基于網絡藥理學和細胞實驗探討陳皮-紫蘇子藥對治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制*

王艷梅,董浩然

1.河南中醫藥大學第二附屬醫院/河南省中醫院,河南 鄭州 450002; 2.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)具有高發病率和高病死率,已經成為全球公共衛生的重大挑戰[1-2]。COPD的主要癥狀包括咳嗽、咳痰、喘息和胸悶等,歸屬于“肺脹”“喘證”“咳嗽”等范疇。中醫學認為,COPD的病因為痰熱壅肺,濁痰內蘊于肺,肺氣阻滯導致血瘀;病機為外邪襲肺,導致肺氣不宣、升降失司,因而喘咳不止。COPD穩定期以本虛為主,治療應固本培元、調理肺氣、宣肺化痰[3]。中醫藥在治療COPD方面具有顯著優勢,副作用少,遠期療效較好。

陳皮(CitrusReticulata)-紫蘇子(PerillaeFructus)是臨床治療COPD的常用藥對,陳皮味辛、苦,性溫,歸脾、肺經,具有燥濕化痰、理氣宣肺的功效;紫蘇子味辛,性溫,歸肺、大腸經,能夠降氣疏壅、祛痰止咳[4]。陳皮與紫蘇子聯用,一升一降,調節肺之宣發與肅降,治節得伸而諸氣皆順,邪有路出,疾病得以緩解。目前,陳皮、紫蘇子配伍治療COPD的作用機制尚未明確,因此本研究采用網絡藥理學和分子對接探討陳皮-紫蘇子藥對治療COPD的作用機制,并通過細胞實驗進行驗證,以評估相關活性成分的藥理作用。

1 材料

1.1 細胞THP-1細胞購自中國科學院上海生命科學院研究院細胞資源中心,編號:SCSP-567。

1.2 藥物與試劑柚皮素、川陳皮素(批號:MUST-18050808、MUST-16070901)購自成都曼思特生物科技有限公司;木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇(批號:C29N10Q104574、Q16M11Q111761、R21O8F6338)購自上海源葉生物科技有限公司;白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(BD公司,貨號:9249866);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(R&D Systems,貨號:P302933);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma,貨號:039M4004V);乙酸佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)(MCE,貨號:HY-1873)。

1.3 儀器Synergy HTX型全波長酶標儀(美國BIO-TEK公司);SQP型電子天平(德國Sartorius公司);3131型CO2培養箱(美國Thermo公司);iCytal型細胞計數儀(中國卓微公司);1300 A2型生物安全柜(美國Thermo公司);Primo Vert型倒置生物顯微鏡(德國ZEISS公司)。

2 方法

2.1 網絡藥理學研究

2.1.1 陳皮-紫蘇子活性成分與作用靶點篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索陳皮、紫蘇子的化學成分與作用靶點,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為標準進行篩選,并結合文獻報道加以補充。借助Uniprot(https://www.uniprot.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org)數據庫獲取作用靶點的規范基因名稱。

2.1.2 陳皮-紫蘇子核心成分篩選利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡,篩選度值(Degree)排名前5位的化合物,將其作為陳皮-紫蘇子藥對的核心成分。

2.1.3 COPD相關靶點預測及交集靶點獲取以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”為關鍵詞,通過GeneCards數據庫檢索COPD相關靶點,并篩選Relevance score≥40的靶點。通過微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/)繪制陳皮-紫蘇子作用靶點與COPD相關靶點的韋恩圖,得到交集靶點。

2.1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及核心靶點篩選將藥物與COPD的交集靶點上傳至STRING數據庫(https://www.string-db.org/),物種設置為“Homo sapiens”,置信度為0.7,構建PPI網絡,篩選大于平均度值的靶點作為陳皮-紫蘇子藥對治療COPD的核心靶點。

2.1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析基于藥物與COPD的交集靶點,通過Metascape數據庫進行GO分析(P<0.05)和KEGG分析(P<0.05)。富集結果根據P值進行升序排序,并利用微生信在線平臺繪制高級氣泡圖。

2.1.6 核心成分-核心靶點分子對接從RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的PDB結構,將其作為受體;通過TCMSP數據庫和PumChem數據庫獲取核心成分的3D結構,將其作為配體;利用Autodock軟件進行分子對接,使用Discovery Studio軟件構建分子對接模擬圖。

2.2 細胞實驗

2.2.1 藥物制備使用萬分之一天平分別稱取木犀草素2 mg、β-谷甾醇5 mg、柚皮素5 mg、川陳皮素4 mg、花生四烯酸4 mg,使用二甲基亞砜(DMSO)配制成質量濃度為40 g·L-1木犀草素、50 g·L-1β-谷甾醇、50 g·L-1柚皮素、40 g·L-1川陳皮素、40 g·L-1花生四烯酸儲備液備用,正式實驗時稀釋成相應濃度。

