前列腺癌中PI3K/AKT通路調控PHF19基因表達的機制研究

明道靖，郭夢夢，張晉輝，劉夢洋，3，史明慧，3，劉姝言，3，袁 帥，曾憲濤，3

1. 河南大學淮河醫院泌尿外科（河南開封 475000）

2. 武漢大學中南醫院循證與轉化醫學中心（武漢 430071）

3. 武漢大學中南醫院泌尿外科（武漢 430071）

前列腺癌是全球男性最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。盡管雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy, ADT)為主的多種治療手段具有較好的治療效果，但絕大多數患者仍不可避免地進展到無法治愈的去勢抵抗性前列腺癌 (castration-resistant prostate cancer, CRPC)，并伴隨復雜分子信號通路的改變，如PI3K/AKT 通路的激活、表觀遺傳重塑等[3-4]。因此，迫切需要找到前列腺癌進展的關鍵作用因子及其相關分子機制。

多梳抑制復合物2（Polycomb repressive complex 2，PRC2）由核心亞基（EZH2、EED、SUZ12 和RBBP4）和不同的附屬亞基組成，其功能失調與癌癥發生發展密切相關[5]。PRC2 在前列腺癌進展中發揮著重要作用，其中zeste 基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）作為PRC2 的核心亞基之一，其表達和活性的增加可促進前列腺癌發生和進展[6-7]。EZH2 功能的發揮在很大程度上依賴于附屬亞基對PRC2 的募集作用，其中附屬亞基PHF19（PHD finger protein 19）在前列腺癌中表達上調，并通過調節PRC2復合體功能介導前列腺癌細胞功能[8]。目前仍不清楚PHF19在前列腺癌中上調的確切調控機制，因此，本研究探索了前列腺癌中PHF19基因表達的調控機制，發現PI3K/AKT 通路通過轉錄因子TP63 調控PHF19基因在前列腺癌中的表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人前列腺癌細胞系PC-3 購自中國科學院細胞庫（中國上海）；F-12K 細胞培養基、0.25%胰酶購自美國Gibico 公司；Eastep? Super 總RNA提取試劑盒購自中國上海Promega 公司；Pierce?瓊脂糖ChIP 試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司；SYBR Green Fast qPCR Mix 購自中國武漢ABclonal 公司；PrimeScript RT 逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；表皮生長因子EGF、PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002 購自美國MCE 公司；qRT-PCR 引物序列由上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

PC-3 細胞在含有10%胎牛血清的F-12K 細胞培養基中培養（37℃、5% CO2），待密度達到80%左右進行傳代、凍存、提取總RNA 等后續實驗。

1.2.2 藥物處理實驗

將PC-3 細胞鋪板至6 孔板內，每孔2×105個細胞；37℃孵育24 h 后，抑制劑處理組給予LY294002（20 μM）處理0、6、12、24、48 h；表皮生長因子處理組給予EGF（100 ng·mL-1）處理0、6、12 h。

1.2.3 ChIP-qPCR實驗

ChIP 實驗采用賽默飛Pierce?瓊脂糖 ChIP試劑盒，并按照說明書相應步驟進行，簡要步驟如下：PC-3 細胞用1%（重量/體積）甲醛固定，隨后用甘氨酸終止交聯。用PBS 洗滌后，將樣品懸浮于細胞裂解緩沖液中，隨后離心，向沉淀中加入染色質裂解緩沖液，再次離心后取上清液，按1 : 9 加入適量1×IP 稀釋緩沖液。加入抗ΔNp63（美國Cell Signaling Technology 公司）抗體，4℃旋轉孵育過夜。隨后將樣品過色譜柱，洗脫并富集DNA。繼續進行qPCR 檢測，引物序列如下：PHF19promoter 上游引物序列為5'-TCAGTCTTAGGGGACGGTGG-3'，下游引物序列為5'-GGACGACCCTAATCATGGCA-3'。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中TP63、ΔNp63、PHF19的mRNA表達

