槲皮素通過雌激素受體下調長非編碼RNA MALAT-1并發揮抗乳腺癌的作用機制

趙梓亦,熊小明,謝雨鵬,張義文,張翠薇

(1.成都中醫藥大學附屬醫院中醫藥調節代謝性疾病四川省重點實驗室,四川 成都 610000;2.西南醫科大學附屬醫院病理科,3.重大疾病精準病理診斷瀘州市重點實驗室,4. 西南醫科大學臨床醫學院,四川 瀘州 646000; 5. 四川大學華西醫院生物治療全國重點實驗室,四川 成都 610041)

乳腺癌是全球癌癥發病率最高的癌種[1],大多數乳腺癌都是雌激素依賴性的,雌激素影響著乳腺癌的發生、發展、治療及預后[2]。在雌激素發揮作用的復雜網絡中,雌激素受體(estrogen receptor,ER)水平的高低是雌激素發揮作用的決定性因素[3]。因此,如何有效地將雌激素及其受體作為乳腺癌的治療切入點越來越受到人們的關注。前期研究已發現,E2可以促進乳腺癌細胞轉移相關肺腺癌轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)的轉錄水平。MALAT-1是一種富含核的長非編碼RNA,通常在患者腫瘤和轉移灶中過表達。在乳腺癌中,MALAT1的過表達與腫瘤進展和轉移呈正相關[4]。另一方面,我們還發現,槲皮素作為一種具有雌激素樣活性的天然活性中藥單體成分[5],對包括乳腺癌在內的多種與雌激素有關的惡性腫瘤均有一定的療效,但作用機制并不十分清楚。本文通過研究槲皮素在經17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)處理的乳腺癌MCF-7和MB231細胞中的作用,并深入探尋其分子機制,期望為乳腺癌的中醫藥治療探尋新的分子靶點,也為中醫藥治療乳腺癌提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 中藥篩選從APExBIO公司的天然化合物庫(貨號：L1039P)中篩選具有潛在抑制腫瘤細胞增殖能力的藥物。即將潛在治療藥物按每個反應體系10 μmol·L-1加入到MCF-7細胞中,在24 h后觀察細胞的生長狀態,取細胞生長狀態停滯,且細胞并未死亡的作用藥物進行后續研究。

1.2 細胞系及主要試劑人乳腺細胞系MCF-7和MB231購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司,CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞培養用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養MCF-7和MB231細胞,培養條件為37 ℃ 含5% CO2的細胞培養箱。

1.4 CCK-8細胞實驗在96孔板中接種MCF-7細胞,培養過夜使細胞貼壁。在24、48、72 h分別加入10 μL CCK-8試劑,繼續培養1 h。結束后,注意避光,并采用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(Absorbance,A)。每個組別設置3個復孔,檢測細胞的增殖能力。

1.5 PI染色法檢測細胞周期各組細胞處理后,用胰酶消化,收集細胞,75%乙醇4 ℃固定30 min,RNase去除RNA,避光條件下PI染色30 min,流式分析儀檢測,每個樣品收集1×104個細胞分析細胞周期。

1.6 平板克隆形成實驗將MCF-7細胞接種于6孔板中,經胰蛋白酶消化、梯度倍數稀釋后接種于培養皿中,培養14 d,經甲醇固定、Giemsa染色、計數,檢測細胞的增殖能力。

1.7 構建過表達雌激素受體α(estrogen receptor-α,ERα)、MALAT-1慢病毒并轉染乳腺癌細胞株依據ERα和MALAT-1的序列設計引物,擴增目的片段,再經切膠回收、雙酶切后獲得目的基因片段,質粒純化并提取后行PCR和測序鑒定;將過表達質粒與慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞,包裝產生假病毒顆粒,完成過表達ERα、MALAT-1慢病毒的構建。用慢病毒LV-ERα、LV-MALAT-1分別轉染乳腺癌MB231細胞和MCF7細胞,持續篩選獲得穩定過表達ERα、MALAT-1的乳腺癌細胞株MB231-ERα和MCF7-MALAT-1。