2.2.2 分組、造模及給藥THP-1細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基,在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。將THP-1細胞接種于24孔板,調整細胞濃度至2×105mL-1,PMA(20 μg·L-1)誘導12 h,分為空白組、模型組、木犀草素組、β-谷甾醇組、柚皮素組、川陳皮素組。除空白組外,其余各組加入LPS(2 mg·L-1)建立細胞炎癥模型;在此基礎上,木犀草素組加入不同濃度木犀草素(0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1),β-谷甾醇組加入不同濃度β-谷甾醇(1.56 mg·L-1、3.13 mg·L-1、6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1),柚皮素組加入不同濃度柚皮素(3.13 mg·L-1、6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1),川陳皮素組加入不同濃度川陳皮素(2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、16 mg·L-1),花生四烯酸組加入不同濃度花生四烯酸(1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1),各組細胞培養24 h。

2.2.3 ELISA檢測細胞IL-6和TNF-α含量收集細胞上清液,1 000 r·min-1離心5 min,取上清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作,檢測各組細胞炎癥因子IL-6、TNF-α含量。

3 結果

3.1 網絡藥理學研究結果

3.1.1 陳皮-紫蘇子活性成分與作用靶點通過 TCMSP 數據庫篩選陳皮、紫蘇子的活性成分和作用靶點,結果顯示,陳皮活性成分5個(谷甾醇、柚皮素、川陳皮素等),作用靶點91個;紫蘇子活性成分14個(豆甾醇、花生四烯酸、木犀草素等),作用靶點223個,見表1。

表1 “陳皮-紫蘇子”活性成分與作用靶點信息

3.1.2 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡及核心成分基于陳皮-紫蘇子藥對的19個活性成分及其作用靶點,利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡,見圖1。拓撲分析顯示,Degree值排名前5位的化合物分別是紫蘇子中的木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸,陳皮中的柚皮素、川陳皮素,他們可能是陳皮-紫蘇子藥對的核心成分。

注:CP:陳皮;ZSZ:紫蘇子。

3.1.3 COPD相關靶點及陳皮-紫蘇子抗COPD潛在靶點通過GeneCards數據庫檢索到288個COPD相關靶點;利用微生信平臺繪制韋恩圖,得到34個交集靶點,將其作為陳皮-紫蘇子藥對干預COPD的潛在靶點,見圖2A。

注:A:交集靶點韋恩圖;B:交集靶點PPI網絡圖。

3.1.4 PPI網絡及陳皮-紫蘇子抗COPD核心靶點針對34個潛在靶點構建PPI網絡,該網絡包括34個節點、208條邊。根據平均度值篩選得到16個核心靶點,包括IL-6、TNF、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等,見圖2B。

3.1.5 KEGG通路分析和GO功能分析KEGG富集分析得到13條通路(P<0.05),主要包括白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號通路、細胞因子受體互作通路、低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路、內吞與鐵死亡等,見圖3A。GO富集分析得到3550個生物過程(biological process,BP)、385個分子功能(molecular function,MF)、264個細胞組成(cellular component,CC)。其中,BP主要涉及蛋白質磷酸化調控、平滑肌細胞增殖的調節、凋亡信號通路、激酶活性的調節、組織重塑、白細胞分化等;MF主要涉及細胞因子活性、磷酸酶結合、蛋白酶結合、激酶調節活性、ATP酶結合等;CC主要涉及膜筏、細胞外基質、內吞囊泡、細胞膜、細胞連接、IL-6受體復合物、TNF受體超家族復合體、PML小體等,其中一些功能已被證明與COPD的發生發展相關[5-8],見圖3B—3D。

注:A:KEGG通路圖;B:BP分析圖;C:CC分析圖;D:MF分析圖。

3.1.6 分子對接一般認為,分子對接結合能小于-4.25 kcal·mol-1表示有親和力,小于 -5.0 kcal·mol-1表示結合活性較好,小于 -7.0 kcal·mol-1表示結合活性較強,且結合能越低代表配體與受體的結合能力越強[9]。將核心成分(木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、柚皮素、川陳皮素)與核心靶點(IL-6、TNF)進行分子對接,結果顯示,結合能均小于-4.25 kcal·mol-1,見圖4、表2。

圖4 核心成分-核心靶點分子對接模擬圖

表2 分子對接結果

3.2 細胞實驗結果與正常組比較,模型組IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01);與模型組比較,各濃度柚皮素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5A、5F;與模型組比較,各濃度川陳皮素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5B、5G;與模型組比較,各濃度β-谷甾醇組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5C、5H;與模型組比較,各濃度木犀草素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5D、5I;與模型組比較,各濃度花生四烯酸組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5E、5J。

注:A-E:各組細胞IL-6含量;F-J:各組細胞TNF-α含量。與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