使用Eastep? Super 總RNA 提取試劑盒提取總RNA 并測量RNA 濃度。使用帶有gDNA Eraser 的PrimeScript RT 試劑盒，參照說明書，將1000 ng RNA 逆轉錄為cDNA。 以cDNA 為模版使用SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal公司）進行實時PCR。TP63上游引物序列為5'-CAGGAAGACAGAGTGTGCTGGT-3'，下游引物序列為5'-AATTGGACGGCGGTTCATCCCT-3';ΔNp63上游引物序列為5'-AGCCAGAAGAAAGGAC AGCA-3'，下游引物序列為5'-CAGGTTCGTGT A C T G T G G C T-3';PHF19-L上游引物序列為5'-CGTGAAGATGGTGCTGTCCT-3'，下游引物序列為5'-TGGAACCACTGCCTGCAC-3';PHF19-S上游引物序列為 5'-GCAGACCAGAGACTCCCATCAC-3'，下游引物序列為5'-GAGGCGCTATCTGTCTCCAAAG-3';內參基因GAPDH上游引物序列為 5'-CCATGG AGAAGGCTGGGG-3',下游引物序列為5'-CAAAGTT GTCATGGATGACC-3'。將結果標準化為GAPDH，并使用2^-（ΔΔCt）方法計算相對基因表達。

1.2.5 生物信息學分析

本研究中生物信息學分析數據來自于公共數據庫，主要包括：使用JASPAR 數據庫（http://jaspar.genereg.net/）預測PHF19基因啟動子區域存在的轉錄因子結合位點；使用ChIPBase v3.0數據庫（https://rnasysu.com/chipbase3/index.php）分析可能調節PHF19基因表達的轉錄因子；使用STRING（https://cn.string-db.org/）數據庫探索TP53 及其同源家族轉錄因子TP63 與MDM2 蛋白之間的蛋白相互作用關系；使用GEPIA 2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）工具分析TCGA 前列腺癌數據庫中TP53、TP63與PHF19基因mRNA 的表達相關性。

1.3 統計學分析

使用Pearson 相關系數計算各種基因表達之間的關聯。使用Prism 8.0 軟件完成圖表制作。所有統計分析均使用SPSS 22.0 軟件進行，兩組間比較選用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K/AKT通路調節PHF19基因mRNA表達

為驗證PHF19基因是否受到PI3K/AKT 通路的調節，本研究選用PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002 處理前列腺癌細胞，利用qRT-PCR檢測PHF19mRNA 表達變化情況。結果顯示，在PC-3 細胞系中，使用LY294002 處理后，與處理0 h 組相比，其余時間處理組PHF19-L和PHF19-S的mRNA 水平均顯著下調（圖1-A、圖1-B）。隨后，利用PI3K/AKT 通路激動劑EGF處理PC-3 細胞，發現與處理0 h 組相比，其余時間處理組PHF19-L與PHF19-SmRNA 水平均顯著上調（圖1-C、圖1-D）。提示PI3K/AKT 通路可在轉錄水平調節PHF19基因的表達。

圖1 LY294002、EGF處理后PHF19 mRNA水平變化Figure 1. PHF19 mRNA expression levels after treatment with LY294002 and EGF

2.2 PHF19啟動子區域存在轉錄因子TP53、TP63結合位點

為研究PI3K/AKT 通路在轉錄水平調節PHF19基因mRNA 的潛在機制，本研究利用ChIPBase v3.0 數據庫尋找可能調節PHF19基因表達的轉錄因子，發現PHF19基因啟動子區域存在TP53、TP63 等轉錄因子結合位點（圖2-A）；利用JASPAR 數據庫也預測發現PHF19基因啟動子區域存在轉錄因子TP53、TP63 結合位點（圖2-B、圖2-C）；利用STRING 數據庫分析發現TP53 及其同源家族轉錄因子TP63 均與MDM2 蛋白具有蛋白相互作用關系（圖2-D）。提示轉錄因子TP53、TP63 可能參與了PI3K/AKT 通路對PHF19基因的調控作用。

圖2 轉錄因子TP53、TP63與PHF19基因的潛在調控關系Figure 2. The regulatory effects of transcription factors TP53 and TP63 on the PHF19 gene

