我國作物病菌標準品的研究進展

楊文莉 朱梨梨 陳健 陳燕欣 姚涓 姜大剛

（華南農業大學生命科學學院，廣州 510642）

作物在生長發育過程中容易受到病菌感染，導致其生長狀況、產量和品質受到影響。為控制病菌傳播速度，減少病菌對農作物的侵害，及時準確地檢測出染病的植株極為重要。傳統的病菌檢測方法主要通過觀察染病植株和菌群的表征進行診斷，存在檢測滯后、成本高、靈敏度低等問題，影響對作物病害的控制。近年來，分子檢測技術在作物病菌檢測工作上的應用和發展，極大地縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，對病害的感染情況能夠更及時的掌握。國內相關監管部門陸續出臺了分子檢測標準與方法，以規范和促進作物病菌檢測工作的進行。在作物病菌的分子檢測工作中，標準品可為檢測結果提供可靠的參考值，提高檢測結果的可靠性和精準性。

根據中華人民共和國國家標準《標準樣品工作導則第2 部分：常用術語及定義》（標準號：GB/T 15000.2—2019）及中國合格評定國家認可委員會（CNAS）《標準物質/標準樣品生產者能力認可準則》（標準號：CNAS-CL04）指出，標準品是指適用于計量或檢測中，已被確定其符合測量過程的、具有高度均勻性和穩定性的材料［1］。標準品主要用于測量系統的校準、測量程序的評估和質量控制等幾個方面［2-3］。在全球范圍內，美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology,NIST）、澳大利亞國家檢測研究所（National Measurement Institute,Australia,NMIA）、中國計量科學研究院（National Institute of Metrology,China,NIMC）等多所專業機構已經開展標準品的研制［4］。經過多年發展，許多標準品已經被成功研制并投入使用。但作物病菌標準品方面的相關研制依然較少，不利于我國開展對作物病害的檢測防治工作。本文通過對作物病菌檢測方法、檢測標準及作物病菌標準品研究進展進行梳理總結，以期為我國作物病菌標準品的研制提供參考。

1 作物病菌及其檢測方法

作物病菌主要可以分為細菌、真菌和病毒3種［5］。作物感染病菌后，會出現變色、壞死、萎蔫、腐爛和畸形等癥狀。真菌感染存在易復發、傳播性強等問題，需要對受感染的作物進行及時的追蹤檢測和治療。病毒感染具有隱秘性強、傳播性強、表征不明顯等特點，通常無法及時發現并給予相對應的措施。據不完全統計，在全世界范圍內，由于作物感染病菌導致的直接或者間接的經濟損失高達400 億美元/年［6］。也有相關研究發現，在全球氣候變暖的環境影響下，土壤中作物潛在病原體的相對豐度會增加，使作物更容易感染病菌［7-8］?；谧魑锊【鷮r業生產造成的危害，在《中華人民共和國農業農村部公告第351 號》中，有15 種病菌被列入了《全國農業植物檢疫性有害生物名單》和《應施檢疫的植物及植物產品名單》，其中細菌7 種，真菌6 種，病毒3 種（表1）。例如，瓜類果斑病菌（bacterial fruit blotch,BFB）是一種嚴重的細菌性病害，該病菌可以侵染西瓜、甜瓜、南瓜、葫蘆等葫蘆科植物，使果實形成暗褐色病斑，后逐漸發展形成黑褐色壞死斑，最終導致腐爛，影響葫蘆科植物產品質量及產量，造成巨大的經濟損失，已成為影響我國葫蘆科植物農產品生產的主要病害之一［9］。玉米褪綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV）侵染玉米后會導致作物壞死，玉米產量下降，是我國禁止入境的檢疫性有害生物之一［10］。對于病菌引起的作物病害，在生產上可以通過作物輪作、使用抗性品種等方法降低作物病菌感染［11］，但無法在病害出現之前發現作物的感病情況。因此對作物感染病菌早期進行及時準確的檢測，可以為作物病害防治工作提供參考，減少經濟損失。

