK 細胞懸浮馴化技術在基因工程領域的應用為研究人員提供了一種靈活、可控的工具，用于探究細胞信號通路、蛋白質功能以及疾病模型的建立。

5 MDCK 懸浮細胞在疫苗生產中的安全性研究

MDCK 懸浮細胞在疫苗生產中的安全性研究已經被廣泛關注，研究人員對MDCK 懸浮細胞進行了多方面的安全性研究。一方面，通過培養MDCK 細胞的穩定性和一致性來評估其安全性。這包括細胞的遺傳穩定性、生長特性和表型特點的監測等。另一方面，研究人員對使用MDCK 懸浮細胞生產的疫苗進行了安全性評估。他們通過對疫苗制劑的物質成分、病毒含量和活性進行檢測，以保證疫苗的純度和有效性。此外，還會通過動物實驗和臨床試驗來評估疫苗的免疫原性和安全性［51］。

5.1 成瘤性與致瘤性

用MDCK 細胞作為疫苗生產中病毒復制的基質具有許多顯著的優勢，但有實驗表明，該細胞在免疫缺陷小鼠皮下或肌肉接種后可誘導腫瘤發生［52］。出于對安全性的慎重考慮，制約了其在國內用于人用疫苗的生產。有效評估MDCK 細胞的致癌能力，避免細胞的致癌基因可能會對人類的健康構成潛在威脅，確保該細胞系安全用于流感疫苗生產是目前研究的重點［39,53］。近年來，科學家們對于MDCK細胞的成瘤機制進行了深入研究發現，了一些與細胞增殖、轉移和侵襲相關的信號通路和因子，如MDCK 細胞中的Ras/MAPK 和PI3K/Akt 信號通路被認為在腫瘤的發生和發展中發揮著重要作用［39］。這兩個信號通路的異常激活可能導致細胞凋亡抑制、細胞增殖增加以及侵襲和轉移能力的提高。因此，研究人員對于這些信號通路的調節和干預具有極大的興趣，希望通過抑制這些通路的活性來抑制腫瘤的生長和進展。深入了解這些信號通路的作用機制將有助于我們更好地理解腫瘤發生發展的分子基礎。另外，研究發現，MDCK 細胞在體內具有一定的轉移能力，可以通過侵入周圍組織和血管來形成轉移瘤。研究人員正在探索MDCK 細胞轉移的調控機制，以及與轉移相關的因子和信號通路［54-55］。這些研究可以幫助我們更好地理解腫瘤的轉移過程，并為轉移性腫瘤的治療提供新的思路。通過比較不同類型的MDCK 細胞株和不同分化狀態下的MDCK 細胞發現，了一些與腫瘤相關的分子特征。如表觀遺傳修飾、腫瘤抑制基因和腫瘤相關基因的表達水平可能與其成瘤性和致瘤性有關［52,56-57］。利用MDCK 細胞構建的腫瘤模型也被廣泛應用于抗腫瘤藥物篩選和治療研究中。這些模型可以評估候選藥物的抗腫瘤活性，并幫助研究人員更好地了解腫瘤細胞的藥物敏感性和耐藥機制。

5.2 宿主細胞的遺傳穩定性

MDCK 懸浮細胞的遺傳穩定性是評估其在疫苗生產中安全性的關鍵因素之一。研究表明，MDCK細胞在長期培養過程中能夠維持相對穩定的染色體結構和基因表達模式。通過使用分子生物學技術和細胞遺傳學方法，可以檢測細胞中的染色體改變和突變頻率，以評估MDCK 細胞在疫苗生產中的遺傳穩定性。此外，通過利用新的高通量測序技術以及基因組學和轉錄組學分析方法，可對MDCK 細胞的基因組進行全面的解析［58-59］。這些研究揭示了MDCK 細胞中存在的染色體易位、突變和拷貝數變異等染色體改變，并確定了其中一些對細胞生長和穩定性具有重要影響的關鍵基因。此外，通過結合CRISPR/Cas9 基因編輯技術，還成功地對MDCK 細胞中的關鍵基因進行了精確的編輯和改造，以進一步提高其遺傳穩定性［60］。

5.3 疫苗產品的安全性評估

MDCK 懸浮細胞疫苗產品的安全性是在多個方面進行評估的，以確保其在疫苗接種中的安全性［61］。這包括對疫苗產品中的雜質、殘留物和可能的毒性成分以及重復給藥、生殖毒性、免疫原性和保護作用等方面進行分析和檢測［62］。研究人員通過對疫苗產品的成分、結構和功能進行詳細的分析，以確保疫苗在臨床應用中的安全性。此外，還需要進行動物實驗和臨床試驗，評估疫苗在動物和人體中的免疫原性和安全性［63-65］。

通過這些安全性評估，可以有效地確保MDCK懸浮細胞生產的疫苗在應用中的安全性和可靠性，為疫苗的研發和生產提供重要的保證。然而，仍需要進一步的研究和監管標準的制定，以應對不斷出現的新病毒和疫苗需求的挑戰。

6 總結與展望

綜上所述，流感疫苗對公共健康具有重要影響。隨著現代生物技術的發展，生產安全高效的疫苗以更快的速度和更低的成本成為迫切需求。利用細胞培養技術進行疫苗生產已成為生物制藥行業發展的必然趨勢。

傳統的MDCK 細胞培養方式多采用含血清的貼壁培養方法，但血清的成分復雜，成本高且存在批次差異大、污染風險高和下游純化困難等問題，使生產難以實現標準化。此外，貼壁細胞培養受到基質表面積限制，消化工藝復雜且生產時間長，難以實現大規模細胞培養和流感疫苗的生產。相比之下，MDCK 懸浮細胞培養突破了細胞生長受到表面積限制的制約。懸浮細胞能夠在反應器中快速生長，培養環境更為均一，細胞密度更高，這有利于大規模病毒繁殖，提高病毒產量。結合無血清培養基，在反應器中實現規?；囵B，便于檢測和控制細胞生長的參數，并降低企業生產成本，方便下游純化，滿足疫苗大規模生產的需求。

然而，由于MDCK 細胞在免疫缺陷小鼠中可能引發腫瘤發生的潛在風險，限制了其在國內用于人類疫苗生產。因此，評估MDCK 懸浮細胞的安全性成為當前研究的焦點。通過深入研究MDCK 細胞的致癌機制、轉移調控機制和與腫瘤相關的分子特征，以全面評估其安全性，并探索新方法以降低潛在的腫瘤風險。因此，MDCK 細胞懸浮馴化及無血清懸浮培養技術的研究具有廣闊的應用前景，但必須在保證安全性的前提下進行進一步研究和探索，以確保其在疫苗生產中的可靠性和可行性。