2.3 TP63參與調節PHF19基因表達

為了進一步驗證轉錄因子TP53、TP63 是否調節PHF19基因表達，本研究利用GEPIA 2 工具，分析TCGA 前列腺癌數據庫中TP53、TP63與PHF19基因mRNA 的表達相關性。結果顯示，TP63與PHF19的mRNA 表達水平顯著正相關（r=0.43，P＜0.05)；而TP53與PHF19的mRNA 表達水平相關性較弱（r=0.11，P=0.013)（圖3-A、圖3-B）。提示與TP53 相比，TP63更可能參與PHF19基因的轉錄調控。進一步利用ChIP-qPCR 實驗檢測TP63 突變亞型ΔNp63 蛋白在PHF19基因啟動子區域的富集情況。結果顯示ΔNp63 蛋白可結合PHF19啟動子區域的DNA片段（圖3-C）。提示轉錄因子TP63 突變亞型ΔNp63 可結合PHF19基因啟動子，參與PHF19基因的調控作用。

圖3 TP63參與PHF19基因表達調控Figure 3. TP63 is involved in the regulation of PHF19 gene expression

2.4 TP63受到PI3K/AKT通路的調節

為探究TP63是否同樣受到PI3K/AKT 通路的調節，本研究再次利用PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002 處理PC-3 細胞， 進而檢測TP63、ΔNp63mRNA 水平變化情況。qRTPCR 結果顯示，LY294002 處理PC-3 細胞后，與處理0 h 組相比，其余時間處理組TP63以及ΔNp63mRNA 水平均顯著下調（圖4-A、圖4-B）。提示TP63基因mRNA 的表達受到PI3K/AKT 通路的調控。

圖4 LY294002處理PC-3細胞后TP63、ΔNp63 mRNA水平變化Figure 4. TP63 andΔNp63 mRNA expression levels after treatment of LY294002 in PC-3 cells

3 討論

PHF19基因在前列腺癌中表達上調且促進腫瘤增殖，然而其表達上調的具體原因尚不清楚。本研究發現PI3K/AKT 通路可能通過TP63 對PHF19基因的轉錄產生調控作用（圖4-C）。本研究利用ChIP-qPCR 證明了轉錄因子TP63 的突變亞型ΔNp63 可結合PHF19基因啟動子區域的DNA 片段，并通過PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002、表皮生長因子EGF 等處理方式確定了PI3K/AKT 通路對TP63、ΔNp63、PHF19mRNA的調節作用。

PRC2 復合體介導的表觀遺傳調控機制在前列腺癌的發生發展過程中具有重要作用[9]。PRC2是一種多蛋白復合體，其關鍵功能是催化組蛋白H3 第27 位賴氨酸（H3K27）的甲基化，進而抑制基因表達[10]。在前列腺癌細胞中，PHF19 可介導PRC2 復合體在染色質上的募集，發揮表觀遺傳調控作用。PHF19 在多種腫瘤中發揮重要作用[11-12]，包括肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[13]、膠質母細胞瘤（glioblastoma, GBM）[14]和多發性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）[15]。在HCC 中，PHF19 參與調節細胞周期和DNA 復制等過程[13]。在GBM中，PHF19通過SIAH1/β-catenin軸的調節影響GBM 細胞對常用化療藥物多柔比星的化療敏感性[14]。此外，PHF19 還可通過增強PRC2介導的H3K27me3甲基化促進MM的發生[15]。在前列腺癌中，干擾PHF19基因表達可抑制細胞增殖[8]。近期研究也表明，PHF19 在前列腺癌惡性進展（尤其是NEPC 分化亞型）過程中表達上調[16]，然而其表達上調的具體原因仍不清楚。

PI3K/AKT 通路是細胞中重要的信號轉導通路。近年來，有許多研究關注了PI3K/AKT 通路在前列腺癌中的作用，例如PTEN的缺失可以導致PI3K/AKT 通路的持續活化，從而促進癌癥的發生和發展[17]；PI3K/AKT 通路的活化可以促進前列腺癌的侵襲性和遷移能力，促進腫瘤組織內血管生成[18]；同時針對PI3K/AKT 通路的藥物可以有效抑制前列腺癌的生長和侵襲[19]等。因此，PI3K/AKT 通路的異?；罨瘜η傲邢侔┑陌l生、發展和治療具有重要的臨床意義。本研究通過PI3K/AKT 信號通路的抑制劑和激動劑處理前列腺癌細胞發現，PHF19基因的轉錄受到PI3K/ AKT信號通路的正向調控。表明隨著前列腺癌的進展，PI3K/AKT 信號通路持續激活，PHF19基因的表達也隨之增強。