1.8 Western blot檢測腫瘤細胞中ERα蛋白表達收集轉染后的MB231-ERα細胞株,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,制膠、蛋白上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育,顯影、定影、成像,用Image Lab 軟件檢測ERα 蛋白的表達。

1.9 RT-qPCR檢測腫瘤細胞中MALAT-1表達細胞處理后,用1 mL TRIzol從5×106個細胞中提取細胞總RNA,并用100 μL去離子水溶解。將1 μg細胞總RNA以Oligo(dT)為引物逆轉錄為cDNA。以 β-actin 為內參基因,引物由廣州復能基因有限公司合成,95 ℃預變性1 min后擴展并收集信號,每個檢測進行3次重復,計算MALAT-1的相對表達量。

1.10 mRFP-GFP-LC3熒光雙標腺病毒轉染檢測細胞自噬按照病毒感染復數于細胞培養基中加入病毒原液,將RFP-GFP-hLC3熒光標記的腺病毒轉染導入外源性蛋白質,避光孵育2 h后,棄孵育液,更換細胞培養基,37 ℃、5% CO2培養箱中培養,于熒光顯微鏡下觀察自噬小體及自噬溶酶體的數量。

2 結果

2.1 槲皮素對E2引起的MCF-7增殖促進具有逆轉作用通過對天然化合物庫中具有潛在腫瘤抑制活性的天然化合物進行篩選,我們發現槲皮素對MCF-7細胞的生長可能具有抑制作用。分別用1、2.5、5、7.5和10 nmol·L-1E2處理乳腺癌細胞MCF-7,并在1、2和3 d后檢測細胞生長的變化,并發現5 nmol·L-1E2處理2、3 d后可以明顯增加MCF-7細胞的增殖活性,差異具有統計學意義(Fig 1A,P<0.05)。接著在加入5 nmol·L-1E2同時,分別加入1、2.5、5和10 μmol·L-1槲皮素,觀察細胞活力的變化。結果顯示,5和10 μmol·L-1槲皮素明顯抑制了雌激素對MCF-7細胞的促增殖作用,差異具有統計學意義(Fig 1B,P<0.05)。并且,單獨加入5和10 μmol·L-1槲皮素對乳腺癌細胞的增殖活性沒有影響。

Fig 1 Effect of E2 and quercetin on proliferation of MCF-7 cells by CCK-8

2.2 槲皮素對E2的抑制依賴于ERα表達接著,我們以不表達/微量表達ERα的乳腺癌細胞MB231為研究對象,通過慢病毒轉染構建穩定過表達ERα的細胞株,來驗證槲皮素的作用是否依賴于雌激素受體(Fig 2A)。我們發現,過表達ERα并未對MB231細胞周期產生明顯變化(Fig 2B)。過表達ERα后,E2可以促進MB231-ERα的增殖活性(Fig 2C),但在加入槲皮素后,這種高增殖活性被逆轉(Fig 2C,P<0.05)。這個結果說明,槲皮素對E2作用的抑制,依賴于ERα的表達。

Fig 2 Effect of over-expression of ERα on inhibitory effect of quercetin of MB231

2.3 槲皮素抑制雌激素所致的乳腺癌細胞MALAT-1上調,但不影響細胞自噬前期研究已發現,E2可以促進乳腺癌細胞MALAT-1的轉錄水平,于是我們用RT-qPCR檢測了MALAT-1水平[6]。結果顯示,在MB231-ERα 細胞中,E2組MALAT-1的轉錄水平明顯增高,加入槲皮素可以明顯降低MALAT-1的轉錄水平,差異具有統計學意義(Fig 3A,P<0.05)。由于MALAT-1與細胞自噬密切相關,我們用E2處理了穩定感染慢病毒mRFP-GFP-LC3的MB231細胞,并觀察自噬線體的形成情況。如Fig 3B,E2處理可以明顯增加GFP和mRFP共定位形成的顆粒信號,但槲皮素加入并未明顯抑制顆粒信號的形成。

