基于流式細胞儀鑒定番石榴倍性方法的建立及應用

邵雪花 李桂蘭 肖維強 賴多 莊慶禮 秦健

（1.廣東省農業科學院果樹研究所 農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640；2.長江大學園藝園林學院，荊州 434000）

番石榴（Psidium guajava Linn.）別名芭樂、雞矢果等，系桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬（Psidium），原產于南美洲，現廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區［1］。番石榴果實芳香、甘甜，具有很高的營養價值［2］。另外，長期以來民間用其葉做茶，對腹瀉、糖尿病、口腔潰瘍等均有一定的治療效果［3-5］。經藥理研究證實，番石榴富含酚類、黃酮類、萜類、多糖等生物活性物質，具有抗氧化、護肝、抗菌、抗糖尿病、抗炎和抗癌活性［1,6-8］。正因為番石榴的食用和藥用價值高，2019 年全球番石榴產量就已達5 585 萬t［9］。目前，我國福建、廣東、廣西等地均有大量栽培［10］，其總產量僅次于印度，排名世界第二［2］。然而，當前我國番石榴主栽品種單一，品種資源匱乏，不利于我國的番石榴產業發展，因此，選育出更多的番石榴新品種刻不容緩。

對于植物的育性研究和新品種選育工作而言，其染色體的倍性鑒定尤為重要［11］。流式細胞術是一種利用流式細胞儀快速多次參數分析流體中單個細胞的技術［12］。近年來，流式細胞術因其操作技術簡單、用時短、效率高、鑒定結果準確等優點，被普遍用于檢測植物的基因組大小和染色體倍性，如馬鈴薯［13］、大豆［14］、菊芋［15］和棉花［16］等。目前，有關番石榴倍性的研究尚未見報道，嚴重限制了番石榴的倍性育種和雜交育種工作。本研究通過比較離心處理、樣本部位和保存方式等對番石榴倍性鑒定效果的影響，建立基于流式細胞術的番石榴倍性鑒定方法，并用該方法對33 種番石榴種質資源進行倍性鑒定，旨為后續番石榴倍性鑒定以及推動番石榴育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 33 份番石榴種質資源的嫩葉、花瓣、芽均采自于廣東省農科院果樹研究所優稀水果研究室番石榴資源圃。

1.1.2 試劑及儀器設備 mGb 解離液購自南京博巧生物科技有限公司、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液購自北京索萊寶科技有限公司、BD FACSVerse 流式細胞儀購自上海土森視覺科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術方法的建立

1.2.1.1 樣本部位的選擇 分別取番石榴嫩葉、芽、花瓣，按照以下方法進行處理，比較不同組織提取細胞核的含量。每個處理重復3 次。

處理方法：取0.50-1.00 cm2待測樣本，置于培養皿中，加入1 mL 預冷的mGb 解離液，使待測樣品完全浸沒在解離液中。使用刀片垂直快速切碎樣品，此過程盡量將待測樣品浸沒于解離液中，靜置1 min 以獲取完整的細胞核。吸取培養皿內的混合溶液，用400 目濾膜將懸濁液過濾至流式管內，再加入30 μL 預冷的PI 染料，混勻后4℃避光染色10 min。最后使用流式細胞儀上機檢測，以二倍體番石榴品種‘珍珠’細胞組織的DNA 含量作為參照，每次檢測收集約100 000 個細胞，以CV 值（DNA 含量峰值的變異系數）的大小作為評價流式測定結果的參數。用FlowJo 軟件進行數據分析。

1.2.1.2 離心方案的優化 分別取0.50-1.00 cm2待測樣本，加入1 mL 預冷的mGb 解離液，快速切碎后用400 目濾膜將懸濁液過濾至1.50 mL 離心管中。4℃離心后去上清，保留200 μL 沉淀，分別加入預冷后的100 μL 解離液和30 μL PI 染料，混勻后4℃避光染色10 min，上機檢測。共設置4 個處理，分別 為：1 000 r/min 離 心5 min（L1），1 000 r/min 離心10 min（L2），2 000 r/min 離 心5 min（L3）和2 000 r/min 離心10 min（L4），以未離心組作為對照（CK）組。每個處理重復3 次。

