Toll樣受體在鈣化性主動脈瓣疾病中的研究進展

任一鳴，張晉輝，王聰聰，王天堃，任學群，周建良

1. 河南大學淮河醫院普外科（河南開封 475000）

2. 武漢大學中南醫院心血管外科（武漢 430071）

3. 武漢大學中南醫院循證與轉化醫學中心（武漢 430071）

心臟瓣膜病是最常見的心血管疾病之一，風濕性心臟病和老年退行性心臟瓣膜病是最常見的后天性發病因素。在過去20 年中，風濕性心臟病的死亡率保持穩定，而鈣化性主動脈瓣狹窄的死亡率逐步上升[1]。鈣化性主動脈瓣疾?。╟alcified aortic valve disease, CAVD）是指從主動脈瓣增厚和鈣化而無血流動力學的變化，到主動脈瓣狹窄而引起左室流出道梗阻的一系列變化過程。臨床現階段唯一的治療手段仍是主動脈瓣置換術，依然缺乏可以阻止或延緩CAVD 進展的藥物[2-3]，因此，探明CAVD 的發生發展機制，尋找藥物治療靶點是該領域亟待解決的重點問題。

既往研究認為CAVD 是一個與衰老相關的、被動的、退行性的過程。而隨著近年來研究發現，CAVD 實際是一個主動的、多因素參與的、可積極調節的生物學過程[4-5]，類似于血管動脈粥樣硬化，涉及內皮功能活動障礙、炎癥反應、脂質浸潤、細胞外基質重塑和成骨分化等過程[6-7]。越來越多的證據表明，炎癥反應是CAVD 的重要環節，不僅參與CAVD 的起始步驟，還通過調節骨形成相關的信號通路促進鈣化形成[8]，其中Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的功能尤為重要。TLRs 是免疫模式識別受體家族成員之一，可以通過識別外源性病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和內源細胞損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs)來激活一系列先天免疫反應[9]。本文就近年來TLRs 在CAVD 的機制進行綜述，旨在為CAVD進一步的研究和治療提供科學依據。

1 Toll樣受體概述

1.1 Toll樣受體的結構、適配器和配體

TLRs 是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由細胞外區、跨膜區和細胞質區3 個部分組成。TLRs 的細胞外區通過觸發先天免疫反應在細胞外病原體攻擊和組織損傷過程中起著關鍵作用；跨膜區決定了TLRs的亞細胞定位[10]；TLRs 的細胞質區域被稱為Toll/IL-1 受體(Toll/interleukin receptor，TIR)結構域，它在信號轉導過程中特異性地募集下游接頭[11]。最近的研究報道了5 種含有TIR 結構域的適配器，分別為髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、誘導IFN-β 的含TIR 結構域的轉接蛋白（TIR domain-containing adaptorinducing IFN-β，TRIF）、MyD88- 轉接體樣/TIR-相關蛋白（MyD88 adaptor-like/TIR associated protein，MAL/TIRAP）、Toll 受體相關分子（Toll receptor associated molecule，TRAM）以及SARM（sterile-α and HEAT/Armadillo motifs）[12]。

病原體釋放的抗原被稱為PAMP，主要包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、 肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）、雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）等[13]。根據其細胞位置和特定配體，識別PAMP 的TLRs 可分為兩類[14]。其中一種表達于細胞表面，識別微生物的膜成分（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和TLR11）；另一種在細胞內囊泡上表達并識別微生物核酸（TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9）[15]。DAMPs 是從受損或垂死的細胞中產生釋放的各種細胞內分子，主要包含HMGB-1、三磷酸腺苷（ATP）、線粒體DNA 和RNA 等[16]。DAMPs 通過直接促進炎癥介質的釋放，調節先天性和獲得性免疫的發展方向，影響嚴重反應的發展，誘導免疫細胞向炎癥部位遷移，增加炎癥細胞黏附和浸潤能力來調節炎癥反應[17]。

1.2 Toll樣受體的信號通路

TLRs 介導的信號通路錯綜復雜。目前，TLRs 有兩條主要的信號通路，即MyD88 依賴性通路和TRIF 依賴性通路，啟動免疫反應最常見的信號通路是MyD88 依賴性通路[18]。

