新生兒溶血性黃疸的腸道菌群結構特點分析

閆懷宇 喬繼冰 蔣亞洲 沈 男 吳 讓 寧 濤

（徐州醫科大學附屬宿遷醫院兒科，江蘇 宿遷，223800）

新生兒溶血?。╤emolytic disease of newborn, HDN）是指母親與子女血型不合引起的同種族免疫性溶血[1]。在發現的26個人類血型分類中， ABO血型溶血最為常見（85.3%），Rh血型和其他血型溶血則相對較少（14.7%）[2]。HDN的發病機制現已基本清晰，遺傳自父親（母親不具有）的顯性紅細胞表面血型抗原經胎盤進入母體后，可刺激機體產生相應IgG，待其進入胎兒血流循環后可引發抗原-抗體反應，從而導致紅細胞被破壞[1-2]。HDN不僅常造成新生兒貧血，代償刺激肝臟、脾臟腫大，還可導致短期內血清未結合膽紅素濃度急劇升高，出現重度黃疸，甚至損傷中樞神經系統[2-3]。

腸道菌群作為最大的免疫和內分泌“器官”，在機體內參與眾多生理活動，如防御感染、生長代謝、免疫發育以及調節等。隨著腸道微生態學的快速發展以及高通量測序技術的廣泛應用，腸道菌群與新生兒黃疸的相關性日益受到關注。目前，腸道菌群參與膽紅素代謝已在國內外相關研究中得到證實，包括動物實驗和人體研究[4-7]。然而，HDN所致的新生兒黃疸與腸道菌群相關性尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年10月—2023年3月于徐州醫科大學附屬宿遷醫院出生且確診為新生兒溶血性黃疸的患兒作為病例組，同期在醫院出生的健康新生兒作為對照組。本研究已經徐州醫科大學附屬宿遷醫院醫學科研倫理委員會審查批準，并且所有新生兒父母或監護人均知情后簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

病例組納入標準：①HDN診斷符合2021年中國輸血協會免疫血液學專業委員會制定的《胎兒新生兒溶血病實驗室檢測專家共識》[1]；②新生兒高膽紅素血癥診斷符合2022版《美國兒科學會新生兒高膽紅素血癥管理指南》[8]； ③年齡小于1周齡，且為母乳喂養。④父母或監護人依從性良好。

排除標準：①存在使用抗生素、益生菌、益生元、合生元或其相關制劑；②存在或合并遺傳性疾病、代謝性疾病、胃腸道疾病以及菌血癥；③母親孕期存在特殊結構飲食；④早產兒（胎齡小于259 d）。對照組排除標準與病例組一致。

1.3 方法

提取糞便DNA。試驗人員在院內使用無菌器皿收集所有新生兒的新鮮糞便，挖取糞便中段里部，量約3～5 g，隨后放入無菌凍存管內，于-80 ℃冰箱存儲備用。待全部樣本收集結束后，利用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（生產企業：凱杰生物技術有限公司，上海）提取糞便基因組DNA，操作流程按說明書進行。采用1%瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計（生產企業：梅特勒托利多科技有限公司，瑞士）分別質檢提取后的DNA，僅當電泳存在明顯主帶且A260/280比值位于1.8～2.0之間時方視為合格。

高通量測序。以高變區V4段作為PCR待擴增區，設計并合成引物：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3'）。擴增后初始產物通過Agencourt AMPure XP磁珠純化并隨后溶于Elution Buffer，完成建庫。選用Agilent 2 100 Bioanalyzer進行文庫的片段長度及濃度質量檢測，合格后于HiSeq平臺測序。

生物學分析。對測序后的初級數據進行過濾，以獲取有效數據，步驟如下。①設置窗口為25 bp，若平均質量小于20 bp，則截去窗口后端堿基。截短后的序列小于原始序列長度75%的，則去掉整條序列；②去除接頭已污染的序列（默認接頭序列與原始序列有15 bp重疊，允許錯配數為3）；③去除含有N的序列；④去除低復雜度序列（默認序列中連續堿基長度大于或等于10的為低復雜度序列）。依據序列之間的重疊關系，通過FLASH軟件進行拼接，以獲取高變區的Tags。利用USEARCH軟件將Tags聚類為OTU代表序列（相似性大于97%），將所有Tags通過usearch_global法對比回原OTU代表序列，隨即獲取各樣本的OTU豐度統計量表，期間嵌合體采用UCHIME去除。將OUT代表序列與數據庫進行比較、注釋對應物種，基于最終結果分別選用α多樣性和β多樣性分析腸道菌群的組間豐度、多樣性和相似性差異。選用LDA數值和LEfSe分析明確顯著差異菌類，即生物標記物。