本研究進一步探索了調控PHF19基因轉錄的潛在轉錄因子。以往研究證實，TP53 可受到PI3K/AKT/MDM2 通路的調控[20-21]。本研究通過ChIPBase v3.0 和JASPAR 數據庫，發現PI3K/AKT 信號通路中的TP53 可能是PHF19的轉錄因子，并且其家族成員TP63 也可能對PHF19的轉錄具有調控作用；通過GEPIA 2 數據庫分析發現，TP63與PHF19基因的表達具有較高的正相關性。雙微體同源基因2（mouse double minute 2,MDM2）是PI3K/AKT 信號通路中重要的下游調控因子，在腫瘤中高表達，主要通過負向調控P53腫瘤抑制蛋白，降低其穩定性和活性，從而抑制P53 介導的細胞凋亡和細胞周期阻滯功能，促進腫瘤進展[22-23]。MDM2 同樣與TP63 蛋白具有潛在的相互作用關系，與TP53 蛋白不同得是MDM2通過穩定TP63 蛋白進而增加其轉錄活性[24-25]。本研究發現，抑制PI3K/AKT 信號通路可降低TP63基因的表達水平，提示除了MDM2 穩定TP63 蛋白的調控機制外，PI3K/AKT 也可能通過其他途徑促進TP63基因的表達。推測PI3K/AKT 信號通路對TP63 轉錄因子存在正相調控關系。

TP63 是TP53 轉錄因子家族的成員，位于人類染色體3 的長臂（3q27-29）。TP63基因主要在上皮組織中表達，可維持組織的發育、分化、形態發生等功能[26]。同時，研究還發現TP63基因的突變或異常表達可能與前列腺癌的發生發展有關[27]。TP63基因產生的蛋白質具有多個亞型，其中兩種主要亞型分別為具有反式激活區的TAp63 和缺乏N 末端反式激活結構域的ΔNp63[28]。TAp63 主要參與細胞凋亡的調控，而ΔNp63 則在細胞增殖和上皮細胞分化中發揮作用。這兩個亞型的平衡和相互作用對于維持正常的生物學功能至關重要。在前列腺癌中，文獻報道TP63 主要存在于正常前列腺組織以及其他基底細胞癌癥組織中[29]，TP63 突變亞型ΔNp63 蛋白僅在骨轉移前列腺癌細胞PC-3亞群中高表達，并促進前列腺癌的進展[29-30]。值得注意的是，近期一項研究提出，神經內分泌前列腺癌細胞來源于表達p63 的基底細胞，而不是來源于小鼠原有的腺癌細胞[31]。此外，有研究發現表達TP63 的前列腺基底細胞，能夠分化成腔上皮、神經內分泌和基底細胞，并且該類型細胞在β-catenin 穩定表達的情況下，具有啟動腫瘤形成的能力[32]。以上研究表明TP63 在前列腺癌（尤其是NEPC 分化亞型）惡性進展過程中發揮重要作用。本研究發現TP63 突變亞型ΔNp63 可結合PHF19基因啟動子，且TP63 的表達受到PI3K/AKT 信號通路的正向調節。因此，前列腺癌中PI3K/AKT 通路可能通過轉錄因子TP63 對PHF19基因的表達產生調節作用。

本研究也存在一定局限性。例如，在藥物處理實驗中，參考其他研究只選用了單一藥物濃度進行處理，未選用不同的藥物濃度梯度。后續研究中將針對這一問題開展深入的探索。

綜上所述，本研究發現PHF19基因的轉錄受到PI3K/AKT 通路的調節，此外轉錄因子TP63 可能部分介導了PI3K/AKT 通路對PHF19基因的調控作用，研究有望揭示前列腺癌中基因表達調控的新機制，并為前列腺癌的靶向治療提供新思路。