除TLR3 以外的所有TLRs 都可以通過MyD88依賴性信號通路引發免疫反應。TLRs 和MyD88的結合刺激了IRAK 家族成員（IRAK1、IRAK2、IRAK4 等）的招募，其中IRAK4 是極其重要的。IRAK4 是一種促進IRAK1 磷酸化的激酶，在下游信號轉導中募集磷酸化的IRAK1 和TRAF6[19]。TRAF6 與適配器形成復合物，通過MAPK 激酶激酶（MAP3K）通路激活TAK1，導致I-κB 激酶（IKK）復合物和P38 磷酸化，激活NF-κB 通路，從而誘導IL-1β 和TNF-α等炎癥因子的表達[20]。

TLR3 和TLR4 可以通過TRIF 依賴性通路調節信號轉導，TLR3 可直接連接到TRIF，而TLR4通過TRAM 連接到TRIF。TRIF 激活TANK 結合激酶1（TBK1）后，IRF3 被激活，之后轉移到細胞核中，并調節IFN-β 的合成。同樣，TRIF 依賴性通路也可以通過激活TRAF6 向NF-кB 通路的轉化來誘導炎癥[21]。

2 鈣化性主動脈瓣疾病的病理生理學概述

主動脈瓣是一個半月狀結構，在促進血液從左心室到主動脈的單向流動中發揮重要作用。主動脈瓣的組織結構通常分為纖維層、海綿層和心室層。纖維層和心室層是最外層，分別面向主動脈和左心室。纖維層主要含有膠原纖維，而心室層具有高含量的彈性纖維，并且由主動脈瓣膜間質細胞（aortic valve interstitial cell，AVIC）填充。中心海綿層的糖胺聚糖含量較高，在主動脈瓣的生物力學特性中發揮重要作用，在心動周期期間吸收部分機械負荷[22]。主動脈瓣被瓣膜內皮細胞（valve endothelial cell，VEC）覆蓋，研究表明主動脈瓣和血管內皮具有不同的生物學特性，這可能會影響CAVD 的發展[23]。

對從手術中獲得的人鈣化主動脈瓣進行微觀分析，結果揭示了CAVD 的一些重要關鍵特征。首先，脂質滲透到礦化區附近的瓣膜組織中；其次，在一些瓣膜中存在致密的炎性浸潤，并觀察到氧化脂質和微鈣化[24]；最后，在約15%的微鈣化中觀察到成骨化生。Coté 等研究發現在285個鈣化主動脈瓣中，28%的瓣膜存在致密的慢性炎性浸潤，且與骨化生、新血管形成和更高水平的組織重塑相關[25]。此外，鈣化主動脈瓣中炎性細胞密度與主動脈瓣狹窄進展速度加快相關，故CAVD 的發生發展過程與炎癥可能有重要關系。

3 Toll樣受體在鈣化性主動脈瓣疾病中的作用機制

自1997 年起，陸續有研究在主動脈瓣狹窄的瓣葉上檢測到了肺炎衣原體和與慢性牙周感染相關的細菌等病原微生物[26-28]。Cohen 等研究發現，在復發性低度心內膜炎的家兔模型中接種口腔細菌可導致主動脈瓣鈣化[29]。然而，內皮損傷后短暫的菌血癥導致細胞因子反應的潛在致病機制仍未被探明。

先天性受體被認為是病原體衍生分子、炎癥和CAVD 之間的分子樞紐[30]。TLRs 是進化上保守的模式識別受體，是先天免疫和炎癥之間的重要中介。在主動脈瓣中，TLRs 不僅存在于浸潤免疫細胞中，而且存在于固有細胞中，其中TLR4是最豐富的亞型[31]。近年來CAVD 與TLRs 相關的通路機制進展見圖1。

圖1 Toll樣受體在鈣化性主動脈瓣疾病中作用機制圖Figure 1. Mechanism diagram of Toll-like receptors in CAVD

3.1 TLR2在鈣化性主動脈瓣疾病中的作用

最先被發現在主動脈瓣組織和AVIC 中表達的TLRs 家族成員是TLR4 和TLR2，它們在鈣化的瓣膜中上調[31]。此外，與肺動脈瓣、二尖瓣或三尖瓣相比，主動脈瓣組織和AVIC 中表達更多的TLR4 和TLR2 且對其激動劑的促炎促成骨反應更大[32-33]。

