柚皮素下調RIP1-RIP3-MLKL信號通路抑制多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細胞凋亡

呂向陽,任曉爽,張 良,許繼群

(1. 山東中醫藥大學附屬醫院生殖遺傳科,山東 濟南 250011;2. 山東第一醫科大學附屬濟南婦幼保健院婦女保健科,山東 濟南 250001)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種持續無排卵性內分泌疾病。近來大量研究證實,胰島素抵抗、激素分泌紊亂、炎癥及氧化應激,均可損傷卵巢顆粒細胞,導致PCOS患者卵巢卵泡發育不良及無排卵癥狀的發生[1]。卵泡顆粒細胞為卵母細胞的發育提供營養和生長調節劑,卵泡顆粒細胞凋亡會使卵泡生長延遲,在PCOS的發病機制中起重要作用[2]。壞死性凋亡,也叫做程序性壞死,其失調是許多炎癥性疾病的關鍵因素。最近的1項研究顯示,PCOS相關的顆粒細胞中多種差異基因與細胞凋亡和壞死性凋亡途徑有關[3]。受體相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)、RIP3和混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like proteins,MLKL)是參與調節壞死性凋亡的主要分子,RIP1可與其家族蛋白RIP3相互作用,形成壞死復合體,介導壞死性凋亡信號的傳導及轉化,參與細胞死亡過程[4]。已有文獻研究發現,RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡參與癌癥、腦損傷、心臟損傷等多種疾病的發展[5]。然而,RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡是否也參與PCOS顆粒細胞凋亡過程,尚未見報道。

柚皮素是合成雌激素的天然替代物之一,其具有較好的抗炎、抗氧化應激、改善性激素分泌紊亂、緩解卵巢顆粒細胞層減少等作用[6],提示柚皮素可能是治療PCOS的潛在藥物。但柚皮素抗卵巢顆粒細胞減少的作用是否與RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡途徑有關,未見報道。本研究通過建立大鼠PCOS模型對此進行探究驗證,以期闡明柚皮素抗PCOS顆粒細胞凋亡的分子機制,并為其開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠,SPF級,♀,體質量200～210 g,6～7周齡,購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司[動物生產許可證號：SCXK(吉)2020-0002]。大鼠于山東中醫藥大學動物實驗中心飼養[動物使用許可證號：SYXK(魯)2022-0009],實驗經山東中醫藥大學動物倫理委員會批準：IACUC-01(20200327),符合3R原則。

1.2 試劑柚皮素(貨號：SND-675,規格：20 mg),購自滁州仕諾達生物科技有限公司;脫氫表雄酮(貨號：30099087),購自深圳海思安生物技術有限公司;RIP1特異性抑制劑Nec-1(貨號：LM4359),購自上海聯邁生物工程有限公司;RIP1-RIP3-MLKL壞死信號激活劑(caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk,貨號：MBS842218-C),購自艾美捷科技有限公司;大鼠白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號：MS23245)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：MS35245),均購自北京博沃爾斯生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：E-CK-A211),購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;抗體RIP1、磷酸化RIP1(p-RIP1)、RIP3、磷酸化RIP3(p-RIP3)、MLKL、磷酸化MLKL(p-MLKL),均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器BX-51型光學顯微鏡(日本Olympus公司);iMark680多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司);FACScan流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.4 方法

1.4.1模型建立及分組 SD大鼠參照文獻[7]方法,于頸背部皮下注射脫氫表雄酮(脫氫表雄酮溶于注射用油劑,30 mg·kg-1,2 mL·kg-1,每天1次,連續4周),建立PCOS模型(以第10周檢查取陰道涂片,出現角化細胞、動情周期不完整,并出現血清睪酮水平異常升高,視為造模成功)。大鼠隨機分為：模型組、柚皮素組(100 mg·kg-1)、Nec-1組、Z-VAD-fmk組、柚皮素+Z-VAD-fmk組,每組15只;另取SD大鼠在相同部位于相同時間注射油劑2 mL·kg-1,作為正常對照組。

柚皮素組參照文獻[6]灌胃給予柚皮素(100 mg·kg-1,10 mL·kg-1,每天1次,連續7 d);Nec-1組參照文獻[8]經腹腔注射給予RIP1特異性抑制劑Nec-1(6 mg·kg-1,每天1次,連續7 d);Z-VAD-fmk組參照文獻[9]經尾靜脈注射caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk(1.5 mg·kg-1,每天1次,連續7 d);柚皮素+Z-VAD-fmk組灌胃給予柚皮素(100 mg·kg-1)的同時,尾靜脈注射給予Z-VAD-fmk進行治療;模型及正常對照組灌胃給予10 mL·kg-1生理鹽水。

1.4.2流式細胞術測卵巢顆粒細胞壞死率及凋亡率 隨機取5只各組大鼠,處死,取左右卵巢組織,參照文獻[10]中操作方法,分離并收集卵巢組織中的顆粒細胞,制成卵巢顆粒細胞液,取2×106個細胞,按Annexin V-FITC/PI雙染液說明書方法,染色孵育后,流式上機檢測細胞死亡方式,并計算壞死率及凋亡率。

