基于高通量測序技術探討益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達譜的影響*

劉妍鑠,郭雋馥,楊宇峰,石巖

遼寧中醫藥大學,遼寧 沈陽 110847

糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的內分泌代謝性疾病[1]。國際糖尿病聯盟統計數據顯示,2021年全球20～79歲糖尿病患者占總人口數的10.5%,預計2045年這一比例將增至12.2%[2]。糖尿病及其并發癥的防治已成為全球醫學界面臨的重大挑戰。石巖教授倡導“脾虛致消”理論,以“健脾益氣、養陰清熱活血”為治則,在降糖丹的基礎上形成中藥復方益糖康。大量實驗研究表明,益糖康治療糖尿病的作用機制主要與改善糖脂代謝紊亂[3-4]、改善胰島素抵抗[5-6]、抑制糖異生[7]、抑制氧化應激[8]、抑制炎癥反應[9-10],以及調節胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)分泌[11]等有關。

近年來,miRNA在多種重大疾病發生發展中的重要作用及其作為潛在藥物靶點的研究已成為熱點。研究顯示,miRNA可通過干預胰島β細胞功能[12-13]、調節胰島素的合成與分泌[14-15]、調控胰島素信號傳導[16]等途徑影響糖代謝,進而直接或間接參與糖尿病的發生與發展。目前,尚無益糖康調控miRNA的研究報道。因此,本研究采用高通量測序技術分析益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達譜的影響,預測其潛在靶基因,以期從miRNA的角度探索益糖康防治糖尿病的作用機制,為其臨床推廣應用提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6雄性小鼠15只,6～8周齡,體質量(20±2)g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,質量合格證編號:2107262111-01612071。小鼠飼養于遼寧中醫藥大學實驗中心,溫度18～25 ℃,濕度60%～70%,12 h/12 h明暗交替,自由進食和飲水。實驗方案經遼寧中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會審核批準,倫理審查編號:210000420200073。

1.2 藥物與試劑益糖康(中藥飲片由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥局提供);RNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司,貨號:RE-0101T);反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Bimake生物科技有限公司。

1.3 儀器全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學有限公司);羅氏活力血糖儀(德國Roche Diagnostics公司);-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

2 方法

2.1 藥物制備益糖康中藥飲片浸泡30～60 min,煎煮3次,過濾,去除藥渣;將3次水煎液混合,濃縮至生藥質量濃度3.22 g·mL-1,冷藏備用。采用pH 4.2的檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)配制鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),質量濃度為3.0 g·L-1,現用現配。

2.2 動物分組、造模及給藥適應性飼養4 d后,將15只C57BL/6小鼠隨機分為空白組5只、造模組10只,前者給予普通飼料,后者給予高脂飼料;喂養4周后,禁食12 h,造模組小鼠腹腔注射STZ(100 mg·kg-1),空白組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;造模組小鼠繼續給予高脂飼料喂養7 d,禁食12 h后測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),高于11.1 mmol·L-1視為糖尿病模型建立成功。將造模成功的小鼠隨機分為模型組和益糖康組,每組5只,繼續給予高脂飼料。益糖康組小鼠的灌胃劑量為32.2 g·kg-1,空白組和模型組小鼠的灌胃劑量為10 mL·kg-1,連續9周,每日1次。

2.3 外周血樣本制備小鼠禁食12 h,1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉,摘除眼球取全血,置于-80 ℃ 冰箱保存。

2.4 FBG測定給藥前及第1—9周,末次給藥后,取小鼠尾尖血,將其滴于羅氏血糖儀配套血糖試紙上,測定并記錄FBG。

2.5 高通量測序技術檢測外周血miRNA表達情況模型組和益糖康組分別隨機選取3份外周血樣本進行miRNA測序和分析。每個樣本取1 μg總RNA在3′端和5′端進行接頭連接,然后進行逆轉錄和PCR擴增;構建miRNA文庫并進行質量控制檢測,確保插入物的平均大小為140～150 bp;以Illumina HiSeq為基礎,采用高通量測序技術進行全基因組測序。利用DESeq v1.18.0(Anders和Huber,2010)對不同樣本中的miRNA表達量進行比較,以|log2Fold Change|>1,P<0.05為標準篩選差異表達miRNA。

2.6 基因本體(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析以模型組和益糖康組小鼠mRNA的3′ UTR序列為目標序列,通過miRanda數據庫預測差異表達miRNA的靶基因。通過GO數據庫(http://geneontology.org/)預測靶基因涉及的細胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物進程(biological proccess,BP),具體方法為:根據每個條目中的靶基因數目,采用超幾何分布(P<0.05)的方法,計算靶基因在全基因組中的相對豐度,進而識別靶基因所發揮的重要功能。將靶基因上傳至KEGG數據庫(http://www.kegg.jp/)進行通路富集分析,結果根據FDR值升序排序。

3 結果

3.1 益糖康對糖尿病小鼠FBG的影響給藥前,模型組小鼠FBG>11.1 mmol·L-1,提示糖尿病模型建立成功。給藥第1—9周,與空白組比較,模型組小鼠FBG升高(P<0.01);給藥第4—9周,與模型組比較,益糖康組小鼠FBG降低(P<0.05,P<0.01),見圖1。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達的影響采用高通量測序技術檢測模型組和益糖康組小鼠外周血miRNA表達量,結果顯示,與模型組比較,益糖康組小鼠外周血中8個miRNA表達上調,包括miR-434-3p、miR-187-3p、miR-1895等;5個miRNA表達下調,包括miR-150-5p、miR-6912-5p、miR-342-5p等。這些差異表達miRNA的主要功能包括細胞分化、肌肉發育、細胞增殖、凋亡、氧化應激、糖脂代謝、炎癥等,見表1、圖2。

