水栒子內生真菌群落結構及多樣性

呂增偉, 文國衛, 賴文峰, 施晨陽, 陳啟華, 劉益鵬, 黃秋良, 張國防

(福建農林大學林學院,福建 福州 350002)

內生菌(endophytic)主要包括內生真菌(edophytic fungi)、內生細菌、內生放線菌三大類微生物[1-3]。內生真菌是指生活史的某個階段或全部階段定殖于植物組織內部或細胞間隙,且不會引起植物組織出現明顯病害的一類微生物[4]。在自然界植物中,內生真菌廣泛存在,研究發現早在4.6億年前的植物化石中就有真菌孢子[5]。內生真菌是植物微生態系統的重要組成部分,與宿主植物在長期協同進化過程中形成了互惠、共生的關系[6-7]。內生真菌具有豐富的物種多樣性,普遍存在于植物的各個組織部位中,且不同組織中內生真菌種類的組成及結構不同[8-9]。研究[10-11]表明,內生真菌對宿主的生理、發育、健康等具有重大影響,可以刺激宿主植物發芽和生長,并且在調節宿主植物養分吸收和增強抗逆性等方面發揮重要作用。內生真菌中由次生代謝產物合成的基因簇能產生多種活性物質,如新型環肽抗生素[12]、角固醇[13]等,在抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促生長等方面發揮重要作用。近年來,基于真菌rDNA基因間隔區(internal transcribed spacer, ITS)的高通量測序技術被廣泛應用于內生真菌多樣性分析,具有成本低、通量高等優點[14-15]。采用高通量測序技術還可以檢測到植物組織中相對豐度較低的微生物[16]。

水栒子(CotoneastermultiflorusBunge)又稱多花栒子、栒子木、灰栒子等,常被作為城市園林綠化和荒山造林的綠化樹種,具有觀賞性強、適應性強、耐寒、耐干旱等特性[17]。水栒子的木質堅硬且彈性好,可作為砧木使用;其枝、葉及果實等多個部位含有豐富的多酚類物質,具有較高的開發和利用價值。目前,對于水栒子的研究主要集中在次級代謝產物[18-19]、繁殖育種[20-21]和植物群落多樣性[22-23]等方面。本研究采用高通量測序技術對水栒子不同組織的內生真菌進行鑒定,并進行多樣性分析,旨在揭示水栒子不同組織內生真菌群落的組成及多樣性,為水栒子及其有益內生真菌的利用與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水栒子采集地為寧夏回族自治區六盤山國家級自然保護區(東經106°09′—106°30′,北緯35°15′—35°41′)。采集時間:2022年9月20日。隨機選擇水栒子生長區,并設置5個10 m×10 m樣方(樣方間距大于100 m)。在每個樣方中隨機采摘1株3～5年生新鮮、健康且長勢較好的水栒子。采摘時將水栒子整株挖出。采集后的樣品用無菌塑封袋,帶回實驗室后進行分離、編號。莖部樣品編號:JYj1～JYj5。根部樣品編號:JYg1～JYg5。葉部樣品編號:JYy1～JYy5。

1.2 水栒子表面滅菌

先抖落水栒子表面的泥土,再用無菌水沖洗其根系上附著的土壤,用吸水紙吸干水分;用無菌剪刀將水栒子的根、莖和葉剪開、分離,放入體積分數為75%的乙醇中浸泡,1 min后取出,用無菌濾紙吸干表面酒精;再用體積分數為5%的次氯酸鈉浸泡,5 min后取出,吸干表面水分;最后,用體積分數為75%的乙醇浸泡30 s,用無菌水漂洗3次,用無菌濾紙吸干表面水分。滅菌完成后,取200 μL無菌水均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar, PDA)平板,置于恒溫培養箱中,25 ℃下培養5～7 d。平板中無菌落生成,表明水栒子表面已徹底消毒,可以進行后續試驗。

