基于代謝組學分析生草櫻桃果園土壤特異代謝物

趙柏霞，閆建芳，肖 敏，鄭 瑋，李俞濤，夏國芳，張立恒，潘鳳榮

（1.大連市農業科學研究院, 遼寧 大連 116036；2.大連民族大學, 遼寧 大連 116600）

我國傳統的果園地面管理是以清耕為主，但是長期清耕會導致果園土壤肥力下降、破壞土壤團粒結構以及降低土壤微生物多樣性等一系列問題[1-2]。土壤質量是果樹生長的基礎，對果樹養分的吸收、果樹產量以及果實品質都起著至關重要的作用[3]。果園生草是一項現代化果園土壤管理技術，早在19 世紀西方發達國家就開始了果園生草栽培。近些年，果園生草覆蓋管理模式已經在全世界范圍內得到了廣泛的應用[4]。我國果園生草栽培起步較晚，20 世紀60 年代開始有零星報道，80、90 年代才開始推行[5-6]，目前的普及率很低[7-8]。

目前，已經報道的果園生草的研究主要集中在對土壤結構、土壤理化性質、養分改善、果實品質以及土壤微生物等方面的影響。果園生草對土壤的影響主要表現為改良土壤pH，提高土壤養分、含水量，增加土壤酶的活性，調節土壤溫度，改變土壤微生物群落等[9-17]。除此之外，果園生草還會對果實產量、外觀品質、口感以及風味等產生影響，可以提高果實的商品率[18-20]。李會科等[12]對蘋果(Malus pumila)園生草區0－60 cm 土層土壤養分進行了測定，表明生草會提高土壤的有機質含量。潘介春等[7]研究發現套種不同草種可以提高土壤中微生物數量，以及β-葡萄糖苷酶、氨肽酶和磷酸二脂酶活性。張朋朋等[19]以庫爾勒香梨(Pyrus sinkiangensis)為試材，研究發現不同生草種植年限對果形、單果質量、果實帶皮硬度以及可溶性固形物都有一定程度的提高，相關性分析發現種植生草3 年以上對果實品質改善最佳。

鼠茅草(Vulpia myuros)是一種耐嚴寒，不耐高溫的禾本科越年生草本植物，播種后當年10 月萌發，翌年6 月死亡，被廣泛用于北方果園覆蓋和果園雜草抑制。有研究表明，鼠茅草可以改善土壤理化性質、抑制雜草、提高果實品質[21-22]。甜櫻桃品種選育及栽培技術研究課題組前期研究發現，在甜櫻桃(Prunus avium)果園行間種植鼠茅草可以提高土壤有機質、氮磷鉀含量，并提高了土壤微生物的多樣性和豐富度[23]。

當前，有關生草果園土壤代謝物差異研究報道較少，尚未見深入分析研究。因此，在前期研究基礎上，本研究以櫻桃果園行間種植鼠茅草和清耕處理為研究對象，測定土壤代謝物方面的差異，并從中篩選出差異代謝物，進而研究其對土壤微生態的影響機理。本研究結果不僅可以揭示鼠茅草覆蓋管理對櫻桃園的影響，而且可以為櫻桃園的科學管理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在大連市農科院櫻桃園(121.42° E，38.99° N)，果園土壤為砂壤土。

1.2 試驗設計

2018 年9 月開始播種試驗，采取果樹行間種草，條播種植。櫻桃樹樹齡7 年，株行距為3.0 m ×4.0 m，試驗設置行間種植鼠茅草(S)和行間清耕(Q)兩個處理，每個處理小區面積為100 m2，每個處理設5 次重復，隨機區組設計。清耕處理小區每年鋤草4～5 次，除此之外，生草處理和清耕對照的地塊管理措施一致，常規田間管理。

1.3 根際土壤樣品采集

2021 年9 月，按五點取樣法采集樣品。采樣時首先清除樹盤周圍的凋落物和表層土后，選擇根系分布較密集的5－15 cm 土層，采用抖落法將附著在根系上的土壤輕輕轉入50 mL 滅菌離心管內，帶回實驗室，將每個處理的土樣充分混勻、去除根系等雜質后-80 ℃保存備用。

1.4 土壤代謝物的提取

土壤樣品中代謝物的提取方法參考文獻[24]。

1.5 UHPLC-QTOF-MS 檢測

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UHPLC-QTOF-MS)對樣品進行檢測。分析儀器和質譜條件均參考文獻[24]。

1.6 數據處理

數據經過處理后進行后續分析。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和Spearman相關分析判斷組內樣品和質量控制樣品的重復性。在KEGG、HMDB 和Lipidmaps 數據庫中檢索鑒定出的化合物的分類和通路信息。根據分組信息，計算并比較差異倍數，采用T檢驗計算各化合物的差異顯著性P值。采用R 語言包ropls 進行OPLS-DA分析，并進行200 次置換檢驗來驗證模型的可靠性。采用多重交叉驗證法計算模型的重要度值(VIP)。采用OPLS-DA 模型的差異倍數(FC)與P值、變量投影重要度值(VIP)相結合的方法篩選差異代產物。篩選FC＞ 1、P＜ 0.05 和VIP＞ 1 的代謝物。采用超幾何分布檢驗計算KEGG 途徑富集顯著性差異代謝物。

