薰衣草精油緩釋固體分散體的制備及其體外釋藥性能研究

王園園，顧志榮，郭 燕，毛小文，葛 斌

（1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000）

薰衣草精油（Lavender essential oil，LEO）是薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）的主要有效成分，是由多種小分子化合物組成的具有揮發性的復雜混合物［1］。薰衣草及LEO 目前尚未被2020 年版《中國藥典》收載，但薰衣草收載于《中華本草》《中華人民共和國衛生部藥品標準-維吾爾藥分冊》及《維吾爾藥材標準》，具有消散寒氣，益胃健腦，燥濕止痛之功效，同時也收載于《歐洲藥典》及《美國藥典》中［2-5］。LEO 的化學成分主要為芳樟醇、乙酸芳樟酯、1，8-桉葉素、萜品烯-4-醇、羅勒烯、乙酸香葉酯等，其中以芳樟醇與乙酸芳樟酯含量最高［6］。目前對于LEO的研究熱點主要集中在其神經系統藥理作用與治療價值方面，如改善睡眠障礙、抗焦慮、抗抑郁、抗狂躁、影響內分泌、治療偏頭痛及神經性疼痛等［7-8］。此外，LEO 還具有抗氧化、解痙、鎮痛、抗菌、抗腫瘤、抗突變等作用［5］。國內外對LEO 主要采用吸入療法與透皮吸收療法，用于改善睡眠，緩解焦慮、抑郁及頭痛，其中采用吸入療法治療睡眠障礙使用尤多，多做成含有薰衣草的枕頭、香包、粉劑等，但存在療效不確切，難以量化控制，作用機制不明，攜帶不便等問題［9］。因此，開發一種安全有效、穩定可控、適于口服、作用持久的治療失眠的現代LEO新制劑，對于解決上述問題具有實際意義。本研究首次嘗試以硬脂酸、PEG 6000和單硬脂酸甘油酯為輔料制備LEO固體分散體，并考察其體外釋藥性能，以提高LEO溶出，達到緩釋效果，長效改善睡眠。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

890B GC-5977A MSD 型GC-MS 聯用儀，配備氫火焰離子化檢測器（FID），DB-5MS 毛細管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），Chemstation 化學工作站（美國Agilent公司）；AL204 型萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DZF-6090 型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；RCZ-8M 溶出試驗儀（天津天大天發科技有限公司）；pHS-3C 型酸度計（上海越平科學儀器有限公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料

LEO，購自廣州科然精油原料有限公司（精油濃度 ≥ 98%，陰涼遮光保存）；對照品芳樟醇（CHB210217）、乙酸芳樟酯（CHB210623），純度均 ≥ 98%，均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；藥用級輔料單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇6000、硬脂酸，均符合2020年版《中國藥典》標準；丙酮、環己酮，均為色譜純，均購于天津大茂化學試劑廠；實驗用水均為蒸餾水。

2 方法

2.1 LEO 及固體分散體中芳樟醇和乙酸芳樟酯含量測定

2.1.1 GC-MS分析條件

色譜柱為DB-5MS 毛細管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），程序升溫（起始溫度50℃，保持5 min，以2℃/min 升高至100℃，再以3℃/min 升高至150℃，再以8℃/min升高至250℃），載氣為氦氣（99.99%），流速為1 mL/min，進樣量為0.4 μL，分流比為60 ∶ 1，進樣口溫度為250℃。采用電子轟擊離子源（EI），電子能量為70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為250℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍30 ~ 500m/z。

2.1.2 標準儲備液配制

分別取芳樟醇和乙酸芳樟酯96.4 mg、52.3 mg，置于10 mL容量瓶中，以丙酮溶解并定容至刻度，配制成濃度分別為9.64 mg/mL、5.23 mg/mL 的混合標準儲備液。

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱取樣品15 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入環己酮1 mL，以丙酮定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察

依次取上述標準貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別加入10 μL 環己酮作為內標，再以丙酮定容至1 mL容量瓶中，采用“2.1.1”項下條件測定，記錄峰面積。

2.1.5 精密度試驗

取同一批樣品，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，采用“2.1.1”項下條件連續進樣6 次，記錄峰面積。

2.1.6 重復性試驗

取同一批樣品6 份，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，采用“2.1.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積。

2.1.7 穩定性試驗

取同一批樣品，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，分別于0、2、6、8、12 h 按“2.1.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知芳樟醇和乙酸芳樟酯含量的樣品，分別加入芳樟醇和乙酸芳樟酯對照品適量，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項下條件進樣測定，計算回收率。