COPD通常由長期暴露于有害顆?；驓怏w,引起氣道和(或)肺泡異常[10],導致肺部慢性炎癥,進而出現持續氣流受限、咳喘、咳痰等呼吸系統癥狀,炎癥消退是病情治愈的關鍵。COPD患者氣道上皮受損,產生多種炎癥介質和細胞因子,引發氣道炎癥反應,臨床上以咳嗽、咳痰最為常見[11]。中醫學認為,“肺為貯痰之器”,痰濁最易內停于肺,影響肺的宣發、肅降功能。COPD的病變主要在肺,以氣虛衰弱為本、寒飲內停為標?；颊叨嘁蚰昀象w衰,長期氣血虧虛、肺氣郁滯,加上外邪入侵,入里化熱,痰熱壅肺導致肺氣宣降不利[12]。因此,治療應以宣肺通氣為主,通過祛邪宣肺、降氣化痰、活血化瘀等方法,消除痰壅氣逆,緩解咳嗽、氣喘等癥狀。

陳皮-紫蘇子是治療COPD的常用藥對,經典方劑蘇子降氣湯[13-14]、華蓋散[15-16]中均有兩藥配伍應用。陳皮、紫蘇子均具有理氣化痰、止咳平喘的功效;紫蘇子性潤,擅長理氣化痰、溫中降逆;陳皮性燥,擅長理氣化痰、理氣和胃;二者合用,燥潤相得,既不傷陰,又能潤燥化痰。本研究通過網絡藥理學分析陳皮-紫蘇子藥對治療COPD的作用機制,篩選出5個核心成分,即木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、柚皮素和川陳皮素。木犀草素具有祛痰、止咳、消炎等作用,能改善COPD患者肺功能,降低血清IL-6含量[17];同時,其可抑制急性肺損傷小鼠細胞焦亡,減輕肺損傷[18],并緩解新生敗血癥小鼠肺損傷[19]。β-谷甾醇通過抑制Ⅱ型免疫反應和膠原蛋白沉積從而改善氣道炎癥和氣道重塑[20],通過抑制白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)表達改善小鼠肺部炎癥反應[21],同時能夠減輕哮喘小鼠的肺部炎癥[22]。柚皮素可通過抑制炎癥反應和氧化應激反應從而保護心肌細胞免受損傷[23],并能通過調控巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化改善急性肺損傷[24]。川陳皮素可抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路從而改善小鼠急性肺損傷炎癥反應[25]。

通過PPI網絡挖掘出16個陳皮-紫蘇子藥對治療COPD的核心靶點,其中多個靶點與炎癥反應相關,如IL-6、TNF、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等。研究表明,氣道炎癥因子與細胞相互作用可促進COPD的發生與發展,并可誘發COPD急性加重[26-28]。Vitenberga等[29]發現,COPD患者支氣管組織中IL-6、TNF-α表達水平升高。Kleniewska等[30]研究表明,在COPD患者的急性加重期,痰和血清中IL-6、TNF-α濃度升高。IL-6能夠誘導急性反應,快速產生IL-6有助于增強機體在感染或組織損傷期間的防御能力[31]。IL-6是預測COPD急性加重的有效指標,對于COPD的診斷和治療具有重要意義[32]。TNF-α與肺部炎癥密切相關,血清TNF-α水平與COPD患者的病情緩解程度呈負相關[33]。

陳皮-紫蘇子藥對治療COPD主要作用于 HIF-1信號通路、IL-17信號通路、AMPK信號通路、內吞作用及鐵死亡等通路。已有研究證實,這些通路與COPD的發生、發展密切相關。HIF-1高表達可能與肺功能下降和生活質量下降有關[34]。HIF-1信號通路激活可能參與COPD的病理生理過程,穩定HIF-1表達有助于減輕組織炎癥,降低血清HIF-1濃度可延緩COPD病情進展[35]。IL-17 細胞因子家族包括多個成員,如IL-17A、IL-17C,能夠介導COPD的炎癥反應,造成肺部炎癥和組織損傷[36]。AMPK是COPD的潛在治療靶點,能夠減少異常炎癥反應和細胞衰老[37]。在COPD的病情發展中,巨噬細胞的吞噬功能缺陷可導致未能清除的細胞發生繼發性壞死,從而激發氣道炎癥[38]。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質過氧化反應所誘導的細胞死亡方式,鐵穩態破壞與COPD的發病機制密切相關[39]。

綜上所述,本研究采用網絡藥理學方法探討陳皮-紫蘇子藥對干預COPD的潛在機制。通過分子對接技術評估藥物活性成分與核心靶點的親和力,并結合體外細胞實驗驗證這些活性成分的抗炎作用。陳皮-紫蘇子藥對可通過多成分、多靶點、多途徑發揮治療COPD的作用,其機制可能與抑制炎癥反應有關。