魔芋甘露低聚糖增強腸道屏障功能改善酒精性中樞神經損傷的實驗研究

陳晶晶,鐘文艷,2,沈文卓,肖 莉,2,袁成福,2

(三峽大學1.基礎醫學院、2.腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室,湖北 宜昌 443002)

酒精濫用是一個影響全球健康的重大公共衛生問題[1],給社會的醫療體系和經濟造成重大的負擔。在長期大量的飲酒中,酒精和其代謝物會導致多器官損傷,包括神經系統。無論是一次大量飲酒或長期濫用都可以導致精神障礙,嚴重者可以出現不可逆的神經系統損害,導致認知功能障礙,抑郁樣行為和誘發成癮性[2]。對酒精導致的相關疾病最基本的治療措施是戒酒和營養支持,但由于成癮、社會環境和生活習慣等多因素影響,大部分患者無法完全做到。因此,深入闡明其發病機制和繼續開發有效的預防和治療性藥物,具有重要的科學研究意義和應用前景。

魔芋甘露低聚糖(Konjac mannan oligosaccharides,KMOS)[3],由β-D-甘露糖和β-D-葡萄糖殘基通過β-(1→4)糖苷鍵連接而成,是一種重要的功能性低聚糖。甘露低聚糖具有抗炎、抗氧化、調節免疫、減輕糖脂代謝障礙等多種生理功能[4]。由于甘露低聚糖不能直接被機體胃腸道消化吸收,只能被結腸微生物發酵利用,也被認為是益生元的一種。和其他藥物,尤其是抗生素相比,其安全性高,不產生耐藥性,具有良好的開發潛能。KMOS及其衍生物已被作為食品添加劑或者作為保健食品成分,用于預防多種疾病[5]。已有多種益生元被用于預防和治療與腸道衍生細菌產物相關的疾病以及與腸道滲漏相關的疾病[6]。然而,關于低聚甘露糖對酒精攝入造成的神經損傷的作用及其機制還不明確。在本實驗中,我們基于“腸-腦軸”探討KMOS增強腸道屏蔽功能,改善慢性酒精導致的神經損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠(8周齡,體質量20～22 g) 48只由中國三峽大學動物中心提供和喂養[質量證書編號SCXK(JI)2019-0008;中國宜昌],動物自由獲取食物和水,(23±3)℃,12 h光照/黑暗循環(實驗動物倫理號：2019010S)。

1.1.2藥品和試劑 本實驗中所用的魔芋低聚甘露糖購于湖北恩施天天佳生物科技有限公司,經HPLC鑒定純度≥98.0%。Lieber-DeCarlic液體飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司(酒精飼料貨號TP4030D,對照飼料貨號TP4030C)。尼氏染色液和ECL化學發光檢測試劑盒購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司,抗熒光衰減封片劑(DAPI)購于廣州索萊寶公司,RIPA緩沖液和BCA蛋白檢測試劑盒購自中國北京普利萊基因技術有限公司。檢測脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)濃度試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。實驗中所用的抗體Anti-NLRP3(1 ∶2 000, WL02635)、Anti-pro-IL-1β(1 ∶1 500, WL02257)、Anti-matuee-IL-1β(1 ∶500, WL00891)、Anti-caspase-1/cleaved caspase-1(1 ∶1 000, WL03450)、Anti-parkin(1 ∶500, WL02512)和Anti-PINK1(1 ∶1 000,WL04963)購自沈陽萬類公司, β-Actin(bs-0061R, 1 ∶4 000)購自北京博奧森公司,Anti-occludin(1 ∶1 000, A12621)購自武漢愛博泰克公司?；蛞镄蛄杏缮虾Ｉど锕こ坦煞萦邢薰竞铣?TRIzol購于日本TaKaRa Bio Inc公司,實時定量PCR所需的試劑Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購自于南京諾唯贊公司。