TLR2 可以與外源性配體如PGN、脂蛋白等與PAMPs 結合,激發炎癥反應，因此實驗中常用PGN 和Pam3CSK4 等為TLR2 激動劑。TLR2 和TLR4 經常共同作為研究對象并通過適配器MyD88和NF-κB 通路介導它們的作用[31,34-35]。Song 等在研究中發現雙糖鏈蛋白聚糖（biglycan，BGN）通過TLR2 和TLR4 誘導人AVIC 中細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達，并需要激活ERK1/2 通路，但TLR2 的敲低和對炎癥反應的抑制作用比TLR4 阻斷和敲低更明顯[36]。Lee 等發現IL-1 受體拮抗劑能減少TLR2 刺激下AVIC 中骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）的產生，而在TLR4 的刺激下未發生此作用[37]，表明IL-1受體拮抗劑只針對TLR2 發揮抗炎作用（圖1）。這些研究都突出了TLR2 在CAVD 中發揮重要作用，且在某些方面的作用甚至比TLR4 更為重要。Rabkin 等的研究表明在AVIC 中炎癥因子通過TLR2 作用使p38 MAPK 去磷酸化而對主動脈瓣產生影響，并排除了其通過血管緊張素Ⅱ或過氧亞硝酸鹽的介導作用[38]（圖1）。單核細胞浸潤和主動脈瓣中單核細胞/巨噬細胞積聚是進行性CAVD 的特征[39]。Zhang 等將低濃度TLR2 激活劑Pam3CSK4 加入AVIC 和單核細胞共培養體系中，發現僅在使用Pam3CSK4 刺激單核細胞后的上清液培養或與其共培養時，AVIC 產生的ICAM-1和血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）顯著增加，且腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平也明顯升高；AVIC 中TLR2 的抑制或敲低顯著降低了Pam3CSK4 刺激單核細胞誘導的ICAM-1 和VCAM-1 的表達，中和TNF-α也能顯示同樣作用，表明單核細胞通過旁分泌上調TLR2 水平來增強AVIC 的炎癥反應[40]（圖1）。

3.2 TLR3在鈣化性主動脈瓣疾病中的作用

TLR3 配體dsRNA 存在于病毒中，也可以在正鏈RNA 病毒、dsRNA 病毒和DNA 病毒的復制下產生，內源性來源可能是組織損傷或壞死[41]。López 等人使用poly（I：C）模擬dsRNA 效應，首次報道了TLR3 介導的人AVIC 的鈣化[35]。Zhan 等證實了dsRNA 介導的炎癥介質和促成骨活性的上調，并通過基因沉默和中和抗體進一步證明了非經典途徑TLR3-TRIF 以及NF-κB 通路和ERK 通路的參與[34,42]。Parra-Izquierdo 等還發現了JAK/STAT 信號轉導介導dsRNA 觸發主動脈瓣的炎癥、細胞凋亡和鈣化，以及I 型IFN 也激活了AVIC 中的STAT1 和NF-κB 通路，而使用JAK 抑制劑魯索替尼或Ⅰ型干擾素受體阻斷抗體可以阻止這種情況的發生[43]（圖1）。Gollmann-Tepek?ylü 等以APOE 缺陷小鼠和特異性斑馬魚為研究模型，通過體內實驗驗證了BGN-TLR3-IFNAR1 軸在CAVD 中的作用，并通過兩個大規模隊列研究證實了CAVD 與BGN-TLR3-IFN 通路相關基因遺傳變異的相關性[44]。TLRs 在CAVD中的體外研究大部分都聚焦于AVIC 上，而Niepmann 等的研究也關注了VEC 在CAVD 中發生的變化，研究發現與正常小鼠相比，TLR3基因敲除小鼠在鋼絲損傷主動脈瓣后的鈣化發生率顯著降低，證實了內源性TLR3 配體在主動脈瓣狹窄病理學中的作用，還觀察到TLR3 的激活也會損傷小鼠的內皮功能。TLR3 抑制劑C4a 不僅阻止了AVICs 中炎性細胞因子和成骨標志物的上調，以及VECs 中內皮間充質轉化的上調，而且在體內顯著消除了主動脈瓣狹窄的發生[45]（圖1）。

3.3 TLR4在鈣化性主動脈瓣疾病中的作用

TLR4 是AVIC 中表達最高的TLRs[35]。研究發現成人比兒童AVIC 對TLR4 刺激表現出更強的炎癥和成骨反應[46]。多研究表明TLR4 通路在CAVD 的發病機制中起促進作用，減少TLR4 的表達可以逆轉AS 的進展[36,47]。Deng 等猜測TLR4介導作用在兒童中由于涉及STAT3 激活的保護機制而被阻止，但在成人中不存在這種保護機制[46]。后續研究發現TLR4 的外源性刺激劑LPS 可以促進AVIC 成骨標志物的表達，雷帕霉素可以通過上調STAT3 的表達而抑制這種反應[48]（圖1）。Parra 等也發現LPS 和IFN 聯合缺氧誘導因子1α（HIF-1α）時，STAT-1 也發揮重要作用[49]。這些研究均表明STAT 相關通路在CAVD 發展過程中的重要作用。Yao 等發現LPS 可以誘導TLR4 依賴性NT3 的產生，這種作用通過抑制Akt 和ERK1/2 通路而被消除[50]，Jarrett 等也證實了LPS 刺激AVIC纖維化依賴Wnt 信號通路的介導[51]（圖1）。

