雞蛋參多糖提取工藝優化及其抗氧化活性研究

喻本霞，瞿顯友，江維克

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.重慶市中藥研究院 中藥資源學重慶市重點實驗室，重慶 400065）

雞蛋參是桔?？疲–ampanulaceae）黨參屬（CodonopsisWall.）植物雞蛋參（Codonopsis convolvulaceaKurz）的干燥塊莖，藏藥名為“尼哇”。味甘、微苦、澀，性微涼，具有生津清熱、補養氣血、健脾的功效，可以用于治療感冒，咳嗽，扁桃體炎，胸痛，食欲不振等［1-3］。雞蛋參及其變種分布于西藏南部、四川西部、云南、貴州等地，野生資源為主。在藏區以及云南等民族地區使用，民間常與雞肉或豬肉燉食，制成補肺藥膳、養心藥膳以及產后體虛藥膳，用于病后、產后體虛、肺結核、心悸等［4-5］。雞蛋參主要含糖類和少量生物堿、植物甾醇、苷類等化學成分［6-11］。近年來，多糖因其來源廣泛和安全性，在食品和醫藥行業中成為研究熱點，其多種生物活性比如抗氧化、免疫調節、抗炎、保肝、抗腫瘤、抗高脂血癥、改善記憶、抗衰老已得到證實［12-15］。雞蛋參多糖含量較高，具有較高開發利用價值。

植物多糖因其理化性質可采用水提醇沉法進行提取，此法操作相對簡單，且能夠擴大化生產，研究發現不同提取工藝所得多糖無論從量上還是質上都存在一定差異［16］，多糖要進行深入研究就需先明確提取工藝。本研究采用水提醇沉法對雞蛋參多糖進行提取，采用響應面法優化提取工藝，然后再進一步探究最優工藝條件下獲得的雞蛋參多糖的抗氧化活性［17］，以期為雞蛋參開發利用提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器

UV-2600 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Infinite M200 PRO 酶標儀（瑞士帝肯公司）；AB204-S 高精度電子分析天平（梅特勒-托利多貿易（上海）有限公司）；KB-900 智能脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）等。

1.2 試劑與試驗藥材

無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸購自重慶川東化工（集團）有限公司，維生素C、葡萄糖、PBS 緩沖液購自上海源葉生物科技有限公司，2，2′-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、硫酸亞鐵、苯酚購自上海麥克林生化科技股份有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、雙氧水（3%）購自金克?。ū本┥锛夹g有限公司，純水為實驗室自制。雞蛋參藥材購自四川瀘定，經重慶市中藥研究院瞿顯友主任中藥師鑒定為雞蛋參。

2 方法

2.1 多糖的制備

2.1.1 藥材脫脂處理

新鮮的雞蛋參塊莖切成薄片，在60℃下烘干，粉碎，過50 目篩，得雞蛋參藥材粗粉，加入10 倍量95%乙醇，密封后磁力攪拌浸泡過夜。次日先用紗布過濾收集粗粉，再減壓過濾收集細粉，粗細粉混勻后于40℃下低溫烘干，得經脫脂處理的雞蛋參藥材粗粉，備用。

2.1.2 多糖的提取

稱取0.20 g經脫脂處理的雞蛋參藥材粗粉于具塞錐形瓶中，經熱水浸提后，在5 000 r/min下對提取液進行離心5 min，重復離心2 次，在65℃下對上清液進行旋轉蒸發濃縮，直至濃縮液與原藥材質量比為2 mL/g，快速攪拌下緩慢加入4倍量無水乙醇，密封，5℃冷藏過夜，倒去上清液，沉淀用乙醇、乙醚、丙酮洗滌，各重復2 次，反復以離心的方式進行分離，于40℃下低溫烘干，得雞蛋參多糖。

2.2 多糖的含量測定

2.2.1 繪制標準曲線

將葡萄糖對照品烘干至恒重，取出，置干燥器內放冷。稱取上述葡萄糖20 mg 于100 mL 容量瓶中，加入純水充分溶解后定容，得葡萄糖對照溶液。分別吸取上述對照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于具塞試管內，加入純水至1.0 mL，加入1.0 mL 新鮮配置的4.5%苯酚溶液混勻后，快速加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，加塞，在100℃下水浴20 min，取出，冰水浴5 min，超聲30 s，測定在485 nm 處吸光度。以純水代替葡萄糖對照溶液為空白對照。

2.2.2 待測溶液制備

按照2.1.2項下進行提取，精密吸取適量上清液稀釋一定濃度后，即得待測溶液。

2.2.3 雞蛋參多糖提取率的計算

按式（1）計算雞蛋參多糖提取率：

其中，N為提取液稀釋倍數；C為檢測樣品液多糖濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；W為經脫脂處理雞蛋參粉末的稱取量（mg）。

2.3 雞蛋參多糖提取條件單因素實驗

精密稱取經脫脂處理的雞蛋參粗粉0.20 g，考察條件為提取時間、液料比、提取溫度，60 min、40 mL/g、90℃設定為基本試驗條件，考察提取時間30、60、90、120、150 min、液料比20、30、40、50、60 mL/g、提取溫度60、70、80、90、100℃的多糖提取率，每次變動一個條件，研究以上3個因素對雞蛋參多糖提取率的影響。按照2.2 項下測定雞蛋參多糖提取率。

2.4 響應面法優化雞蛋參多糖提取工藝

根據所報道的方法［18］，運用Design-Expert 13軟件設計實驗方案。各因素變量范圍根據單因素實驗確定，選取提取液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3個因素作為響應變量，以雞蛋參多糖提取率為響應值，按照Box-Behnken 原理進行響應面設計，各因素及其實驗水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面實驗設計因素和水平表Tab.1 Variables and levels in the Box-Behnken experimental design