1.3 水栒子內生真菌DNA的提取與純化

使用OMEGA土壤DNA試劑盒(型號M5635-02)提取水栒子內生真菌總基因組DNA,用NanoDrop NC 2000分光光度計(賽默飛世爾科學公司產品)和瓊脂糖凝膠電泳儀測定DNA的數量和質量。

1.4 水栒子內生真菌測序

將檢驗合格的內生真菌DNA用真菌ITS 1(b)區特異性引物[ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)]擴增;用Vazyme DNA清潔珠純化PCR擴增產物,再用瓊脂糖凝膠電泳儀檢測PCR產物的純化效果;用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒進行定量,最后根據定量結果構建文庫。利用Illumina NovaSep6000-PE250高通量測序平臺對15個水栒子內生真菌樣本進行測序。

1.5 數據處理與分析

基于UNITE數據庫,對可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)的代表序列進行物種注釋、分析,獲得每個OTUs的分類學信息,并構建稀釋性曲線[24]。利用R腳本、VennDiagram包制作OTUs韋恩圖。利用QIIME2軟件、R語言的ggplot2包進行Alpha多樣性指數(Chao1、Observed species、Shannon、Simpson、Faith′s PD、Pielou′s evenness、Pielou′s evenness、Good′s coverage)[25-29]的計算,并繪制箱線圖。采用QIIME2軟件與自編的perl腳本等分析微生物群落多樣性圖譜。利用R語言的pheatmap包繪制物種聚類熱圖。使用R語言的ggtree包、Python的LEfSe包等進行LEfSe分析。

2 結果與分析

2.1 水栒子不同組織內生真菌的測序結果

每個樣品至少產生82 845條質控序列;樣品質控序列的平均值為95 627條。采用物種數、Chao1及Shannon指數繪制稀釋曲線(圖1),由圖1可知,隨著測序數量的增加,稀釋曲線趨向平緩,表明測序數據可以代表樣品內生真菌種群所有序列,測序結果能夠較好地反映水枸子內生真菌的群落結構和多樣性。

圖1 水栒子根、莖、葉樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of samples from root, stem and leaf of C.multiflorus

Venn圖常用于統計多個樣本中所共有或獨有的OTUs數,可反映樣本OTUs數目組成的相關性及重疊情況。從圖2可知,從水栒子根、莖和葉中檢測到的共有OTUs為97個。其中,根部與莖部共有的OTUs為27個,根部與葉部共有的OTUs為27個,葉部與莖部共有的OTUs為142個。根部、葉部與莖部特有的OTUs分別為294、279、331個,分別占總OTUs的32.52%、30.86%和36.62%。

圖2 真菌OTUs分布的Venn圖Fig.2 Venn diagram of fungal OTUs

2.2 水栒子不同組織內生真菌群落的多樣性和豐富度

為了能較全面地評估水栒子內生真菌群落的Alpha多樣性,采用Chao1和Observed species指數來表征內生真菌群落的豐富度;采用Shannon和Simpson指數來表征內生真菌群落多樣性;采用Faith′s PD指數來表征內生真菌群落基于進化的多樣性;采用Pielou′s evenness指數來表征內生真菌群落的均勻度;采用Good′s coverage指數表征內生真菌群落的覆蓋度,結果如圖3所示。從圖3可知,根和葉內生真菌群落的Good′s coverage指數(圖3B)存在顯著差異,表明根部內生真菌群落的覆蓋度顯著大于葉部。Shannon指數(圖3C)、Simpson指數(圖3D)不存在顯著差異,但莖部內生真菌群落的這兩個指數大于根和葉,說明莖部內生真菌群落的多樣性高于根、葉,但不存在顯著差異。Pielou′s evenness指數(圖3E)、Observed species指數(圖3F)和Chao1指數也不存在顯著差異,但莖部內生真菌群落的Pielou′s evenness指數、Observed species指數和Chao1指數均高于根和葉,說明莖部內生真菌群落的均勻度和豐富度比根、葉好。由此可知,根部具有較高的內生真菌群落覆蓋度,莖部內生真菌群落的均勻度和豐富度比根、葉好。