1.1.3主要儀器設備 實時定量PCR儀器購于美國Bio-Rad公司,酶標儀購于瑞士Tecan公司,Nanodrop分光光度儀器購自美國Thermo公司,凝膠成像系統購于美國Kodak公司,Western blot電泳和轉膜設備購自美國Bio-Rad公司,超薄切片機購于德國Leica公司,冷凍切片機購于中國達科為公司。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備 C57BL/6J雄性小鼠被隨機分成飲食對照組、酒精飲食模型組、KMOS低劑量組(100 mg·kg-1)組、KMOS高劑量組(200 mg·kg-1)組,每組12只。采用Gao-binge法建立小鼠慢性ASH模型[7]。藥物作用組每日KMOS灌胃一次,對照組和酒精飲食模型組灌以相應體積的質量濃度為5 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶劑,喂養6周。

1.2.2組織染色 腦組織浸泡在4%多聚甲醛中24 h,乙醇脫水,石蠟包埋并制作成5 μm的切片。常規蘇木精-伊紅或尼式液染色,于顯微鏡下觀察組織病理變化。免疫熒光檢測時,腦組織切片,脫蠟水化,浸于沸騰的修復液(0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液,pH 6.0)中進行抗原修復10 min,自然冷卻至室溫后取出玻片,用PBS(pH 7.4)沖洗3遍,每次3 min,室溫封閉30 min?？笽BA1(1 ∶300)一抗,于4 ℃濕盒中孵育過夜。PBST沖洗切片3次,每次3 min,與熒光二抗濕盒中室溫避光孵育1 h,PBST沖洗切片4次,每次3 min。含DAPI抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡下采集圖像,IPP 6.0軟件分析熒光強度。

1.2.3ELISA檢測 血漿LPS測定根據試劑盒說明書操作,檢測血漿中LPS的濃度。TNF-α、IL-6、IL-1β所有低于檢測范圍最小值的數據均被認為是0。

1.2.4Western blotting 皮層、海馬組織和回腸組織加入RIPA裂解緩沖液充分研磨,4 ℃下12 000 r·min-1離心30 min,吸取上清液獲得總蛋白。BCA 蛋白定量法測定含量。蛋白樣品加入5×SDS蛋白上樣緩沖液100 ℃變性5 min。30 μg樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉至PVDF膜,5%脫脂牛奶,室溫封閉1 h。加入特異性一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL化學發光并顯影。以β-actin為內參,用ImageJ軟件分析蛋白質條帶密度值。

1.2.5RT-PCR分析 使用TRIzol從小鼠結腸組織樣品中裂解提取總RNA,以1 μg的總RNA為模板,采用隨機引物利用逆轉錄酶反轉成cDNA。以cDNA為模板,其相應的特異性引物擴增目的基因。以GAPDH基因表達為內參,相對基因表達用2-ΔΔCT法計算。使用的引物如下：TNF-α, 正向： CCTGTAGCCCACGTCGTAG; 反向： GGGAGTAGACAAGGTACAACCC; IL-1β, 正向： GAAATGCCACCTTTTGACAGTG; 反向： CTGGATGCTCTCATCAGGACA; GAPDH, 正向： TCAAGAAGGGTGGTGAAGG; 反向： TCAAAGGGTGGAGGGGGGGGGTGGTT。

1.2.6Caco-2細胞培養 Caco-2細胞培養于DMEM培養基(含10% FBS),37 ℃、5% CO2的環境中培養。Caco-2細胞以2×105個/孔接種于6孔板,待細胞融合度約70%后,100 mmol·L-1的酒精誘導細胞損傷,同時加或不加高、低濃度KMOS(100、200 μmol·L-1),培養24 h,收集細胞進行蛋白分析或制成細胞爬片進行免疫熒光分析。

2 結果

2.1 KMOS有效改善慢性酒精攝入導致的小鼠神經元損傷臨床研究表明,酗酒者的神經元與非飲酒者相比數量明顯減少,腦重量也降低[8]。本研究也觀察到慢性酒精飲食小鼠有較低的體質量和腦體質量比,KMOS的干預明顯逆轉酒精對小鼠體質量和腦質量的降低(Fig 1A, 1B)。尼氏體是神經元蛋白質合成的重要部位,其減少是評估神經元數量和功能的重要指標。慢性酒精的攝入導致小鼠皮層和海馬神經元的尼氏體染色明顯減輕,KMOS的干預有效地逆轉了小鼠神經元的這種變化(Fig 1C) 。這說明KMOS的使用能有效改善慢性酒精攝入小鼠神經元的損傷。

Fig 1 KMOS treatment effectively inhibited neuronal cell damage caused by chronic alcohol