2.1.9 溶出度測定

精密稱取LEO 原料與緩釋固體分散體分別裝于膠囊中，置于900 mL磷酸鹽緩沖液（pH = 7.2）中，采用2020 年版《中國藥典》四部規定的“第二法（槳法）”［10］測定，轉速50 r/min，水浴溫度（37 ± 0.5）℃，分別在0.5、2、4、6、8、12 h 各取樣2 mL，同時補充等體積、同溫新鮮介質，所取樣品經0.45 μm 微孔濾膜過濾，自取樣至濾過在30 s內完成，取續濾液，蒸干，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下條件進行測定，計算累積溶出度。

2.2 正交試驗優化LEO 緩釋固體分散體的處方配比

2.2.1 單因素考察

以硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 單硬脂酸甘油酯 ∶LEO = 3 ∶ 4 ∶ 1 ∶ 1 為基準，使其中1 個因素水平變化，其他2個因素水平固定，進行單因素考察。選擇硬脂酸/LEO 用量比值（A）、PEG 6000/LEO 用量比值（B）、單硬脂酸甘油酯/LEO 用量比值（C）作為影響因素，以芳樟醇和乙酸芳樟酯總量的累積溶出度（P）為綜合評價指標，累積溶出度設3 個考察點P2、P6、P12，分別指2、6、12 h 的累積溶出度，P2、P6、P12分別以30%、65%、90%為標準，則P= 100 - |P2- 30%|- |P6- 65%| - |P12- 90%|，P值越高，表明與所定的標準趨勢越接近［11］。

2.2.2 正交試驗設計優化處方配比

根據單因素考察結果，A、B、C 等3 個因素各選定3 個水平，按照L9（34）正交表設計試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Tab. 1 Table of design factors for orthogonal test

2.2.3 工藝驗證

采用優化出的最佳處方配比制備3批LEO固體分散體，按照“2.1.9”項下方法測定各時間點的P。

2.3 LEO緩釋固體分散體的體外釋藥模型擬合

分別采用零級方程、一級方程、Higuchi 方程、Ritger-Peppas 模型等4 種模型，對12 h 內累積溶出度（P）與釋藥時間（t）進行曲線擬合，采用擬合系數r判斷其擬合程度，r越接近于1擬合越優［12］。

3 結果與分析

3.1 方法學考察

3.1.1 線性關系考察

以進樣量為橫坐標（X），芳樟醇、乙酸芳樟酯與內標物的峰面積比值為縱坐標（Y），繪制工作曲線，計算回歸方程及相關系數r，見表2，總離子流圖（Total ion chromatogram， TIC）見圖1。

圖1 芳樟醇、乙酸芳樟酯和環己酮TIC圖Fig.1 TIC diagram of linalool， linalyl acetate and cyclohexanone

表2 芳樟醇和乙酸芳樟酯的回歸方程Tab. 2 Regression equation of linalool and linalyl acetate

3.1.2 精密度試驗

芳樟醇、乙酸芳樟酯與內標物峰面積比值的RSD分別為1.63%、1.37%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復性試驗

芳樟醇、乙酸芳樟酯與內標物峰面積比值的RSD分別為2.34%、2.65%，表明該方法重復性良好。

3.1.4 穩定性試驗

芳樟醇、乙酸芳樟酯與內標物峰面積比值的RSD 分別為2.82%、2.26%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

3.1.5 加樣回收率試驗

芳樟醇和乙酸芳樟酯的平均加樣回收率分別為96.86%和103.41%，RSD分別為2.41%和2.27%。

3.2 單因素試驗

當硬脂酸/LEO 用量比值、PEG 6000/LEO 用量比值、單硬脂酸甘油酯/LEO 用量比值分別為3 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1 時P最大，結果見圖2 ~ 4，故依此設計正交試驗的因素水平。

圖2 因素A對P的影響Fig.2 The influence of factor A on P

圖3 因素B對P的影響Fig.3 The influence of factor B on P

圖4 因素C對P的影響Fig.4 The influence of factor C on P

3.3 正交試驗

正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。結果表明，各因素對LEO 緩釋固體分散體P影響大小順序為B > C > A，最佳處方工藝為A2B2C2，即硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 單硬脂酸甘油酯 ： LEO = 3 ∶ 5 ∶1 ∶ 1。

表3 正交試驗結果Tab. 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab. 4 Resultsof variance analysis

3.4 工藝驗證

由圖5 可知，各時間點P值的RSD 均 < 3%，表明所優選的處方配比工藝穩定、可靠，所制得的緩固體分散體釋放速度適宜，在體外能夠持續釋藥12 h，達到了良好的緩釋效果，其2 h 的平均釋放度為33.43%，6 h 的平均釋放度為68.87%，12 h 的平均釋放度為92.91%。