2 結果

2.1 土壤樣品主成分分析

采用PCA 法對供試的10 個樣品進行降維統計分析，生草組(S)和對照組(Q)樣本代謝物在第1 主成分發生明顯分離，存在明顯差異(圖1A)；組內樣本聚集，各個散點區分成兩組，組間差異明顯，說明對兩組樣本的數據處理是可信的，但S 組內S1樣品與其他樣品有一定的偏離。因此，PCA 結果能夠從總體上反映出兩組樣品之間的代謝物差異。

圖1 PCA 得分圖(A)、OPLS-DA 得分圖(B)和 OPLS-DA 模型的置換檢驗(C)Figure 1 Principal component analysis (PCA) score plots (A), orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) score plots (B), and permutation test of OPLS-DA model (C)

相對于PCA，OPLS-DA 分析可以更大限度展示組間差異(圖1B)。圖中橫坐標表示預測主成分，因此橫坐標方向可以看出組間的差距，S 組和Q 組樣本沿橫坐標明顯被區分開，組間樣本比PCA 圖更分散；縱坐標表示正交主成分，通過縱坐標方向可以看出組內的差距，表明了組內樣品具有一定的差異。OPLS-DA 模型參數中R2X = 0.736，R2Y = 1.000，Q2Y = 0.947，說明這個模型為一個出色的模型，樣本數據真實可靠。

為了進一步檢查OPLS-DA 模型的可靠性，進行了置換驗證(圖1C)，圖中橫軸表示置換保留度，縱軸表示R2Y 或者Q2 的取值，兩條虛線分別表示R2Y 和Q2 的回歸線。R2Y 和Q2 均小于原始模型的R2Y 和Q2，即圖左邊(置換檢驗)所有點都比橫坐標為1 處的點(原模型)的位置低，而且回歸線與縱軸的截距小于0，說明該模型有意義，可以用來進行后續分析使用。

2.2 組間土壤差異代謝物的篩選

供試樣品中共檢測出441 種代謝物，其中405 種為兩組共有，S 組樣品檢測出427 種，Q 組樣品檢測出419 種。根據京都基因和基因組百科全書(KEGG)，共鑒定出命名的代謝物69 種，其中脂類和類脂分子23 種、有機酸及其衍生物16 種、有機雜環化合物7 種、苯環型化合物7 種、含氮雜環化合物6 種、苯丙烷和多酮4 種、有機氧化合物4 種、含氮雜環化合物1 種、烴類1 種。在這些化合物中，脂類和類脂分子數量最多，占代謝物總數的33.33%，其次是有機酸及其衍生物占代謝物總數的23.19%。

對篩選到的441 個代謝物繪制火山圖(圖2)。圖中每個點代表一個代謝物，散點越大代表VIP 值越大，篩選得到的差異表達代謝物越可靠。為了進一步確定生草處理和對照土壤中代謝物的差異，采用OPLS-DA 方法，以FC ＞ 2 或FC ＜ 0.5，P＜ 0.01，VIP ＞ 1 相結合為篩選標準，對兩組樣品進行分析。兩組土壤樣品篩選得到差異代謝物203 種(P＜0.01)，占共有代謝物的50.12%，其中上調2 個，下調201 個。這些差異代謝物主要包括脂肪酸及其衍生物、胺類、萜類、吲哚及衍生物、氨基酸及其衍生物、固醇類及其他物質。

2.3 代謝物通路及分類注釋

為了進一步了解生草對櫻桃果園土壤中代謝物的效應，探究代謝物變化機制，將篩選出的差異代謝物進行KEGG 通路富集分析，結果顯示，共涉及7 個通路，分別為細胞進程、環境信息處理、藥物發展、人類疾病、遺傳信息處理、新陳代謝、有機體。其中新陳代謝通路所包含的通路最多，主要包含植物次生代謝產物的生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、氨基酸的生物合成、芳香族化合物的降解、植物激素的生物合成等。

其中有34 種差異代謝物富集到了20 條代謝通路當中，包括色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解、不飽和脂肪酸的生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝等。其中顯著富集(P＜ 0.05)到色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路之中(圖3)。通過表1 可以看出，這3 個代謝通路中共有13 個差異代謝物顯著下調(P＜ 0.05)。其中5 種代謝物富集到色氨酸代謝通路中，分別為色氨醇、6-羥基褪黑素、5-甲氧基色胺、吲哚、L-色氨酸，均為吲哚及其衍生物類。4 種代謝物富集到脂肪酸生物合成通路中，分別為辛酸、癸酸、二乙醇胺、棕櫚酸。苯乙烯、鄰苯二甲酸、1-萘甲醇、2-甲基萘4 種代謝物富集到芳香族化合物的降解通路(表1)。其中，在脂肪酸代謝通路中的棕櫚酸是一種飽和高級脂肪酸，比對照下調了87.1%。鄰苯二甲酸是一種芳香族化合物，富集到脂肪酸生物合成通路和多環芳烴降解通路中，比對照相比下調了69.3%。