還有研究描述了與CAVD 發病機制相關的幾種DAMP，它們都能通過TLR4 介導其作用。BGN 是一種廣泛分布于組織中的小分子蛋白聚糖，在病理條件下大量產生，在CAVD 中也大量表達[52]?？扇苄訠GN 通過TLR2 和TLR4 誘導脂質修飾酶和細胞因子表達，在AVIC 中通過TLRs途徑充當促炎誘導劑[52-53]。Song 等研究發現BGN介導AVIC 成骨分化,以BMP-2 和轉化生長因子-β1（TGF-β1）為分子介質,其中以TLR4依賴性方式上調TGF-β1，而TLR2 作用較小[53]。HMGB1 是一種調節性核蛋白，當分泌到細胞外時，其充當促炎細胞因子[54]。目前已在CAVD 患者體內和動物模型中發現了HMGB1，且其水平在CAVD 患者組織和血漿中增加[55]，并且可以在從患病瓣膜中分離的內皮細胞和間質細胞的分泌顆粒中檢測到[56]。Wang 等還證明重組HMGB1通過增加人AVIC 中的成骨標志物和鈣沉積而具有促成骨活性[57]。此外，Shen 等的研究使TLR4及其通路NF-κB 和JNK 的作用在體外和體內得到驗證，沉默或TLR4 缺陷可使HMGB1 促成骨活性顯著降低[58]。Matrilin-2 是一種可在不同組織中表達的細胞外蛋白，在人主動脈瓣的鈣化結節中積累[59]。Matrilin-2 通過AVIC 中的TLR2/4增強成骨活性，且需要NF-κB 轉錄因子家族及NFATc1 的調節[60]。

3.4 TLR7在鈣化性主動脈瓣疾病中的作用

TLR7 屬于細胞內Toll 樣受體組，位于內溶酶體中[61]。到目前為止，已鑒定出的TLR7 配體是ssRNA 和咪唑喹啉衍生物。TLR7 是TLRs 中表達最低的TLR 之一[62]。Karadimou 等發現主動脈瓣組織中TLR7 與M2 巨噬細胞標志物mRNA 有相關性，TLR7 也與主動脈瓣中的M2 型巨噬細胞亞群共定位，用TLR7 配體刺激體外瓣膜組織導致免疫調節細胞因子IL-10 的分泌，但提取原代巨噬細胞和AVIC 后再用TLR7 配體分別刺激后發現僅有巨噬細胞的上清液中IL-10 的釋放量增加，而AVIC 中未檢測到反應，都表明主動脈瓣中M2 巨噬細胞亞群TLR7 的激活與減輕主動脈瓣炎癥可能相關[63]（圖1）。

4 結語

綜上，TLRs 與CAVD 的病程密切相關，其作用機制主要與通過MyD88 依賴信號通路以及TRIF 依賴性信號通路誘導炎癥反應引起炎癥因子、基質膠質纖維蛋白的增加、AVIC 成骨分化、單核細胞的促進協同等作用有關。然而研究使用PAMP 作為TLRs 激動劑時并未檢測到主動脈瓣中是否有相應的病原體及其衍生物定植，未來可由此方面開展深入研究。牙周炎相關病原體是最早在主動脈瓣中被檢測到的病原體之一[27]，近些年越來越多的研究在心臟瓣膜樣本中發現了不同種類的口腔細菌[64-66]，但目前僅在家兔模型中驗證過口腔細菌的接種可導致主動脈瓣鈣化。Neculae等人在綜述中假設了口腔生態失調與心臟瓣膜病的潛在聯系，提及其可能涉及TLRs 相關通路[67]，但仍需相關實驗在組織、細胞、動物和類器官模型等層面上進行驗證與探索。

另外，由于TLRs 分型較多，仍有部分TLRs的功能未被揭示，未來的研究也需繼續聚焦于多種TLRs 功能的相互作用。隨著研究的不斷深入，對CAVD 發生發展的作用認識也將逐步完善，通過干預、調節TLRs 的表達有望成為CAVD 防治新手段之一。但靶向這一途徑的主要挑戰將是最大限度地減少有害的先天免疫反應，同時保留適當的先天免疫防御機制。