1.4.3HE染色觀察卵巢形態 斷頭處死大鼠,取左右卵巢組織,左側卵巢制成厚20 μm的冰凍切片,取相同部位切片,復溫、水化后行HE染色,光鏡下觀察卵巢組織顆粒細胞及卵泡細胞形態變化。右側卵巢組織置于液氮中保存備用。

1.4.4免疫組化法檢測卵巢組織p-RIP1陽性表達 相同卵巢組織冰凍切片,復溫、水化、透化處理后,滴加1 ∶200的p-RIP1一抗孵育過夜,生物素標記的IgG二抗孵育50 min,DAB顯色及蘇木精復染后,光鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus 6.0軟件檢測單位面積內,p-RIP1陽性染色的平均光密度值。

1.4.5ELISA法檢測卵巢組織炎癥因子IL-1β、TNF-α水平 取液氮中保存的卵巢組織,解凍、剪碎、勻漿后取勻漿液,ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α水平。

1.4.6Western blot法檢測蛋白表達 液氮中保存的卵巢組織,解凍、剪碎,組織裂解液裂解及冰上研磨,提取勻漿液中蛋白,BCA法檢測蛋白總濃度,用50 μg蛋白行電泳、電轉膜操作。孵育盒中滴加1 ∶1 000稀釋的RIP1、p-RIP1、caspase-8、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL一抗,以及1 ∶2 000稀釋的β-actin內參抗體孵育24 h,再與二抗室溫孵育2 h,化學發光液顯色、曝光,Alpha Ease FC軟件計算蛋白條帶相對灰度值。

1.4.7統計學分析 表示符合正態分布的數據,SPSS 21.0統計軟件分析數據,單因素方差分析及SNK-q檢驗行多組間比較及組間多重比較。

2 結果

2.1 柚皮素對大鼠卵巢組織病理形態的影響由Fig 1的HE染色可見,正常對照組大鼠卵巢組織卵泡、卵母細胞正常,顆粒細胞層數為8～12層;模型組卵巢組織可見卵泡囊性擴張、卵泡閉鎖且內無卵母細胞,顆粒細胞層減少等病理損傷嚴重;柚皮素組及Nec-1組大鼠卵泡顆粒細胞層增多,閉鎖卵泡減少;Z-VAD-fmk組大鼠卵泡囊性擴張、卵泡閉鎖,顆粒細胞層減少最嚴重;柚皮素+Z-VAD-fmk組上述病理損傷較柚皮素組嚴重,較Z-VAD-fmk組有明顯改善。

Fig 1 HE staining of ovarian tissue of rats in each group(×40)

2.2 柚皮素對大鼠卵巢顆粒細胞壞死率及凋亡率的影響流式檢測圖中,象限(Q2+Q4)總和為凋亡細胞數目,Q1象限為壞死細胞數目,Q3為生存細胞數目。如Fig 2所示,與正常對照組相比,模型組大鼠卵巢顆粒細胞壞死率、凋亡率升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠卵巢顆粒細胞壞死率、凋亡率降低(P<0.01),柚皮素組對卵巢顆粒細胞壞死率、凋亡率降低作用優于Nec-1組;Z-VAD-fmk組大鼠凋亡率較模型組降低(P<0.05),壞死率較模型組進一步升高(P<0.05)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠凋亡率降低(P<0.05),壞死率升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢顆粒細胞壞死率、凋亡率降低(P<0.01)。

Fig 2 Annexin V-FITC/PI double staining used to detect apoptosis rate and necrosisrate of ovarian granulosa cells in each

2.3 柚皮素對大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平的影響如Fig 3所示,與正常對照組相比,模型組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01),柚皮素組對卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低作用優于Nec-1組;Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平較模型組升高(P<0.01)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01)。

Fig 3 Comparison of levels of inflammatory factors (IL-1β, TNF-α) in ovarian

2.4 柚皮素對大鼠卵巢組織p-RIP1陽性表達的影響免疫組化染色顯示(Fig 4),p-RIP1在正常對照組大鼠卵巢顆粒細胞層中呈弱陽性表達,在模型組卵巢顆粒細胞層中呈強陽性(紅棕色)表達,模型組大鼠卵巢組織顆粒細胞中p-RIP1陽性表達高于正常對照組(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠p-RIP1陽性表達降低(P<0.01),柚皮素組p-RIP1陽性表達降低強度優于Nec-1組。Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽性表達較模型組升高(P<0.01)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽性表達升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽性表達降低(P<0.01)。

Fig 4 p-RIP1 immunohistochemical staining of rat ovariantissue and comparison of positive expression

2.5 柚皮素對大鼠RIP1-RIP3-MLKL壞死途徑相關蛋白表達的影響如Fig 5所示,與正常對照組相比,模型組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL降低,柚皮素組對壞死途徑相關蛋白的降低作用優于Nec-1組。Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值較模型組進一步升高(P<0.01)。柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值高于柚皮素組;與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值降低(P<0.01)。