A:Chao1指數;B:Good′s coverage指數;C:Shannon指數;D:Simpson指數;E:Pielou′s evenness指數;F:Observed species指數。

2.3 水栒子不同組織內生真菌的群落結構

2.3.1 門水平的群落結構 在門水平上,水栒子不同組織內生真菌主要歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、Calcarisporiellomycota、羅茲菌門(Rozellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)(圖4)。子囊菌門(Ascomycota)在根、莖、葉中的相對豐度分別為41.65%、22.29%和10.16%;擔子菌門(Basidiomycota)的相對豐度分別為6.78%、0.77%和4.13%;其他菌門的相對豐度較低。由此可見,子囊菌門是水栒子根、葉、莖中的優勢真菌類群。

圖4 水栒子不同組織內生真菌門水平的群落結構Fig.4 Community structure of endophytic fungi in different tissues of C. multiflorusl at the phylum level

2.3.2 目水平的群落結構 在目水平上,水栒子不同組織內生真菌相對豐度排名前15的菌目主要有柔膜菌目(Helotiales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、煤炱目(Capnodiales)、刺盾炱目(Chaetothyriales)、線黑粉菌目(Filobasidiales)、紅菇目(Russulales)、銀耳目(Tremellales)、炭角菌目(Xylariales)、肉座菌目(Hypocreales)、Sebacinales、座囊菌目(Dothideales)、傘菌目(Agaricales)、外囊菌目(Taphrinales)、球囊霉目(Glomerales)、擔孢酵母目(Erythrobasidiales)(圖5)。其中:根部相對豐度大于1%的菌目有柔膜菌目(20.72%)、紅菇目(2.10%);莖部相對豐度大于1%的菌目有格孢腔菌目(7.60%)、煤炱目(8.84%)、刺盾炱目(3.47%)、炭角菌目(1.23%);葉部相對豐度大于1%的菌目有格孢腔菌目(5.72%)、煤炱目(2.29%)、線黑粉菌目s(2.48%)、銀耳目(1.12%)。由此可知,柔膜菌目為根部的優勢菌目,格孢腔菌目和煤炱目為莖部的優勢菌目,格孢腔菌目為葉部的優勢菌目。

圖5 水栒子不同組織內生真菌目水平的群落結構Fig.5 Community structure of endophytic fungi in different tissues of C. multiflorus at the order level

2.3.3 屬水平的群落結構 在屬水平上,水栒子不同組織內生真菌相對豐度排名前15的菌屬主要有Spirosphaera、Anguillospora、亞隔孢殼屬(Didymella)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、Arthrocatena、棘殼孢屬(Pyrenochaeta)、刺孢菌屬(Subulicystidium)、Allophaeosphaeria、盤雙端毛孢屬(Seimatosporium)、Tetracladium、Pseudoophiobolus、異莖點霉屬(Paraphoma)、Cadophora、Knufia、球腔菌屬(Mycosphaerella)(圖6)。其中:根部相對豐度大于1%的菌屬有Spirosphaera(8.89%)、Anguillospora(7.92%)、刺孢菌屬(2.10%)、Tetracladium(1.14%);莖部相對豐度大于1%的菌屬有亞隔孢殼屬(2.52%)、Arthrocatena(2.19%)、Allophaeosphaeria(1.35%)、盤雙端毛孢屬(1.21%)、Pseudoophiobolus(1.10%);葉部相對豐度大于1%的菌屬有線黑粉酵母屬(2.47%)、棘殼孢屬(2.05%)。由此可知:根部的優勢菌屬(相對豐度>2.00%)為Spirosphaera、Anguillospora、刺孢菌屬;莖部的優勢菌屬(相對豐度>2.00%)為亞隔孢殼屬、Arthrocatena;葉部的優勢菌屬(相對豐度>2.00%)為線黑粉酵母屬、棘殼孢屬。

