藤黃健骨膠囊對PMOP大鼠RANKL/c-Fos/NFATc1通路的影響

安方玉 顏春魯 柳穎 王霞霞 孫柏 汪春梅 常偉榮 宋佳眙 王玉潔 張捷 肖志攀 高鵬

甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性絕經后卵巢分泌雌激素的功能下降導致破骨細胞(osteoclast,OC)介導的骨吸收大于成骨細胞(osteoblast,OB)介導的骨形成而引起的一種全身代謝障礙性疾病[1-2]。其疼痛、骨折嚴重威脅了女性的生活質量[3]。如何有效治療PMOP成為醫學研究者關注的焦點。

中醫學認為PMOP的病機多為“本虛標實”:腎虛為本,血瘀為標,治則當以“標本兼治、補腎活血”為治療大法。本課題組前期動物實驗結果已證實,補腎活血方藤黃健骨膠囊能夠通過調控卵巢模型鼠OPG/RANK/RANKL調節軸去來影響其Ga2+、P代謝[4]。臨床試驗研究結果也進一步證實藤黃健骨膠囊能夠通過明顯升高老年性骨質疏松癥患者BGP、OPG、BMD含量來發揮治療作用[5],但具體機制尚未闡明。

近年來研究發現,驅動骨代謝的免疫調節分子IL-33能夠通過抑制RANKL誘導的OC形成防止炎癥性骨丟失的發生[6]。也有研究發現c-fos在骨代謝相關疾病中對OB-OC動態平衡產生著重要影響[7-8]。此外也發現抑制活化T細胞c1核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFATc1)蛋白表達的同時可抑制去卵巢骨質疏松模型大鼠的OC分化[9]。由此推測免疫調節分子IL-33對RANKL/c-Fos/NFATc1骨代謝信號軸的影響可能是PMOP發生的關鍵機制。因此,本課題通過觀察藤黃健骨膠囊對PMOP大鼠免疫調節因子IL-33、IL-1、IL-31變化及RANKL/c-Fos/NFATc1骨代謝信號軸關鍵調控分子OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1的表達變化,初步探尋補腎活血方藤黃健骨膠囊防治骨質疏松尋找關鍵靶點,以期為中醫藥治療PMOP提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:60只SPF級SD雌性大鼠由甘肅中醫藥大學科研中心供應,體重(180±20)g,動物質量合格證號為SCXK(甘)2020-0001。飼養于環境溫度為20 ℃、濕度為42%～52% SPF級實驗室中,常規飼養。本實驗經過甘肅中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準(批號:2021-809)。

1.1.2藥物、試劑及儀器:藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責任公司,批號:210108);戊酸雌二醇片(法國DELPHARM Lille S.A.S.公司,批號:676A);IL-33、IL-1、IL-31含量測定盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號:2212R36、2212R31、2212R37);OPG一抗(美國GeneTex公司,批號:822005891);RANK、RANKL、c-Fos一抗(美國ImmunoWay Biotech,批號:B8101、B0401、B8401);NFATc1一抗(美國Abclonal公司,批號:0073810201)。Multiskan Sky型酶標儀(北京昊諾斯科技有限公司);EXPERT-XL型雙能X線骨密度儀(美國GE公司);Chemi Doc XRS型凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);Ds-fi3顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 方法

1.2.1分組:60只SD雌性大鼠隨機分為假手術組(sham group,Sham)、模型組(postmenopausal osteoporosis model group,PMOP),陽性對照組(estradiol valerate group,ESV)、藤黃健骨膠囊高劑量(Tenghuang Jiangu capsule high-dose group,TJCH)、中劑量(Tenghuang Jiangu capsule medium-dose group,TJCM)、低劑量(Tenghuang Jiangu capsule low-dose group,TJCL)組,每組10只。