2.2 KMOS抑制慢性酒精喂養小鼠腦組織小膠質細胞活化和炎性反應小膠質細胞激活導致的炎癥反應是神經元損傷的重要因素[9]。我們使用免疫熒光觀察小膠質細胞標志物IBA1的表達。結果顯示,對照組小鼠大腦皮層和海馬區域偶見IBA1+細胞,同時陽性細胞內免疫熒光著色點小,熒光強度低,基本未見明顯的活化狀態。酒精喂養小鼠腦內IBA1陽性細胞數多,免疫熒光著色點較大(胞體增大),熒光強度高且呈阿米巴樣,活化明顯。而KMOS的干預明顯抑制了小鼠小膠質細胞的活化(Fig 2A, 2B)。同時,KMOS的使用也明顯抑制了小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(Fig 2C)。

Fig 2 KMOS treatment inhibited the activation of microglia caused by chronic alcohol

2.3 KMOS抑制慢性酒精喂養小鼠腦組織NLRP3活化水平小膠質細胞NLRP3炎癥小體的激活常常被認為是腦組織炎癥反應的重要信號因子[10]。對小鼠大腦皮層和海馬的檢測顯示,經酒精喂養后小鼠大腦皮層和海馬組織NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表達量均明顯上升,而KMOS的干預明顯降低了小鼠皮層和海馬組織NLRP3的活化水平(Fig 3)。

Fig 3 KMOS treatment inhibited NLRP3 activation in the brain tissue of chronic alcohol-fed

2.4 KMOS逆轉了慢性酒精喂養導致的小鼠大腦線粒體自噬損傷已有報道,小膠質細胞NLRP3炎性小體活化生成的炎性因子可造成細胞線粒體自噬的損傷[11],導致受損細胞線粒體積累的增加和活性氧的釋放,進一步加劇細胞損傷。對小鼠腦組織線粒體自噬相關蛋白的檢測表明,KMOS的用藥逆轉了酒精飲食喂養小鼠皮層和海馬組織Parkin、PINK1蛋白表達水平的降低(Fig 4)。這一結果說明KMOS抑制NLRP3炎性小體活化,改善慢性酒精喂養導致小鼠腦組織線粒體自噬損傷。

Fig 4 KMOS reversed the damage of brain mitophagy caused by chronic alcohol feeding in

2.5 KMOS明顯改善酒精導致的小鼠腸道屏蔽功能損傷,降低血清LPS水平酒精的攝入會導致腸道黏膜損傷和屏蔽功能降低。實驗結果顯示,酒精飲食組小鼠結腸出現腸黏膜絨毛縮短和斷裂,上皮細胞紊亂,大量炎癥細胞浸潤的情況。KMOS治療后,這些病理變化得到了改善(Fig 5A)。同時,酒精飲食小鼠結腸組織緊密連接蛋白Occludin的表達出現明顯降低,而KMOS的處理明顯逆轉了這一現象(Fig 5B),降低結腸組織炎性因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平(Fig 5C,5D)。更重要的是,慢性酒精酒喂養可導致小鼠血清中LPS水平的明顯增加,而KMOS的干預明顯降低了血清LPS的水平(Fig 5E)。

Fig 5 KMOS significantly improved alcohol-induced intestinal shielding function damage in

2.6 KMOS增強酒精暴露下Caco-2細胞的Occludin表達為了進一步明確KMOS對腸道組織損傷的保護作用,我們使用酒精刺激Caco-2細胞建立細胞損傷模型。結果顯示,KMOS的干預明顯提高了酒精誘導下Caco-2細胞Occludin蛋白的表達水平(Fig 6A, 6B);抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平(Fig 6C)。

Fig 6 KMOS significantly improved alcohol-induced Occludin expression in Caco-2 n=5)

3 討論

大量研究表明,慢性飲酒會導致中樞神經系統損傷。近年來,功能低聚糖由于其功能的廣泛和安全性受到研究者的廣泛關注。本實驗使用KMOS干預慢性酒精攝入小鼠,結果表明,KMOS可有效地減輕海馬和皮質的神經元病理損傷。KMOS的這種有效性被揭示歸因于抑制小膠質細胞介導的神經炎癥,表現出對酒精性神經損傷的預防潛力。