圖6 水栒子組織內生真菌屬水平的群落結構Fig.6 Community structure of endophytic fungi in different tissues of C. multiflorus at the genus level

2.3.4 群落結構熱圖 為了進一步比較水栒子不同組織內生真菌的組成差異和物種豐度分布,選取內生真菌群落豐度排名前15的屬構建群落結構熱圖(圖7)。由圖7可知,根部內生真菌單獨聚為一個分支,而莖部和葉部的內生真菌聚為一個分支,說明莖部和葉部的內生真菌組成相似,與根部內生真菌組成有較大差異。根部的優勢菌屬為Subulicystidium、Tetracladium、Cadophora、Spirosphaera、Anguillospora;莖部的優勢菌屬為Pseudoophiobolus、Seimatosporium、Arthrocatena、Knufia、Didymella、Allophaeosphaeria;葉部的優勢菌屬為Paraphoma、Filobasidium、Pyrenochaeta。由此可知,水栒子不同組織內生真菌的群落組成及相對豐度有所差異,根部和莖部種、屬水平真菌的相對豐度高于葉部,具有更高的多樣性。

圖7 水栒子不同組織內生真菌的結構熱圖Fig.7 Thermal diagram of structure of endophytic fungi in different tissues of C. multiflorus

2.4 水栒子根、莖、葉內生真菌的差異類群

基于LEfSe分析可得到水栒子組織樣品真菌群落中具有統計學差異的物種,并識別莖、葉和根的生物標記物(圖8)。由圖8可知,在水栒子根、莖、葉組織中獲得1個門、6個綱、5個目、5個科、3個屬的真菌指示類群。顯著性檢驗結果表明,水栒子根、莖、葉內生真菌在某些菌群上存在顯著差異。檢測到的水栒子根部內生真菌的指示類群較多,有1個門、3個綱、2個目、1個科、1個屬,指示性較強的有擔子菌門、Leotiomvcetes、傘菌綱(Agaricomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、柔膜菌目、柔膜科(Helotiaceae)、柔膜菌目(未定名)、球旋霉屬(Spirosphaera);莖部共檢測到2個綱、3個目、2個科、1個屬,指示性較強的有座囊菌綱(Dothideomycetes)、Eurotiomycetes、刺盾炱目、煤炱目、格孢腔菌目、亞隔孢殼科(Didymellaceae)、煤炱目(未定名)、Arthrocatena;葉部共檢測到1個綱、1個目、1個科、1個屬,指示性較強的有銀耳綱(Tremellomycetes)、線黑粉菌目、線黑粉菌科(Filobasidiaceae)、線黑粉酵母屬。

圖8 基于LEfSe的水栒子根、莖、葉內生真菌群落差異分析Fig.8 Species difference analysis of endophytic fungal communities in root, stem and leaf of C. multiflorus by LEfSe

3 討論

植物體內存在的內生真菌能夠抑制病原菌生長[30],促進植物生長[31],增強植物抗逆性[32],促進植物次生代謝產物的合成[33]。傳統的組織塊分離法是植物內生真菌多樣性研究的主要方法之一,但此方法獲得的植物內生真菌種類較少,且不能反映植物內生真菌的真實狀況[34]。隨著分子技術的發展,出現了基于分子生物學研究技術的非培養方法,打破了傳統分離方法的局限性,可以對一些不可培養或不產孢、難產孢的內生真菌進行鑒定[35]。