1.4 統計學分析

選用SPSS 26.0軟件進行數據分析。連續計量資料以（±s）表示，若兩組間資料同時符合正態分布和方差齊性，選用獨立樣本t檢驗進行比較，反之則選擇秩和檢驗。計量資料的正態性分布檢驗和方差齊性檢驗分別利用Shapiro-Wilktest法和Levene法進行判定。計數資料以[n（%）]表示，選用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較

本研究共計納入新生兒55例，含HDN組29例（男性19例，女性10例），健康對照組26例（男性16例，女性10例）。兩組之間的性別（男性占比65.5% vs 61.5%，P=0.94）和年齡[（3.70±1.35）d vs （3.66±1.23）d，P=0.81]比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組α和β多樣性比較

HDN組和對照組一共聚類OTU數量為295個，含HDN組171個，對照組124個，共同擁有71個，見圖1。α分析顯示兩組間的多樣性存在顯著差異（shannon指數，P＜0.05），見圖2A；而豐度差異無統計學意義（ace指數，P＞0.05），見圖2B。β分析顯示基于unifrac距離的兩組間相似性比較，差異有統計學意義（P＜0.05），表明組間物種相似性存在顯著差異，見圖3。

圖1 兩組間OUT數量與交集

圖2 α多樣性分析：A shannon指數；B ace指數

圖3 β多樣性分析

2.3 腸道菌群豐度結構比例

在門水平，HDN組主要由變形菌門（38.53%）、厚壁菌門（37.57%）、放線菌門（13.17%）和擬桿菌門（10.70%）組成；而對照組主要由厚壁菌門（81.15%）、變形菌門（16.68%）和放線菌門（2.11%）組成，見圖4A。在屬水平，HDN組關鍵菌屬（豐度比例前十）為埃希氏菌屬（25.94%）、鏈球菌屬（21.87%）、雙歧桿菌屬（10.43%）、擬桿菌屬（9.78%）、克雷伯菌屬（9.42%）、腸球菌屬（5.32%）、韋榮氏球菌屬（4.77%）、梭菌屬（2.78%）、羅氏菌屬（2.72%）和沙門氏菌屬（2.23%）；而對照組則變為鏈球菌屬（69.27%）、埃希氏菌屬（9.99%）、腸球菌屬（7.50%）、克雷伯菌屬（6.54%）、韋榮氏球菌屬（3.31%）、雙歧桿菌屬（1.48%）、梭菌屬（0.77%）、羅氏菌屬（0.62%）、乳酸菌屬（0.17%）和擬桿菌屬（0.02%），見圖4B。

圖4 相對豐度比例圖： A 門水平；B 屬水平

2.4 關鍵菌屬差異判定

默認LDA預設定分值為2，獲取顯著差異物種，見圖5，并進一步篩選關鍵菌屬。結果顯示，相對于對照組，HDN組關鍵菌屬變化為埃希氏菌屬、克雷伯菌屬、擬桿菌屬和羅氏菌屬豐度升高，而鏈球菌屬（唾液鏈球菌為主）豐度降低。LEfSe聚類圖進一步支持了此關鍵菌屬變化，見圖6。

圖5 LDA分值圖

圖6 LEfSe聚類圖

3 討論

本研究通過16S rDNA擴增子測序技術對新生兒溶血性黃疸患兒進行了腸道菌群檢測，結果顯示其主要變化為埃希氏菌屬、克雷伯菌屬、擬桿菌屬和羅氏菌屬豐度升高，而鏈球菌屬豐度降低。

腸道菌群與膽紅素代謝的相關性已在國內外相關研究中得到證實。小鼠模型實驗顯示，無菌小鼠的糞便中并不存在糞膽原，取而代之的是大量結合膽紅素[4]；通過糞菌移植的方法將野生小鼠腸道內的菌群轉至無菌小鼠體內后，則可逆轉該趨勢，并在1周恢復糞便中的糞膽原生理含量[5]。在人體研究中，膽紅素代謝與腸道菌群同樣表現出緊密相關性。在一項腸道菌群與黃疸相關性研究中顯示，新生兒膽汁淤積癥患兒腸道中的菌群豐度明顯增加，尤以機會致病菌為主，而以未結合膽紅素升高為主要表現的患兒則以雙歧桿菌屬豐度降低為主要特點[6]。上述動物和人體試驗均直接或間接證實了腸道菌群紊亂是引起膽紅素代謝障礙的原因之一。