Fig 5 Expression of p-RIP1/RIP1, p-RIP3/RIP3 andp-MLKL/MLKL in rat ovarian

3 討論

卵巢顆粒細胞為卵泡內的大細胞群,可為卵泡發育提供營養,并維持性激素的分泌[2]。PCOS患者血糖、血脂、性激素分泌紊亂、胰島素抵抗、炎癥刺激,均可誘導卵巢顆粒細胞老化、凋亡,從而阻滯小竇卵泡發育,導致PCOS排卵異常并影響生育[11]。Zhang等[12]研究發現,PCOS患者卵泡液、顆粒細胞中存在IL-1β、TNF-α炎性因子及睪酮水平升高現象,并認為睪酮水平可能誘導炎癥細胞向卵泡液、顆粒細胞趨化而誘導卵巢顆粒細胞凋亡。本研究發現,模型組大鼠卵巢中閉鎖卵泡增多,顆粒細胞減少,卵巢顆粒細胞凋亡率、壞死率均升高,卵巢組織中炎癥因子(IL-1β、TNF-α)水平均高于正常對照組,提示PCOS大鼠出現炎癥、顆粒細胞凋亡、壞死現象,表明造模成功。柚皮素為二氫黃酮類成分,其具有較好的降糖、降脂、抗炎、抗凋亡及抗氧化應激、降低胰島素抵抗等作用[13]。Hong等[14]發現,柚皮素可緩解PCOS大鼠卵巢顆粒細胞層減少等病理損傷。本研究發現,柚皮素在緩解PCOS大鼠顆粒細胞減少、卵泡閉鎖等病理損傷的同時,還降低卵巢顆粒細胞壞死率及凋亡率,抑制卵巢炎癥因子(IL-1β、TNF-α)分泌,證實柚皮素可能為防治PCOS顆粒細胞凋亡的潛在藥物。然而,柚皮素促進PCOS卵巢顆粒細胞生存的信號調節機制,還不明確。

壞死性凋亡不同于凋亡和其他形式的程序性細胞壞死,其不依賴于caspase活性,但需要RIP3調控的MLKL磷酸化,MLKL的磷酸化使MLKL在質膜上產生孔復合體,從而導致損傷相關分子模式的分泌、細胞腫脹和膜破裂[15]。RIP1是調控壞死性凋亡的關鍵蛋白,在炎癥、凋亡、感染、應激等條件下,RIP1的K117、K627、K377位點去泛素化修飾,可促進RIP1發生自身磷酸化活化,而啟動死亡、凋亡及存活等信號的傳導及傳遞[16]。已有研究發現,磷酸化的RIP1可誘導RIP3發生自身磷酸化,并與其結合形成壞死小體,激活MLKL,使MLKL磷酸化形成寡聚體,來破壞細胞完整性,介導細胞壞死性凋亡的產生[17]。本研究發現,PCOS大鼠卵巢顆粒細胞中p-RIP1陽性表達異常升高,其下游RIP3和MLKL的磷酸化水平均增加,表明PCOS大鼠卵巢顆粒細胞中RIP1-RIP3-MLKL途徑處于活化狀態。提示RIP1-RIP3-MLKL途徑的激活可能是介導PCOS大鼠顆粒細胞壞死性凋亡的可能機制。

RIP1的特異性抑制劑Nec-1可抑制RIP1去泛素化修飾,阻斷RIP1磷酸化激活,抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死小體形成介導的壞死性凋亡的發生,促進細胞存活。本研究用RIP1特異性抑制劑Nec-1阻斷PCOS大鼠卵巢組織中RIP1磷酸化活化后,RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡途徑被抑制,卵巢顆粒細胞壞死率、凋亡率均降低,提示阻斷顆粒細胞RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡途徑可抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡信號轉導,改善PCOS卵巢卵泡及顆粒細胞病理損傷。此外,本研究發現柚皮素抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡途徑活化的作用優于Nec-1,其對PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡改善效果最明顯,提示柚皮素促進卵巢顆粒細胞存活的作用可能與抑制RIP1-RIP3-MLKL信號轉導有關。caspase-8可通過RIP1和RIP3的裂解,抑制壞死性凋亡,如果caspase-8活性被阻斷,RIP3即被募集到復合物中,形成壞死小體,引發細胞壞死性凋亡。caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk可抑制caspase-8凋亡途徑活化,促進細胞向RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡方向發展。本研究發現,使用Z-VAD-fmk抑制caspase-8活性后,卵巢顆粒細胞凋亡率有所改善,但RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡途徑活化最嚴重,顆粒細胞壞死率最高,大鼠卵泡閉鎖最嚴重,且caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk可部分減弱柚皮素改善PCOS炎癥、卵巢顆粒細胞凋亡的作用。提示柚皮素對PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的抑制作用可能是通過阻斷RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡途徑實現的。

綜上所述,柚皮素可能通過阻斷RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡途徑活化,抵抗PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。本研究為柚皮素治療PCOS提供一定參考,但PCOS卵巢顆粒細胞死亡機制還可能與其他途徑有關,柚皮素改善PCOS卵巢損傷,促進顆粒細胞存活的其他機制,還需繼續深入研究。