Fig 3 The possible mechanisms of quercetin′s anti-tumor effects on MB231

2.4 槲皮素抑制MALAT-1表達并抑制乳腺癌細胞的增殖能力為了檢測槲皮素對細胞活力的抑制是否通過降低MALAT-1表達水平實現的,我們進一步以MCF7細胞株為模型,構建了過表達MALAT-1的腫瘤細胞,并在24、48 h檢測細胞增殖能力變化。結果顯示(Fig 4A,P<0.05),槲皮素逆轉了E2對乳腺癌細胞促增殖作用,而過表達MALAT-1可以進一步促進細胞增殖,說明槲皮素可能主要通過抑制E2對MALAT-1的調控作用來影響了細胞增殖。為了確認這一潛在機制也出現在乳腺癌細胞的其他生物學行為上,我們進一步檢測了細胞周期分布和克隆形成能力。結果與預期一致,在過表達MALAT-1后,槲皮素對細胞周期(Fig 4B)和克隆形成(Fig 4C)的影響均可被逆轉。這說明5 μmol·L-1槲皮素對乳腺癌的影響,是通過抑制E2對MALAT-1的上調作用來實現的。

Fig 4 Effect of over-expression of MALAT-1 on

3 討論

乳腺癌是雌激素依賴性惡性腫瘤,抑制雌激素作用下的癌細胞增殖是控制疾病進展、改善預后的關鍵[7]。雌激素是一種類固醇激素,包括雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)和雌三醇(E3),其中E2 在體內含量最豐富,作用最強[7],在各種生理和病理狀態下發揮調控作用。因此,本研究選用E2處理乳腺癌MCF-7和MB231細胞。E2需與特定的ER結合方可發揮功能。雌激素核受體主要包括ERα和ERβ兩種,由不同基因編碼而成,因組織分布不同而存在功能上的差異[8]。大約70%的乳腺癌患者有ERα表達,且ERα信號失調是乳腺癌進展和內分泌抵抗的主要原因[9]。因此,我們構建了穩定過表達ERα的細胞株來驗證槲皮素的作用是否依賴于ERα。

槲皮素結構與E2結構類似,是一種天然的植物雌激素[10],可以競爭性地與 ER 結合,進而誘導激素信號轉導途徑的改變,產生雌激素樣作用[11]。本研究發現,槲皮素可以抑制E2對乳腺癌細胞的增殖促進作用,并證明了這種作用依賴于ERα的表達。但槲皮素結合ERα后激活雌激素受體通路的作用靶點及分子機制尚需進一步探尋。

Aiello等[12]通過染色質免疫共沉淀技術檢測E2刺激后的乳腺癌細胞發現,雌激素受體的長鏈非編碼RNA表達峰主要存在于MALAT-1、HOTAIR和ANRIL啟動子區域上。其中,MALAT1是促進乳腺癌浸潤和轉移的主要非編碼RNA。過表達的MALAT-1促進了乳腺癌干細胞的增殖、遷移和侵襲[13],并與乳腺癌的分化程度、大小和臨床分期等臨床病理學特征密切相關[14]。我們前期研究也證明,一定濃度的E2可以促進乳腺癌細胞MALAT-1的轉錄水平[6]。因此,我們檢測了槲皮素和E2共同作用下乳腺癌細胞的增殖能力和MALAT-1的轉錄水平,結果與預期一致,槲皮素抑制了E2所致的MALAT-1過表達,進而抑制了乳腺癌細胞的增殖能力;過表達MALAT-1后,這種抑制作用被逆轉。以上結果說明,槲皮素對乳腺癌細胞增殖能力的影響是通過結合ERα抑制E2,進而逆轉了E2對MALAT-1的上調作用來實現的;并且,槲皮素降低了E2對MALAT-1的上調作用,這可能是槲皮素抑制乳腺癌惡性行為的分子機制。此外,為了進一步探索槲皮素抗乳腺癌的分子機制,我們還檢測了E2作用下乳腺癌細胞的自噬水平,結果顯示,槲皮素的加入并未改變乳腺癌細胞的自噬水平。

綜上,槲皮素通過結合ERα抑制了E2對乳腺癌細胞的增殖促進作用,下調MALAT-1可能是槲皮素抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制之一。槲皮素可以作為潛在的靶向ERα的抗乳腺癌藥物,并在未來臨床治療上可能有更廣闊的應用前景。