與前研究結果相似，本研究結果顯示，HDN所致的新生兒高膽紅素血癥同樣存在腸道菌群紊亂，且以機會致病菌豐度升高為主要變化，尤以致病性較強的埃希氏菌屬和克雷伯菌屬為代表。埃希氏菌屬為革蘭染色陰性短桿菌，大部分含有鞭毛，可運動，兼性厭氧[9]。在生命早期，該菌屬就已在胃腸道、呼吸道、泌尿道以及口腔等部位定植，是人類和動物體內常見的共生菌之一[10]。然而，在一項對1 208例新生兒高膽紅素血癥患兒的血培養結果分析中，埃希氏菌屬檢出率竟高達5.92%[11]。此外，該菌屬所致的新生兒敗血癥、化膿性腦膜炎、膽囊炎、腹腔膿腫、泌尿道和呼吸道感染在新生兒期也均可見報道，進一步提示埃希氏菌屬在新生兒期具備較強的條件致病性[12-17]?？死撞鷮偻瑸楦锾m染色陰性菌，且兼性厭氧，但其形狀與埃希氏菌屬并不相同，表現為單獨、成對或鏈條狀的粗桿菌，多有較厚莢膜。生理狀態下，該菌屬可定植于人體的呼吸道和胃腸道，但當局部微環境改變后可導致感染性疾病。HDN發生后，血紅蛋白破壞被加速，這不僅增加了體內膽紅素的來源，而且還并發貧血[2-3]。貧血是胃腸蠕動和消化酶分泌的影響因素之一，同時因攜氧量減少可導致腸道上皮屏障功能減弱及通透性增強，為埃希氏菌屬和克雷伯菌屬的感染提供條件[18]。國內一項病原學研究顯示，新生兒高膽紅素血癥患兒的克雷伯菌屬檢出率約為3.62%[11]。因此，臨床醫生在診療新生兒溶血性黃疸過程中，需警惕上述兩種菌屬的腸源性感染可能。

擬桿菌屬和羅氏菌屬均可將腸道內不可消化的膳食纖維發酵成短鏈脂肪酸（short chain fatty acids, SCFAs），并間接參與免疫屏障和膽紅素的代謝[19-21]：（1）SCFAs可促進腸道上皮的增殖與修復，并減少其凋亡；（2）SCFAs參與細胞間的緊密連接蛋白組裝，從而減少上皮細胞間的 “腸漏”；（3）SCFAs可刺激黏蛋白的分泌，進一步提高黏液層厚度，減少致病菌的定植；（4）SCFAs可降低腸道微環境pH，為有益菌的增殖提供弱酸環境，有助于膽紅素的肝-腸循環代謝。因此，SCFAs產生菌豐度升高有利于減少機會致病菌感染和加速膽紅素的腸道內代謝，該變化可能為HDN發生后機體拮抗膽紅素水平過高的代償效應。

鏈球菌屬是化膿性球菌中的另一大類常見革蘭染色陽性球菌，包含69個種和亞種，廣泛定植于人體腸道，多定義為正常菌群。本研究結果顯示，新生兒溶血性黃疸患兒存在鏈球菌屬豐度減低，尤以唾液鏈球菌為著。唾液鏈球菌為口腔早期定植的益生菌，但該菌在腸道內的作用尚處于初始研究階段。有研究表明[22-24]，唾液鏈球菌在腸道內的作用具有兩面性，甚至在不同病種間可發揮截然相反的作用，故該菌在溶血性疾病中的效應還需更多后期研究。

綜上所述，本研究明確了新生兒溶血性黃疸患兒存在腸道菌群紊亂，整體多樣性增加，關鍵菌屬中埃希氏菌屬、克雷伯菌屬、擬桿菌屬和羅氏菌屬豐度升高，而鏈球菌屬豐度降低。該研究結果可能為HDN所致黃疸的靶向微生態干預提供部分理論依據。