1.2.2PMOP大鼠模型構建與干預:依據參考文獻[10-11],在每組動物術前禁水、禁食12 h后給予戊巴比妥鈉腹腔內注射。仰臥位固定每組動物,剔除其側腹周圍毛發,常規碘伏消毒后沿背部后正中線作一1.0～1.5 cm縱形切口,逐層切開皮膚、筋膜、肌肉,鈍性分離進入腹腔找到棕黃色呈菜花樣的卵巢將其切除并止血,再逐層縫合切口。假手術組只切除卵巢附近的脂肪組織。術后給予每組動物青霉素以防感染,常規飼養。卵巢摘除8周后于每天上午9點開始進行灌胃干預,TJC治療組給予TJC 0.36、0.18、0.09 g/kg灌胃(藤黃健骨膠囊劑量設置依據參考文獻[12],人臨床用量為2 g,按照人與大鼠的體表面積換算法:人用劑量2 g×0.018×5≈0.18 g/kg作為中劑量),ESV組給予戊酸雌二醇0.09 mg/kg灌胃,Sham組和PMOP組大鼠給予等量蒸餾水灌胃,連續干預8周[13-14]。

1.2.3體質量檢測:動物干預結束后次日用電子天平測定各組動物的體質量變化。

1.2.4骨密度檢測:動物干預結束后次日將其麻醉,通過雙能X線吸收測量儀測量各組動物股骨的骨密度(bone mineral density,BMD),具體操作程序的設置根據儀器使用說明書進行。

1.2.5股骨組織病理形態學改變觀察:BMD檢測結束后通過股動脈采血處死每組動物,摘取每組動物完整的右側股骨并剔除其股骨表面的軟組織,浸潤于4 %的多聚甲醛中過夜,第二日用PBS沖洗后EDTA脫鈣處理,每隔24 h更換1次EDTA脫鈣液,1個月后常規制作石蠟切片,切片厚度為5 μm切片,HE染色后封片并鏡檢,觀察股骨形態改變情況。

1.2.6血清中免疫調節因子的含量檢測:采集大鼠股動脈血液5 mL,3 000 r/min離心5 min,收集上層血清做ELISA檢測,通過ELISA測試盒測定IL-33、IL-1、IL-31含量的表達變化。

1.2.7股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達檢測:TRizol裂解液股骨RNA,以RNA為模板,在反應條件和時間分別為25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min和85 ℃ 5 min中逆轉錄合成cDNA,接著進行OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1等目的基因的PCR擴增反應,反應條件設置為預變性過程95 ℃ 5 min,變性過程95 ℃ 10 s,退火過程55 ℃ 20 s和延伸過程72 ℃ 20 s。目的基因相對表達量以2-△△Ct來表示。所有引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.8股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達檢測:加入RIPA裂解液提取股骨組織總蛋白,將蛋白樣品電泳、轉膜,封閉后加入一抗OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1等孵育過夜(設置溫度為4 ℃),二抗孵育1 h(設置溫度為37 ℃)后顯色、曝光。最后以GAPHD蛋白為內參測定各組動物股骨組織目的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 六組動物體質量和BMD指標比較

與Sham組比較,PMOP組和TJCL組大鼠體質量顯著升高,BMD顯著降低(P<0.05或P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組和ESV組大鼠體質量顯著減輕,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠BMD顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 六組動物體質量和BMD指標比較

2.2 六組動物股骨組織病理形態學變化

Sham組大鼠股骨組織形態及結構正常,骨小梁排列規則,骨髓腔內有極少量脂滴沉積;PMOP組、TJCM組和TJCL組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂、數目明顯減少,不能連接成網,PMOP組和TJCL組骨髓腔內有大量脂滴沉積;TJCH組和ESV組大鼠骨小梁數量增加,連接完整、排列較整齊、連續性好,而TJCH組、TJCM組和ESV組骨髓腔內有脂滴沉積,但脂滴沉積數量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態改變(HE,×20)Fig.1 Pathological changes of femoral tissue in each group (HE, ×20)

與Sham組比較,PMOP組大鼠BMAT明顯升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組、TJCM組和ESV組大鼠BMAT明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 六組動物骨髓脂肪組織相對面積比較

2.3 六組動物血清免疫調節因子含量變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠血清IL-33含量明顯降低,IL-1和IL-31含量明顯升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組和ESV組大鼠血清IL-33含量均顯著增加,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠血清IL-1及IL-31含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 六組動物免疫調節因子含量比較

2.4 六組動物股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠股骨組織OPG基因表達顯著降低,RANKL、RANK、c-Fos、NFATC1基因表達顯著升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH、TJCM組和ESV組大鼠股骨組織OPG基因表達均顯著增加、RANK基因表達均顯著降低,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠股骨組織RANKL、c-Fos、NFATc1的基因表達也均顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達結果比較Fig.2 Comparison of gene expression of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups

2.5 六組動物股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠股骨組織OPG蛋白表達及蛋白表達灰度值顯著降低,RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達及蛋白表達灰度值顯著升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH、TJCM組和ESV組大鼠股骨組織OPG蛋白表達及蛋白表達灰度值均顯著增加、RANK蛋白表達及蛋白表達灰度值均顯著降低,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠股骨組織RANKL、c-Fos、NFATc1的蛋白表達及蛋白表達灰度值也均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3～圖4。

圖3 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達變化(Western-blot)Fig.3 The protein expression changes of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups (Western-blot)

圖4 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達灰度值結果比較Fig.4 Comparison of the gray value radio of protein expression of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups

3 討論

祖國醫學將PMOP歸屬于“骨痿”范疇,臨床患者多以“腎虛血瘀”為主要證型。其發病主要是由于PMOP患者長期腎精虧虛致使骨髓充盈不足,后者誘發骨骼失養而致“痿”;此外,腎為先天之本,PMOP患者長期腎精不足則無以化生血而致“瘀”。因此,PMOP的防治方法側重于“補腎活血”。

藤黃健骨膠囊主要組成是熟地黃、骨碎補、肉蓯蓉、鹿銜草、淫羊藿、雞血藤、萊菔子。諸藥合用,具有“補腎壯骨,活血止痛”之效。從中醫的角度來說,藤黃健骨膠囊與PMOP“腎虛精虧,瘀血阻絡”的病機相契合,符合PMOP“補腎壯骨、活血通絡”的治療原則。周霖等[14]通過網絡藥理學GO富集分析發現藤黃健骨膠囊主要涉及炎癥反應、信號轉導、蛋白磷酸化等生物過程,胞質、包膜等細胞組分及酶活性、能量活性等分子功能?，F代藥理學研究發現,中藥骨碎補可能通過下調Notch1和抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥來顯著改善老年PMOP患者的血脂水平脂質狀況[15]。骨碎補有效成分柚皮苷通過靶向JAK2/STAT3信號傳導促進BMSC成骨分化,也可以減緩PMOP大鼠的骨丟失[16]。淫羊藿及其生物活性成分[17]均可抑制骨轉換,增加鼠的骨密度,改善骨小梁厚度來逆轉去卵巢大鼠誘導的骨丟失,延緩PMOP的發生發展。臨床試驗結果也證實藤黃健骨膠囊可顯著升高腎虛血瘀型原發性骨質疏松癥患者的骨密度,降低骨代謝,促進骨鈣化形成,增加骨強度[18]。臨床試驗研究結果進一步證實藤黃健骨膠囊能夠明顯升高老年性骨質疏松癥患者BGP、OPG含量,明顯降低其ALP、U-Ca/Cr、U-HoP/Cr含量,從而通過抑制老年性骨質疏松癥患者的骨吸收和促進骨生成來提高其BMD,進而發揮治療作用[5]。本實驗結果也證實藤黃健骨膠囊能夠提高PMOP模型鼠的體重,降低BMD和BMAT,且TJCH組大鼠骨小梁數量、排列及髓腔內脂滴沉積接近于假手術組,提示藤黃健骨膠囊治療PMOP是有效的,但具體機制未明。

研究發現,破骨細胞因子主要屬于T輔助因子1(Th1)型,而T輔助因子2(Th2)型細胞分泌的細胞因子則可以抵消Th1型介導的炎癥反應對OC功能的影響[19-20]。IL-33作為一種新發現的Th2型細胞因子,一方面通過刺激OB成熟來減少OC生成[21];另一方面還可直接促進人單核細胞前體分化為OC,獨立誘導骨吸收[22]。相反,也有研究證明,IL-33還可通過激活T細胞胞質1核因子(NFATc1)的失活(FATc1是RANKL誘導的OC形成的關鍵調節因子)和RANKL途徑對OC分化發揮抑制作用[23]。此外,另有研究發現,IL-33也可通過誘導Th2細胞分泌IL-31,抑制RANKL依賴性OC生成,從而抵消骨丟失[24]。IL-31是一種主要由偏向Th2表型的活化CD45RO+T淋巴細胞產生的促炎細胞因子,主要誘導參與OC前體募集和免疫介導的骨吸收,對細胞增殖和組織重塑發揮多種調節作用[25-26]。以上結果表明,免疫調節分子IL-33通過調控IL-31的分泌來抑制OC生成,這種作用可能是通過RANKL軸來實現的。