1.2.1.3 樣本保存方式的比較 按照1.2.1 的處理方法，選取新鮮樣本作為對照（CK）組，冷藏（4℃）和冷凍（-20℃、-40℃、-80℃）4 種保存方式（均保存7 d）的花瓣，比較不同溫度處理后花瓣的細胞核含量。每個處理重復3 次。

1.2.2 番石榴種質資源倍性鑒定 取33 份番石榴種質資源的新鮮花瓣，采用建立的流式細胞術方法對其倍性進行檢測。

1.2.3 數據統計 采用FlowJo 軟件分析細胞流式數據。以CV 值（DNA 含量峰值的變異系數）的大小作為評價結果好壞的參數。

2 結果

2.1 樣本檢測組織的確定

本文分別取番石榴的嫩葉、芽和花瓣進行測定。結果（圖1）表明，花瓣作為檢測部位時收集到的細胞核數目最多，CV 值為1.96%，峰形效果最佳，噪音峰小且主峰明顯；嫩葉作為檢測部位時峰形效果次之，有噪音峰，碎片增多，CV 值為2.32%；芽作為檢測部位時可檢測到的細胞核數目明顯減少，雜峰較多，噪音峰干擾大，主峰不清晰。綜上表明，番石榴的花瓣更適宜作為倍性檢測的材料。

圖1 番石榴不同組織流式圖Fig.1 Flow chart of different tissues of guava

2.2 離心方案的確定

以番石榴花瓣為材料，將獲得的細胞核懸浮液分別設置不同離心轉速和離心時間。番石榴花瓣的細胞核相對DNA 含量結果如圖2 所示，CK 組獲得的細胞核DNA 含量最多且染色均勻，相對熒光強度集中，噪音峰少，主峰明顯，CV 值為1.97%；而離心后則導致細胞核DNA 大量損失，收集到的細胞碎片較多，主峰周圍噪音增多，無法形成明顯的主峰；L1 和L3 組由于離心時間過短，細胞碎片沒有得到有效分離，CV 值低于其他處理組；L2 組1 000 r/min離心10 min，熒光強度較為集中，獲得的細胞數量較多，CV 值為1.96%，在離心處理組中表現最好；L4 組2 000 r/min 離心10 min 后收集的樣本細胞數量較少，峰值降低明顯。因此，在制備細胞核懸浮液時，過濾后無需離心，染色后直接上機測定效果最佳。

圖2 番石榴不同離心方式的比較Fig.2 Comparison of different centrifugation methods of guava

2.3 樣本保存方式的確定

取不經低溫保存的新鮮番石榴花瓣作對照（CK）組，冷藏（4℃）和冷凍（-20℃、-40℃和-80℃）保存方式對番石榴花瓣各保存7 d 后進行測定。結果（圖3）表明，CK 組的檢測效果最好，收集到的細胞核DNA 含量最高，CV 值為1.96%，背景碎片少，主峰明顯；冷藏和各級冷凍處理下，只有-80℃冷凍處理對樣本的破壞性最小，獲取的細胞核DNA 含量明顯高于其他組，CV 值為1.88%，主峰明顯，但與對照組相比有少量偏鋒；冷藏（4℃）處理后，主峰較好，噪音峰少，但細胞核DNA 含量較低，CV 值升高為2.04%；-20℃和-40℃冷凍處理后造成峰圖噪音峰明顯增多，雜峰較多，收集到的細胞核DNA含量較低。綜上可見，新鮮番石榴花瓣染色后直接上機測定效果最佳。

圖3 番石榴不同保存溫度流式圖Fig.3 Flow diagram of different storage temperatures of P.guajava

2.4 流式細胞術鑒定番石榴倍性的方法

利用建立的流式細胞術分析方法，對33 份試驗樣本進行處理后上機檢測（圖4），其中縱坐標軸代表測定細胞數的相對值，橫坐標軸代表熒光的通道值，峰值的位置反應的是測試樣品的倍性，若峰值在50 左右，判定該品種為二倍體，峰值在100 左右，判定該品種為四倍體，峰值在150 左右，則判定該品種為六倍體。

圖4 不同倍性番石榴花瓣的相對DNA 含量Fig.4 Relative DNA contents of P.guajava petals with different ploidy levels