目前，常用的作物病菌檢測方法主要包括形態學、微生物學、生化鑒定以及分子檢測等。其中，傳統的方法是根據作物的生理狀態如枯萎、潰爛等癥狀進行初步的判斷，再通過分離病菌，觀察病菌的形態做出診斷［12-13］。雖然這些方法應用廣泛，但需要診斷者具備一定的專業知識，具有比較大的主觀性和不確定性；而且對于難以在體外培養的致病微生物（如病毒），鑒定難度大。為此，需要一種高效的方法，對感病的植株進行及時準確的檢測。分子檢測技術具有準確性好、檢測速度快等優點，在作物病菌檢測中應用越來越廣泛。李興紅等［14］通過酶聯免疫吸附（enzyme-linked immune sorbent assays,ELISA）的方法對辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）進行檢測，譙天敏等［15］通過巢式聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）檢測桉樹焦枯病。近年來實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）、數字PCR（digital PCR,dPCR）等分子檢測技術，也被運用到作物病菌檢測工作中［16］。高艷玲等［17］建立了苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）的RT-PCR 和RT-qPCR 檢測體系，可用于檢測馬鈴薯組織中及薊馬和蚜蟲體內的苜?；ㄈ~病毒；李輝等［18］建立了多年明孢盤菌（N.perennans）導致的蘋果牛眼果腐病微滴式數字PCR 檢測體系，實現對該病原菌的高效、高精度檢疫鑒定。dPCR 作為一種新的核酸定量技術，其不依賴于標準曲線可以對靶標基因的拷貝數進行絕對定量，具有靈敏度高、結果精準等優勢。將dPCR 應用于作物病菌檢測工作，可以使結果更加準確可靠，具有廣泛的應用前景［19-20］?！陡涕冱S龍病菌數字PCR 檢測》（標準號：DB 44/T 2220-2019）的出臺，將dPCR 技術應用到實際檢測工作中，在提高柑橘黃龍病菌檢測工作效率和結果準確性的同時，也為dPCR 技術應用到其他的病菌檢測中提供了參考。

為了使檢測過程更加規范和標準化，經查詢全國標準信息公共服務平臺（https://std.samr.gov.cn），我國已制定并發布超過230 項作物病菌檢測標準（表2），以規范和加快在生產上的應用。在這些標準中，國家標準共71 項，占比30%；行業標準占比最多，共133 項，占比55%；地方標準有32 項，占比13%；另有5 項國家標準計劃，目前處于起草階段（圖1）。柑橘黃龍病是一種由柑橘黃龍病菌侵染柑橘屬、金柑屬等蕓香科植物，導致染病作物葉片變黃和柑橘產量下降的疾病，該病已成為影響柑橘產業最嚴重的病害。目前已經制定和發布了《柑桔黃龍病菌實時熒光PCR 檢測方法》（標準號：GB/T 28062-2011）、《柑橘黃龍病菌數字PCR 檢測》（標準號：DB44/T 2220-2019）等相關檢測標準，促進了柑橘黃龍病檢測與防治工作的開展［21］。水稻細菌性條斑?。╮ice bacterial leaf streak,BLS）是對水稻危害最嚴重的細菌性病害之一，對水稻條斑病菌進行及時的檢測，可以控制病菌在水稻間的傳播速度，減少經濟損失［22］。目前《水稻細菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法》（標準號：GB/T 28099-2011）標準的出臺，對病菌信息、鑒定方法、鑒定標準等方面做出了詳細的介紹，使鑒定方法更加規范化，檢測結果更加準確。這些檢測標準的出臺對作物病菌檢測工作的規范化、檢測結果的標準化和可靠性有重要意義。

2 標準品與標準物質

在作物病菌檢測工作中，為確保檢測結果的準確性，需要標準菌株作為對照，提供參考依據。標準菌株是一種可溯源的且生物學特性穩定的標準品，在檢測中起到對照菌株、培養基性能檢驗、試劑的標準性和設備性能檢測的作用［23］。我們查詢了標準品信息網（http://www.gbw.org.cn）、國家標準樣品網（http://www.crmch.com）及標物中心網（http://www.gjbwzx.cn），有52 種作物病菌標準品研制成功并投入使用（表3）；其中，真菌標準品研制數量最多，共有46 種，占比88%；細菌和病毒的標準品研制較少，各只有3 種，分別占比6%。例如，水稻細菌性谷枯病是由伯克霍爾德氏菌（Burkholderia glumae）屬引起水稻苗腐、鞘腐以及谷粒腐爛的細菌性病害，該病菌標準品的成功研制，有助于水稻細菌性谷枯病菌檢測工作開展［24］。羅金燕等［25］通過將田間分離出來的病原菌與水稻細菌性谷枯病菌標準品進行生理特性、菌落特性等25 項比較，以確定該田間病菌為水稻細菌性谷枯病菌。小麥赤霉病是由多種鐮刀屬真菌侵染小麥，導致小麥產量減少的病害，小麥赤霉菌標準品的成功研制有助于該病的檢測工作開展［26］。武愛波等［27］利用標準菌株，建立了用于檢測赤霉菌及其毒素的PCR 檢測方法。趙麗紅等［28］利用標準菌株Vd076 建立了鑒定棉花黃萎病抗性品種的qPCR 方法。標準菌株的應用為作物病菌的檢測工作提供了陽性標準品，保證檢測結果的可靠性和溯源性，增加了檢測結果的公信力。