表1 模型組與益糖康組小鼠差異表達miRNA信息

圖2 模型組與益糖康組小鼠外周血差異表達miRNA熱圖

3.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過miRanda數據庫預測13個差異表達miRNA的靶基因,并對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析結果顯示,CC主要涉及細胞、細胞解剖實體、細胞連接與融合、突觸、細胞質(膜)的組成成分和內在成分等;MF主要涉及DNA結合轉錄因子活性、蛋白質結合、酶結合、激酶結合、離子結合、轉錄調節活性等;BP主要涉及生物調控、細胞過程調控、細胞交流、細胞對刺激的反應等,排名前10位的條目見圖3。KEGG分析結果顯示,主要通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路、Ras信號通路、叉頭框蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)信號通路、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine-protein kinase,ErbB)信號通路、細胞內吞、細胞衰老、細胞分化、胰島素抵抗、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體(advanced glycation end product-receptor,AGE-RAGE)信號通路等,排名前20位的通路見圖4。

圖3 GO功能分析柱狀圖

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

4 討論

糖尿病是一種由胰島素分泌絕對或相對不足,從而導致糖、脂肪、蛋白質等代謝失調為特點的內分泌代謝疾病。中醫學將糖尿病歸屬于“消渴”范疇,其病機以陰虛為本、燥熱為標。陰津虧損會導致燥熱偏盛,兩者互為因果,陰愈虛則燥熱愈盛,燥熱愈盛則陰更虛。石巖教授經過長期臨床實踐創制中藥復方益糖康,該方由黃芪、白術、黃連、黃精、丹參等14味中藥組成[32],具有降糖降脂作用,臨床用于防治糖尿病及其并發癥療效顯著。

miRNA是一組長21～23個核苷酸,在真核生物中普遍分布的非編碼微小RNA[33]。miRNA在生物體內廣泛分布,并且在進化上具有很強的保守性。他們參與細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應、免疫調節、腫瘤生長及轉移等生理病理過程[31]。由于外周血中的 miRNA在較高溫度下具有較強的耐受性,因而被認為是潛在的疾病早期診斷標志物[34]。miRNA在血液中分布廣泛,由于其穩定性及可選擇性釋放,已被證實與多種疾病的發生發展密切相關。因此,分析外周血miRNA,研究其靶向分子和相關信號傳導途徑有利于糖尿病等代謝性疾病的精準靶向防治。

本研究通過miRNA-Seq技術發現13個可能介導益糖康發揮作用的miRNA,主要是益糖康干預后表達上調的miR-434-3p、miR-382-3p等8個miRNA以及表達下調的miR-342-5p、miR-150-5p等5個miRNA。文獻報道顯示,過表達miR-434-3p通過靶向GATA結合蛋白4(GATA binding protein-4,GATA-4)促進成骨細胞分化[17]。王立俠等[27]研究發現,過表達miR-150-5p可促進細胞存活,抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放和細胞凋亡,從而減輕氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)誘導的大腦皮質神經細胞損傷。此外,α-硫辛酸輔助奧美沙坦酯治療糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的機制可能與降低血清miR-150-5p、miR-155-5p表達水平,進而改善患者血糖水平、減輕氧化應激反應有關[28]。2型糖尿病患者血清miR-342-5p水平可反映其脂質代謝異常程度[29]。百日咳桿菌引起的炎癥反應可使血清miR-342-5p表達顯著上升,這表明miR-342-5p可能參與炎癥的發生發展過程[31]。由此說明,益糖康調控miRNA可能與糖脂代謝、炎癥反應、細胞分化及細胞損傷等作用密切相關,但其潛在機制尚需進一步研究。

既往研究表明,眾多信號傳導途徑與糖尿病的發生發展相關。磷酸酯酶D (phospholipase D,PLD)是一種重要的細胞內受體,參與調控Ⅰ型肌纖維中由胰島素刺激或肌肉收縮觸發的肌細胞葡萄糖跨膜轉運的信號傳導系統[35]。糖腎平膠囊能夠調節DN腎組織中TGF-β1/p38 MAPK信號,降低包括足細胞在內的腎內在細胞凋亡,減輕腎臟病變,從而發揮腎臟保護作用并延緩病程進展[36]。MAPK信號通路參與高糖誘導的糖尿病多臟器病變的發生與發展,但其具體作用機制尚不明確。KEGG通路富集結果顯示,差異表達miRNA的靶基因可能在PLD、MAPK、TGF-β、Ras、FoxO、ErbB、胰島素抵抗、AGE-RAGE等信號通路中呈現高表達,推測益糖康可能通過調控上述通路治療糖尿病。

綜上所述,益糖康治療小鼠糖尿病的機制可能與調節外周血miRNA表達,影響細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激、糖脂代謝等功能,調控FoxO信號通路、胰島素抵抗等通路有關。本研究為中醫藥防治糖尿病及其并發癥的病理、藥理機制研究提供新的思路和方向。