本研究采用高通量測序技術對水栒子不同組織內生真菌的多樣性與群落結構進行分析,結果表明水栒子不同組織的內生真菌具有豐富的種群多樣性。從門水平上來看,水栒子內生真菌主要是由子囊菌門組成。McInroy et al[36]研究發現,大多數植物內生真菌是以子囊菌門為主,與本研究結果一致。已有的研究結果表明子囊菌門的大多數真菌為腐生菌,具有生長快、分布廣、易于在各種環境中存活,以及較強的耐受性和較廣的生態位等特點[37],能有效降解木質素等難分解物質,在養分循環中起重要作用[38]。在目水平上,煤炱目為莖部的優勢菌目,柔膜菌目為根部的優勢菌目,格孢腔菌目為莖、葉部的優勢菌目。研究[38]發現,煤炱目是植物中普遍存在的內生真菌,與本研究結果一致。柔膜菌目和格孢腔菌目內生真菌能引起植物病害,使植物出現葉斑、莖枯、潰瘍和腐爛等癥狀[39],但本研究中所采集的樣品沒有出現上述病癥?？赡苁且驗樗畺兆芋w內不存在格孢腔菌目和柔膜菌目致病菌,或其他生防菌對這兩個菌目的真菌具有抑制作用。在屬水平上,Spirosphaera、Anguillospora、刺孢菌屬為根部的優勢菌屬;亞隔孢殼屬、Arthrocatena為莖部的優勢菌屬;線黑粉酵母屬、棘殼孢屬為葉部的優勢菌屬。研究[40]發現,大多植物內生真菌在與植物長期協同進化過程中產生與宿主植物相同或相似的代謝產物。水栒子體內富含多聚花青素、黃酮類等豐富的次生代謝產物[40]。研究[41]發現,亞隔孢殼屬內生真菌的次生代謝產物具有抗氧化、抗腫瘤細胞等生物活性,這類真菌的存在可能與水栒子豐富的次生代謝產物有關。

土壤和空氣中的真菌通過不同方式定殖于各類植物細胞內或細胞間隙,在長期的進化過程中還與宿主植物形成了特殊的生態關系,導致不同組織內生真菌的群落組成存在一定差異[42]。本研究中,根部內生真菌群落結構組成與莖和葉存在較大差異,根部內生真菌類群較為豐富,莖部次之,葉部最差。當水栒子根部與土壤密切接觸時,土壤中的真菌會從根外部進入到根內部,使得水栒子根部呈現出較其他組織更為豐富的內生真菌類群[43-44],這與本研究結果一致。本研究利用LEfSe分析水栒子不同組織內生真菌顯著差異的指示類群,發現不同組織的顯著指示類群存在顯著差異,可能是因為內生真菌對不同組織表現出不同的偏好性,這與肖方南等[45]研究結果一致。本研究中,根部的顯著指示類群為球旋霉屬,莖部的顯著指示類群為Arthrocatena,葉部的顯著指示類群為線黑粉酵母屬。研究[46]發現,線黑粉酵母屬真菌多為絲狀黑粉菌,屬擔子菌門,其菌株可產生淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、幾丁質酶和油脂等,在水栒子的有機物分解和養分循環中發揮重要作用。

4 小結

本研究利用高通量測序技術對水栒子不同組織內生真菌進行鑒定與分析,共獲得1 197個OTUs。葉、莖和根內生真菌的種群結構有所不同。在門水平上,葉、莖和根的優勢真菌均為子囊菌門;在目水平上,柔膜菌目為根部優勢菌目,格孢腔菌目和煤炱目為莖部的優勢菌目,格孢腔菌目為葉部優勢菌目;在屬水平上,根部優勢菌屬為Spirosphaera、Anguillospora、刺孢菌屬,莖部優勢菌屬為亞隔孢殼屬、Arthrocatena,葉部優勢菌屬為線黑粉酵母屬、棘殼孢屬?；贚EfSe分析發現,在屬水平上,水栒子不同組織內生真菌均具有顯著指示類群。其中,根部內生真菌顯著指示類群為球旋霉屬,莖部顯著指示類群為Arthrocatena,葉部顯著指示類群為線黑粉酵母屬。