表3 部分作物病菌標準品信息Table 3 Information of selected crop pathogen standards

與標準品相比，有證標準物質（certified reference material,CRM）在檢測工作中能作為量值溯源的依據，可以對檢測結果進行準確定量，使結果更加精確。為此，我們通過國家標準物質資源共享平臺（National Sharing Platform for Reference Materials,China）查詢相關標準物質的研制情況，但未查詢到作物病菌類有證標準物質。生物標準物質可以分為基體標準物質、質粒DNA 標準物質、基因組DNA標準物質及蛋白質標準物質這四種［29］。質粒DNA標準物質是現有的生物標準物質中較為常見的一種，其優勢在于研制成本低，是解決病菌檢測中量值溯源問題的主要方法之一［30］?；蚪MDNA 分子標準物質的運用范圍和質粒DNA 標準物質類似，僅能用于核酸水平上的檢測，其優點在于研制難度較低，可以長期保存，在進行實時熒光定量PCR 時使用起來比較簡便，但其對待測樣品DNA 的質量要求相對要求較高，會受檢測樣品DNA 質量的影響?；w標準物質也是所有標準物質研制中較多的一種標準物質，在其制備過程中，候選物的純度與基體標準物質的準確性直接相關，因此候選物的選擇十分重要［31］。蛋白質標準物質與上述幾種標準物質不同，由于其生物學特性易受環境因素的影響，其制備與標準化生產難度較大，我國暫未有病菌蛋白質標準物質的報道［32］。

在制備流程上，標準物質與標準品的研制流程大體一致，主要包括候選物的制備、均勻性檢驗、穩定性檢驗等，但標準物質的制備要求更高［29-30］。在制備病菌標準物質時，可以根據候選物的特性以及檢測工作的需求，選擇適當的類型。作物病菌標準物質的研制，有利于滿足作物病菌檢測中準確量值的需要，從而及時對感染病菌的作物進行防治。

3 作物病菌標準品面臨的問題與展望

我國是世界上人口數量最多的國家之一，糧食需求量大，為滿足人民日益增長的農產品需求，保證農產品綠色、安全生產極為重要。作物病菌標準品可以在盡早發現作物病菌感染，促使建立更好更快的防治方法方面發揮積極作用，為生產更安全更優質的農產品保駕護航。

在作物病菌檢測工作中，標準品可以作為對照樣品，為結果提供依據，保證結果的可信度，但仍存在以下問題：首先，現有標準品品種和數量較少，無法完全滿足作物病菌檢測中的需求。為此，國家應統籌規劃加大相關項目的啟動、落實和發展，使更多學者投身到病菌標準品的研制中，為作物病菌標準品的研制提供更多機遇［33］。其次，在檢測工作中，標準品的使用無法做到對作物感病情況準確量值。而在分子檢測工作中，標準物質尤其是有證標準物質可以作為定值參照，對檢測結果準確定量［34］。但由于我國標準物質整體的發展時間短，作物病菌標準物質的研制在我國鮮有報道，為此，還需加大力度研制作物病菌的標準物質。同時，在標準物質的研制與應用過程中，也面臨著原材料來源不一與質量不穩定、標準物質制備方式不同導致測量誤差、定值方法復雜且成本較高等問題。針對這個問題，可通過建立聯合實驗室共同制備，或建立實驗室網絡，共享研究方法和成果加以解決［21］?？傮w來說，從國家層面對標準品的規范管理和體系的不斷完善，我國作物病菌標準品和標準物質的研制工作將迎來更快的發展。