圖5 3批LEO固體分散體的體外釋藥曲線Fig.5 Releasecurves of three batches of LEO solid dispersions in vitro

3.5 LEO緩釋固體分散體制備工藝

采用熔融法制備，將硬脂酸、PEG 6000、單硬脂酸甘油酯按照3 ∶ 5 ∶ 1 的配比置于70℃烘箱中，待完全熔融后滴加與單硬脂酸甘油酯同比例的LEO，充分攪拌以混合均勻，然后迅速傾倒于冰浴不銹鋼板上，涂成薄層，置冰箱中于-20℃冷卻6 h，用藥勺刮掉凝結的固體分散體，置真空干燥器中充分干燥，待脆化后研細，過80 目篩，即得［13-14］。

3.6 LEO緩釋固體分散體的體外釋藥模型擬合

如表5 所示，一級模型擬合系數r最接近于1，表明一級釋藥模型擬合度最高。

表5 LEO固體分散體的體外釋藥模型擬合Tab.5 Release model fitting of LEO solid dispersions in vitro

4 討論

4.1 LEO治療失眠的作用機制

薰衣草是蒙醫及中醫的常用藥材，其有效成分是LEO，目前主要采用芳香吸入法治療睡眠障礙，在民間尤其流行。LEO 能夠使實驗動物自主活動受到抑制，睡眠時長延長，睡眠潛伏期縮短，但治療睡眠障礙的分子機制至今尚未完全闡釋清楚［15］，其機制可能是通過干擾5-HT 信號通路和GABA 能信號通路來發揮治療失眠的作用［16］。5-羥色胺（5-HT）是一種作用于睡眠-覺醒周期的重要單胺類物質，是一種能促進睡眠的神經遞質［17］。有研究表明［18-19］，薰衣草精油組與模型組相比，薰衣草精油組小鼠腦內5-HT 含量均顯著增加，存在極顯著差異，而DA、NE 含量均顯著減少，存在極顯著差異。因此是通過增加腦內5-HT、減少NE 和DA 來達到治療失眠的目的。GABA是中樞神經中最重要的抑制性神經遞質，能夠調節正常狀態下的睡眠-覺醒周期，通過神經沖動傳遞至下丘腦和腦干中，抑制該部位控制覺醒的基因的表達，從而改善失眠［20］。有實驗結果顯示，薰衣草精油組、輕組分組、芳樟醇組均可使大鼠腦內GABA 水平增加，從而增加抑制作用，改善失眠作用［21］。

4.2 體外釋放考察的評價指標選取

目前研究認為，LEO 中最主要的活性成分為芳樟醇、乙酸芳樟酯、1，8-桉葉素等，其中又以芳樟醇、乙酸芳樟酯含量最高，該2 種成分含量越高則LEO 的品質越好。因此，本研究建立GC-MS 法測定芳樟醇、乙酸芳樟酯含量的方法，作為體外釋放考察的評價指標。

4.3 輔料的選取

本研究在文獻調研的基礎上，選擇硬脂酸、PEG 6000 及單硬脂酸甘油酯作為LEO 緩釋固體分散體的制劑輔料。硬脂酸與PEG 6000成形性較好，對油脂類藥物的吸收較好，價廉易得，但也存在水溶性較強，溶蝕性能欠佳，藥物釋放速度難以調節的問題，不利于形成固體分散體的緩釋性能。因此選擇一種不溶于水的W/O 型輔助乳化劑——單硬脂酸甘油酯配合使用，不僅能夠增加基質的整體穩定性，增加硬脂酸與PEG 6000 在水中的溶蝕能力，而且能夠調節藥物釋放的速度，且密度較大可使制備更加容易。

5 結論

本研究先采用單因素考察，在此基礎上采用L9（34）正交試驗設計優化處方配比，所得最佳配比為硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 單硬脂酸甘油酯 ∶ LEO = 3 ∶5 ∶ 1 ∶ 1，三者按照該比例配合使用，是制備LEO 緩釋固體分散體的理想選擇，所制得的緩固體分散體釋放速度適宜，在體外能夠持續釋藥12 h，達到了良好的緩釋效果。并通過零級方程、一級方程、Higuchi 方程、Ritger-Peppas 等4 種模型對體外釋藥進行擬合，其溶出動力學符合一級動力學模型。該實驗所優選的處方配比工藝穩定可靠，所得緩釋固體分散體能顯著改善藥物溶出，為其工業化生產奠定了基礎。