不同方法檢測食品中大腸埃希氏菌O 157:H 7/HM能力驗證結果比較與分析

燕 妮，段 鵬，楊雅珺

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730300）

大腸埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）是一種能分泌志賀毒素的水和食源性人畜共患病原體，一旦感染會引起出血性腹瀉，嚴重者可發展為出血性結腸炎和出血性尿毒綜合征（HUS）[1-2]。美國和日本等國家均發生過由大腸埃希氏菌O157∶H7引起的不同規模的流行，我國江蘇、安徽等地也曾發生過大腸埃希氏菌O157∶H7引起的食物中毒事件，該病已成為世界性的重要公共衛生問題之一[3]。大腸埃希氏菌O157∶H7 的感染主要是由于食用被污染的家畜、家禽的肉類、奶類及蔬菜、水果及水源等引起，因而要大力加強對這類產品的監測，提升大腸埃希氏菌O157∶H7 的檢驗檢測能力，防患于未然。我國陸續發布的《食品安全國家標準食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[4]、《食品安全國家標準散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[5]等國家標準明確規定不得檢出大腸埃希氏菌O157∶H7。

能力驗證是一種常見的實驗室間比對的外部質控手段，實驗室通過定期參加能力驗證，能有效提高實驗室技術操作能力和分析鑒定能力，找出差距并加以改進，從而提高實驗室自身的檢驗檢測能力，提供外部質控考核結果，對全面提升食品檢驗檢測實驗室的技術水平、保障食品安全具有重要意義[6-7]。筆者單位參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的食品中大腸埃希氏菌O157∶H7檢測能力驗證項目，旨在提升對食品中大腸埃希氏菌O157∶H7 的檢驗檢測能力。本次實驗分別應用國家標準《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》（GB 4789.36—2016）第一法[8]和實時熒光PCR 方法對樣品進行檢測，為大腸埃希氏菌O157∶H7的日常檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品23-F568 和23-G520，由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心發放；陽性對照菌株∶大腸埃希氏菌（ATCC 25922），Microbiologics；陰性對照菌株∶大腸埃希氏菌O157∶H7（NCTC 12900），廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心；0.8%生理鹽水，實驗室自制；改良EC 肉湯（mEC+n）、大腸埃希氏菌O157顯色培養基、改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）、營養瓊脂、革蘭氏染色液、大腸埃希氏菌O157∶H7干制生化鑒定試劑盒，均采購自北京陸橋技術股份有限公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（LST-MUG），廣東環凱微生物科技有限公司；革蘭氏陰性菌鑒定卡，法國生物梅里埃公司；大腸埃希氏菌O157 和H7 診斷血清，泰國Serotest；細菌DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），日本Takara；引物探針序列參考徐德順等[9]，見表1，由華大基因合成。

表1 引物探針序列

1.2 儀器與設備

高壓滅菌器，日本ALP公司；生化培養箱，德國美墨爾特公司；生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自動細菌生化鑒定儀，法國生物梅里埃公司；ViiA7 實時熒光PCR儀，美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品復原

根據組織方的參試指導書進行，樣品用60 mL無菌生理鹽水進行再水化。為了防止樣品間交叉污染，保證實驗結果準確，建議有條件的實驗室檢測不同樣品時分別在2 個生物安全柜中進行，或2個樣品操作之間對生物安全柜進行30 min 的紫外殺菌消毒[10]。

1.3.2 傳統國標方法

樣品的增菌、分離、初步生化實驗、血清學鑒定、生化試驗等步驟按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157∶H7/NM 檢驗》（GB 4789.36—2016）第一法操作，同時作陽性對照和陰性對照實驗。生化試驗鑒定時自營養瓊脂平板上挑取分純的菌落，制成0.5 個麥氏濁度的均勻菌懸液，再通過生化鑒定試劑盒和VITEK 2 Compact全自動菌種生化鑒定系統分別進行生化鑒定試驗。