2.5 番石榴種質資源倍性鑒定

在本研究中，以已知的二倍體番石榴品種‘珍珠’做參照，采用流式細胞術對33 種番石榴樹種資源進行倍性鑒定，結果如表1 可得，變異系數CV 值（DNA含量峰值的變異系數）為1.68%-2.36%。其中，‘草莓’番石榴判斷為六倍體，其余32 份樣品（包括‘帝王’‘水蜜’‘金斗香’‘翡翠’‘紫果’等番石榴種質資源）均為二倍體，倍性系數介于0.42-0.59，倍性估算值為1.68-2.36。

3 討論

倍性分析是研究遺傳進化、開展倍性育種和雜交育種工作的基礎［11］。目前，流式細胞術因其制樣簡單、靈敏度高和準確性高等優點已成為鑒定植物倍性的首選方法［17］。然而，對于不同植物而言，采用不同組織部位、離心漂洗方式、保存溫度等均會影響倍性鑒定的結果可靠性［18-19］。

根據其他植物材料已有的研究報道，植物材料選取不當，會造成細胞核顆粒提取不足且雜質較多，影響倍性檢測效果。例如，趙孟良等［15］比較菊芋塊莖、根、老葉和嫩葉的倍性檢測效果發現，嫩葉是其倍性鑒定的理想材料；王婭麗等［16］發現以棉花嫩葉作為檢測材料的倍性鑒定效果優于老葉。本研究發現，花瓣作為檢測材料時熒光信號集中，受到的干擾最少，峰形效果最好；嫩葉作為測試材料時熒光信號較為集中，有少量干擾但不影響峰形判斷，效果次之；芽作為測試材料時熒光信號比較分散，主峰前后都有干擾增多，峰形效果差；故推薦番石榴花瓣作為其倍性鑒定的首選材料。

離心漂洗常被用于減少細胞核懸浮液的雜質成分對結果的干擾，但因植物材料不同導致離心的轉速及時間存在差異。例如，張桂芳等［20］比較不同離心時間對鐵皮石斛倍性檢測效果的影響，認為2 000 r/min 離心8 min 效果最佳；楊靜等［21］對桑樹的研究表明，不離心與離心漂洗1-2 次對其倍性檢測效果無差異。本研究中，離心處理后的番石榴細胞核懸浮液峰圖質量差，原因可能是細胞核DNA 鏈斷裂，導致碎片增加和熒光信號分散，因此番石榴細胞核懸浮液直接經400 目濾膜過濾后即可染色測定，無需離心，可顯著縮短樣品的制備時間，并提高其測定效率。

在收集野外番石榴資源，利用流式細胞術鑒定其染色體倍性時，從采集到實驗室測定的過程中，往往無法實現樣品即采即測，因此保存樣本以確保細胞懸浮液的有效制備對其倍性鑒定至關重要［21］。目前，對于部分無法在數日內檢測的樣本，低溫保存是植物倍性鑒定樣本保存的最常用方式［21-22］。本研究結果表明，新鮮番石榴花瓣得到的細胞核懸浮液最好，其次為-80℃冷凍處理組，該處理對樣本的破壞性最小，獲取的細胞核DNA 含量明顯高于冷藏和其他冷凍處理組，且主峰明顯，效果較好。冷藏（4℃）處理后會導致細胞核DNA 含量降低，而-20℃和-40℃保存，可能是因為冷凍造成番石榴花瓣組織中產生過多細胞碎片，雖不影響倍性鑒定正確性，但雜峰較多，效果不佳。

CV 值是判斷倍性檢測結果可靠與否的關鍵指標。Georgiev 等［23］認為，流式細胞儀檢測的CV 值在9.00%以內，其檢測結果就比較可靠。呂順等［17］也認為，對于含有較多酚類物質的植物，CV 值＜10.00%可達到理想結果。本研究采用優化的流式細胞術對33 份番石榴種質資源進行倍性鑒定，測定CV 值低于2.36%，表明優化的流式細胞術可以確保番石榴倍性鑒定結果的準確性。

4 結論

本研究建立了番石榴種質資源流式細胞術鑒定其倍性的方法，該方法檢測條件為：選取番石榴新鮮花瓣或-80℃冷凍保存的花瓣，加入1 mL 的mGb裂解液中混合切碎，400 目濾膜過濾后加入30 μL PI 染色1 min 即可上機檢測。33 份番石榴種質資源倍性整體變異系數為1.68%-2.36%，二倍體32 份，六倍體1 份。該體系的建立及番石榴種質資源倍性的明確對下一步番石榴倍性育種和雜交育種奠定了基礎。