現代研究證明,OPG/RANK/RANKL信號軸在調節PMOP的OB-OC成熟與分化,調控OB-OC動態平衡方面發揮著重要作用[27-28]。在骨組織中,由OB分泌的OPG是抑制骨吸收,增加皮質骨和松質骨密度、面積和骨強度的關鍵細胞因子[29]。RANK與OC及其前體細胞表面RANKL結合,是一種能夠促進OC成熟、分化和減慢其凋亡的關鍵細胞因子[29]。RANKL作為調控骨吸收的關鍵細胞因子,是OC分化、成熟的下游靶標分子[30]。而OPG作為RANKL高親和力誘餌樣受體,通過競爭結合RANKL,阻斷RANK與RANKL結合,影響RANK-RANKL途徑,使OC轉錄活化信號生成減少,從而抑制骨吸收,增加皮質骨和松質骨密度、面積和骨強度,維持骨代謝平衡[29]。絕經后女性因雌激素缺乏導致機體RANKL表達水平增高,OPG表達水平下降,促進RANKL與RANK的結合,OC收到RANK-RANKL途徑產生的轉錄活化信號,刺激前破骨細胞分化為OC,從而促進OC的形成、分化、成熟,致使骨吸收增加、骨組織損傷,最終誘發OP[31]。

另有研究發現,c-fos/NFATc1信號通路的激活對OC分化至關重要,c-fos、NFATc1蛋白的任一缺失將導致OC前體細胞無法分化為成熟的OC[32-33]。c-fos是骨細胞生長和分化的關鍵調節因子,在骨代謝相關疾病中對OB-OC動態平衡產生著重要影響[7-8]?；罨疶細胞c1核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFATc1)是NFAT家族成員之一,有研究證實,抑制NFATc1的蛋白表達可抑制去卵巢骨質疏松模型大鼠的OC分化,治療骨吸收過度導致的炎癥性骨病[9]。近年來研究也表明,NFATc1表達于哺乳動物的多種組織中,并發現其在免疫系統中發揮著重要調控作用[34]。

本研究結果發現,PMOP模型組大鼠體重、脂肪組織相對面積(BMAT)、血清IL-1、IL-31含量和股骨RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達、蛋白表達及蛋白表達灰度值均明顯增加,而BMD、血清IL-33含量、股骨OPG基因表達、蛋白表達及蛋白表達灰度值則均顯著降低。與上述文獻報道結果一致。而給予藤黃健骨膠囊干預后,結果發現,藤黃健骨膠囊能夠降低PMOP大鼠的體重、BMAT、血清IL-1和IL-31含量、股骨RANK、RANKL、c-Fos、NFATc1的基因表達、蛋白表達及蛋白表達灰度值,能夠升高其BMD、血清IL-33含量、股骨組織OPG基因表達、蛋白表達及蛋白表達灰度值。這些結果表明藤黃健骨膠囊通過提高PMOP模型大鼠免疫調控分子IL-33含量來抑制RANKL/c-fos/NFATc1骨代謝信號通路關鍵分子NFATC1的上調表達,進而抑制其破骨細胞分化,糾正骨代謝紊亂,從而促進絕經后骨質疏松的骨重塑。該項研究初步揭示了免疫調節分子IL-33對PMOP模型鼠RANKL/c-fos/NFATc1信號軸的調控機制及藤黃健骨膠囊的干預機制,并探尋了補腎活血方藤黃健骨膠囊防治骨質疏松的關鍵靶點IL-33和NFATc1,為藤黃健骨膠囊的臨床應用提供了實驗依據,也為骨質疏松癥的防治和藥物研發提供了新思路。

綜上,藤黃健骨膠囊治療PMOP的可能機制是免疫調節因子IL-33抑制了PMOP模型鼠RANKL/c-fos/NFATc1信號軸破骨細胞分化標志分子NFATc1的表達,從而發揮療效。但是由于藤黃健骨膠囊是一種復方制劑,存在多成分、多靶點的調節特點,其IL-33除了通過RANKL/c-fos/NFATc1信號軸對OC的分化起調控作用外,是否還可以通過調控其他的信號軸來同時調控OB增殖及成骨形成,目前尚未見相關研究。這或許是未來OP發病機制研究的一個方向,也可能成為藤黃健骨膠囊防治機制的研究熱點。