抑制小膠質細胞過度活化是治療和預防神經系統炎癥和神經退行性疾病研究的重要靶點[12]。近年來的研究表明,小膠質細胞激活在持續性神經退行性疾病的進展中起主導作用。小膠質細胞作為中樞神經系統的常駐免疫監視細胞,其被不恰當或持續激活時,會分泌各種炎癥細胞因子,最終破壞周圍的神經元細胞。其中小膠質細胞中NLRP3炎性小體,被視為腦神經炎癥反應中的重要信號因子[11]。NLRP3炎性小體可被病毒、LPS、氧化應激等因素激活,促使IL-1β、IL-18等炎性因子的成熟和分泌,對神經元細胞產生毒性作用[13];同時也可進一步造成細胞線粒體自噬的損傷,導致受損線粒體的積累和活性氧的釋放[11]。Gao等[14]發現,何首烏提取的有效成分之一四羥基芪糖苷能明顯抑制小膠質細胞和神經元中的NLRP3信號通路,有效緩解LPS誘導的炎癥反應,進而調節PINK1/Parkin信號通路的自噬。用槲皮素治療抑郁癥發現,槲皮素可以通過促進線粒體自噬抑制小膠質細胞NLRP3活化,進而改善神經元的損傷[15]。我們的實驗結果表明,KMOS的干預明顯抑制了慢性酒精暴露小鼠海馬和皮質組織的小膠質細胞激活,降低NLRP3炎癥小體的活化和炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平,改善線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin的損傷,這說明KMOS通過對小膠質細胞NLRP3炎性小體過度活化的干預,抑制慢性酒精攝入導致的神經炎癥,來減輕酒精性中樞神經系統損傷。但是KMOS無法直接被腸黏膜細胞所吸收入血,因此這種對小膠質細胞活化的抑制作用可能是間接實現的,其具體機制還需進一步研究。

酒精的攝入可導致腸道菌群的紊亂和腸屏障完整性的破壞,使腸道細菌及細菌產物,如內毒素LPS進入體循環,從而導致系統性炎癥反應和多個器官的損傷[16]。防御素、緊密連接蛋白和腸道免疫細胞是構成腸道屏障的主要組件。腸道上皮細胞之間的緊密連接對于維持腸道屏障完整性和影響腸道上皮對微生物及其產物的滲漏至關重要。Bala等[16]研究結果發現長期濫用酒精會破壞小腸緊密連接的完整性,提高腸道通透性增高,血漿內毒素水平較健康對照組明顯升高。Li等[17]的研究也同樣發現,長期飲酒者,腸道菌群釋放更多的內毒素,破壞腸道屏障,引起炎癥反應,介導多臟器的組織損傷。已有實驗報道,在雞的飼料中添加甘露低聚糖和活性酵母可減輕大腸桿菌導致的雞腸道炎癥反應,增強腸道緊密連接蛋白的表達,改善腸道屏障功能的損傷[5]。單獨使用甘露低聚糖就可以重塑腸道微生物群,增強腸道屏蔽功能,阻止LPS的腸漏和提高腸道內短鏈脂肪酸含量,從而改善阿爾茲海默癥小鼠的認知障礙[18]。我們的實驗結果顯示,酒精暴露小鼠腸道緊密連接蛋白Occludin嚴重下調,結合血清中LPS明顯增加的實驗結果,說明慢性酒精刺激會導致腸道屏障功能損害,使得腸道LPS逸出。不同劑量的KMOS干預都能有效上調酒精攝入小鼠腸道Occludin蛋白含量,增強腸道屏障功能,從而降低了血清中LPS水平。體外實驗也進一步證明,KMOS可以明顯抑制酒精暴露下Caco-2細胞炎性因子表達的增加,提高Occludin表達的水平。這些結果提示,KMOS能夠提高腸道緊密連接蛋白的表達,改善酒精誘導的腸道損傷,抑制LPS進入循環系統。

綜上所述,KMOS的使用可以抑制慢性酒精攝入小鼠小膠質細胞的過度活化,改善其對神經元的神經毒性作用,其可能的機制是通過抑制腸道細胞炎性反應,增強腸道屏障功能,來減少腸道源性LPS進入大腦。由于其使用的安全性,KMOS具有成為預防酒精性神經損傷藥物的潛力。