表1 KEGG 通路富集詳情表Table 1 KEGG pathway enrichment, indicating the number and types of metabolites

3 討論與結論

果園生草可以改變土壤的理化性質、微生物種群以及果實品質。Ma 等[25]研究發現，在榛子(Corylus heterophylla)園中，覆蓋鼠茅草后顯著提高了土壤氮磷鉀含量，提高了酶活性，并顯著改變了土壤真菌、細菌結構，提高了共生細菌的種類，降低了病原菌種類。Li 等[26]研究發現，在蘋果園中間作甘草(Glycyrrhiza uralensis)后提高了土壤微生物種類，并篩選到了54 種代謝物，這些代謝物涉及到多種代謝通路。本研究結果與前期的研究結果基本相一致，即果園行間種植鼠茅草后，對土壤中的生物組成和代謝特征都產生了影響。

究其原因，一方面鼠茅草通過本身根系系統來改變土壤結構，另一方面主要是通過根系分泌物質以及根系本身新陳代謝等方式為土壤微生物和生物的活動提供充分的營養來源，而微生物的變化，加快了底物的高效利用和分解，增加了土壤養分，最終可以促進植物生長和提高果實品質。也就是說行間生草可以通過調節微生物的多樣性和穩定性來改善土壤營養循環，達到了促進植物生長的效果。

本研究發現，與清耕對照相比，差異代謝物顯著富集到色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路之中。富集到這些通路中的代謝物大多數和植物生長沒有直接的關系。富集到芳香族化合物降解通路中的差異代謝產物鄰苯二甲酸在生草處理中有較大幅度的下調。鄰苯二甲酸是玉米(Zea mays)秸稈腐解后產生的一種典型的酚酸類化感物質[27-28]，是多種作物的自毒物質，對各種作物的種子萌發和幼苗生長具有普遍的抑制作用，是作物生長的障礙因子之一。宋慧等[29]研究發現，一定濃度的鄰苯二甲酸處理小豆(Vigna angularis)，會抑制小豆根系的生長從而導致小豆產量降低。楊延杰和林多[30]研究發現，鄰苯二甲酸不利于黃瓜(Cucumis sativus)種子萌發及幼苗根系生長發育；而對蘿卜(Raphanus sativus)種子萌發及幼苗根系生長的化感效應表現為“低促高抑”[31]。蘇文楨等[31]研究發現鄰苯二甲酸對辣椒(Capsicum annuum)種子活力和胚根生長的影響也是“低促高抑”。此外，鄰苯二甲酸同樣可以影響燕麥(Avena nuda)根系和幼芽的生長[32]。目前尚未見關于櫻桃自毒物質的相關研究報道，根據以上文獻，推測一定量的鄰苯二甲酸會抑制櫻桃砧木根系的生長，進而影響櫻桃樹體、果實的生長。而關于鄰苯二甲酸對櫻桃砧木種子萌發和生長的效應需要后續試驗進行驗證。櫻桃果園生草對土壤中代謝物的影響機制是比較復雜的，而這些代謝物影響櫻桃根系的效應也是復雜的，差異代謝物的協同、抑制作用也不能被忽視，因此檢測一種或者幾種差異代謝物對櫻桃不同種類砧木生長的影響，對更深入解釋果園生草對櫻桃根際土壤微環境的影響有著重要的意義。

而櫻桃果園內生草處理后降低了土壤中鄰苯二甲酸的含量，究其原因可能是，生草植物的根系與土壤接觸后，既影響了土壤物理結構，又通過根系分泌物影響了土壤化學性質和生物活動，進而改變了土壤的微環境，降低了鄰苯二甲酸的積累。目前，在櫻桃種植中也存在著嚴重的連作障礙，而櫻桃的自毒物質研究較少，本研究的結果為櫻桃自毒物質的研究亦提供了一個研究方向，生草降低了土壤中鄰苯二甲酸的含量，在一定程度也會減輕連作障礙，對櫻桃產業的發展也起到了重要的指導作用。

綜上，本研究分析了遼寧省大連市櫻桃果園行間種植鼠茅草和清耕種植兩種地面管理方式土壤中代謝物的差異，并進一步篩選了生草種植后土壤中的特異代謝物。結果發現，與清耕對照相比，櫻桃果園生草種植3 年后，土壤中的代謝物發生了明顯的變化，生草后土壤代謝物種類有所增加。篩選的差異代謝物主要包括脂類、氨基酸、有機酸、脂肪酸、糖類等。其中13 個差異代謝物顯著下調，分別富集到色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路中。其中色氨酸代謝中的鄰苯二甲酸下調顯著，推測與甜櫻桃根系自毒物質有關，需要進一步試驗驗證。本研究的結果為櫻桃果園生草種植模式影響果園土壤微生態提供理論依據，并為甜櫻桃生產中連作障礙的研究提供一定的參考。