1.3.3 實時熒光PCR試驗

（1）DNA提取。取1 mL增菌后的mEC＋n肉湯加入到1.5 mL 無菌離心管中，10 000 r/min 離心1 min，將上清棄去，重復上述操作一次，然后根據細菌DNA 提取試劑盒說明書進行后續DNA 提??；（2）實時熒光PCR 擴增。擴增反應體系∶Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，探針1.0 μL，RoxⅡ0.4 μL，模板4 μL，ddH2O補齊至20 μL；擴增反應條件∶94 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸40 s，共45個循環，在60 ℃進行熒光信號檢測。

2 結果與分析

2.1 樣品菌落形態及初步生化反應結果分析

結果顯示，樣品23-F568在CT-SMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均無菌落生長；而樣品23-G520在CT-SMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均有2 種形態菌落生長，其中1 種呈現大腸埃希氏菌O157∶H7的典型菌落形態，具體菌落形態和初步生化實驗結果見表2。結果表明樣品23-F568 中未檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，而樣品23-G520 中有可疑菌落，還需通過進一步生化實驗來進行驗證。

表2 樣品菌落形態及初步生化反應結果

2.2 血清學和生化實驗結果分析

2.2.1 血清學試驗

樣品23-G520的可疑菌落在O157血清和H7血清中出現明顯的凝集現象。

2.2.2 生化鑒定試劑盒試驗

對樣品23-G520 的可疑菌落用生化鑒定試劑盒進行生化實驗，結果見表3，再結合血清學試驗結果，表明樣品23-G520中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7。

表3 樣品23-G 520可疑菌落生化實驗結果

2.2.3 VITEK 2 Compact細菌生化鑒定儀試驗

VITEK 2 Compact 全自動細菌生化鑒定儀檢測結果見表4，結果顯示樣品23-G520 中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，且準確度較高。采用全自動菌種鑒定系統檢測時，應選取在非選擇性培養基平板上培養24 h 左右的純化菌株，并將菌懸液調整到合適的麥氏濁度范圍，這樣才能獲得最佳的實驗結果。

表4 全自動細菌生化鑒定儀實驗結果

2.2.4 實時熒光PCR試驗

采用實時熒光PCR 檢測方法對樣品23-F568、樣品23-G520、陰性對照、陽性對照及空白進行檢測，結果顯示樣品23-G520 及陽性對照有特異性擴增，而樣品23-F568及空白對照無特異性擴增，陰性對照雖有特異性擴增，但CT值大于30結果不可信，如圖1所示。根據實時熒光PCR結果可以確定樣品23-G520 中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，這與生化試驗鑒定結果一致。

圖1 實時熒光PCR檢測結果

3 結論與討論

能力驗證活動對檢驗人員的操作能力和經驗要求較高，但除了檢驗人員的技術因素外，影響能力驗證結果的因素還有很多，如樣品的保存、樣品的水化、加樣的準確度以及培養溫度和時間等[11-12]。因此，實驗室做微生物能力驗證實驗時要注意以下幾點∶（1）在參加能力驗證項目前，應對所選項目的檢驗標準理解和掌握，提前備好檢驗項目所需的培養基、試劑和耗材；（2）收到樣品后，如不立即進行檢驗，應將樣品按《參試指導書》置于-15 ℃冷凍保存；（3）樣品檢驗時要注意凍干粉是否完全水化，且水化后應立即進行檢驗，避免放置時間過長菌體死亡從而影響實驗結果；（4）培養時要選擇溫度適宜、波動較小的培養箱，避免因溫度不適宜對實驗結果造成影響。

此次能力驗證活動，實驗室采用了常規生化鑒定試驗結合VITEK 2 Compact 全自動微生物菌種鑒定系統對能力驗證結果進行比對，再通過實時熒光PCR 方法進行驗證，結果反饋為滿意。傳統國標法使用傳統生化鑒定方法雖易于操作，但耗時較長，人為干擾較大；采用VITEK 2 Compact 全自動微生物菌種鑒定系統可將生化鑒定時間由24~48 h縮短至4~7 h，且準確率較高；與生化鑒定方法相比，實時熒光PCR方法操作簡便省時，只需一步增菌就可進行DNA 提取及實時熒光PCR 試驗，省去了后續劃線、分離、培養、生化鑒定等一系列步驟，所需時間比傳統方法更短，且有較高的特異性和準確度，但是檢測成本較高。各實驗室可結合自身實際，選用適合自己的方法，或者多種方法互相驗證，提高結果的準確度。