2.5 雞蛋參多糖體外抗氧化活性

2.5.1 測定雞蛋參多糖對DPPH 自由基的清除能力

參考紀旭光等的方法稍作修改［16，19］，稱取8 mg DPPH 于10 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容，得2 mmol/L 的DPPH 溶液。稱取雞蛋參多糖40 mg 于10 mL 容量瓶中，用純水定容，得4 mg/mL 的雞蛋參多糖溶液，依次將雞蛋參多糖溶液稀釋為2.00、1.00、0.50、0.25、0.13 mg/mL。將上述不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入100 μL 于96 孔酶標板內，隨后加入等體積DPPH 溶液，充分混勻后，避光反應30 min，測定反應液在517 nm 的吸光值A2。用純水代替多糖溶液作為空白組，其吸光度記為A0；用無水乙醇代替DPPH 溶液作為參照組，其吸光度記為A1。以相同濃度VC 溶液與DPPH 溶液反應作陽性對照。按式（2）計算DPPH自由基清除率：

2.5.2 雞蛋參多糖對ABTS自由基的清除能力

參考李鳳偉等［20］的方法稍作修改，稱取6.62 mg過硫酸鉀和 38.41 mg ABTS 分別置于10 mL 棕色容量瓶中，用純水定容，得到2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液和7 mmol/L 的ABTS 溶液，2 者等量混勻后在30℃下暗處反應12 h 后，用PBS 緩沖液稀釋25 倍，得ABTS 自由基溶液，現配現用。將2.5.1 項下不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入50 μL 于96 孔酶標板內，隨后加入150 μL ABTS 自由基溶液，混勻，靜置10 min，用酶標儀測定反應液在734 nm 的吸光值A1。用純水代替多糖溶液，其吸光度記為A0。以相同濃度VC 溶液與ABTS 自由基溶液反應作陽性對照。按式（3）計算ABTS自由基清除率：

2.5.3 測定雞蛋參多糖對羥基自由基的清除能力

參考杭華等［21］的方法稍作修改，稱取15.29 mg硫酸亞鐵、12.43 mg 水楊酸、吸取100 μL 3%雙氧水分別置于10 mL 容量瓶中，硫酸亞鐵和雙氧水用純水定容，水楊酸用無水乙醇定容，得到9 mmoL/L 的硫酸亞鐵溶液、9 mmoL/L 的水楊酸乙醇溶液以及8.8 mmoL/L的雙氧水溶液，現配現用。將2.5.1項下不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入50 μL 于96 孔酶標板內，隨后加入50 μL 硫酸亞鐵溶液和50 μL水楊酸乙醇溶液，搖床上振搖反應10 min，隨后加入50 μL 雙氧水溶液，于37℃下反應30 min，測定反應液在510 nm 的吸光值A2。用純水代替多糖溶液作為空白組，其吸光度記為A0；用純水代替雙氧水溶液作為參照組，其吸光度記為A1。以相同濃度VC溶液代替多糖溶液反應作陽性對照。按式（4）計算羥基自由基清除率：

2.6 數據處理

應用GraphPad Prism 9.0.2 軟件進行數據處理和繪圖。差異顯著性分析、回歸分析以及響應曲面圖繪制均采用Design-Expert 13軟件進行。

3 結果與分析

3.1 多糖的制備

經過水提醇沉后可得到雞蛋參多糖，該多糖為淺黃色粉末，質地蓬松，流動性好，無甜味，無氣味。

3.2 多糖標準曲線的繪制

以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程：Y= 9.860 6X- 0.004 3（R2= 0.999 7 ）。

3.3 雞蛋參多糖提取單因素實驗

提取溫度為90℃、液料比為40 mL/g條件下，多糖提取率隨著時間的增加而增加，分別在60 min 和150 min 出現兩次顯著上升，考慮時間成本，本次響應面設計0 水平確定為60 min。提取時間為60 min、液料比為40 mL/g 條件下，多糖提取率隨著提取溫度升高提取率整體上呈現上升趨勢，雖在70、80℃略有回調，但與60℃并無顯著性差異。為了避免高溫對多糖結構的破壞，本次響應面設計0水平確定為60℃。提取時間為60 min、提取溫度為90℃條件下，多糖提取率隨著液料比的增加整體上呈現下降趨勢，可能因為多糖被吸附引起。本次響應面設計0水平確定為20 mL/g。

3.4 響應面法優化

3.4.1 實驗設計與結果

雞蛋參多糖提取工藝響應面優化實驗設計方案及結果見表2，該設計方案共設計了17 個實驗點的響應面分析實驗，其中析因點12 個，0 水平5 次重復。

表2 Box-Behnken設計方案及結果Tab.2 Box-Behnken design matrix and experimental values

3.4.2 雞蛋參多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

利用 Design-Expert 13 軟件對表2 中的實驗數據進行回歸分析，得到雞蛋參多糖提取率對提取液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3 個因素的回歸方程為：雞蛋參多糖提取率 = 50.29 + 1.47A +2.84B + 2.15C + 0.310 5AB - 0.178 9AC + 0.611 6BC -1.89A2- 0.863 2B2- 3.2C2，方差分析結果見表3。由表3 可以看出：模型F值為28.22，P值為0.000 1，P< 0.05，表明模型是顯著的；模型的失擬項P= 0.333 8，P> 0.1，表明失擬不顯著，即該模型是穩定的，能較好地預測實際雞蛋參多糖提取情況。相關系數R2為0.973 2，數值接近1，表明模型可信度良好。擬合模型的調整R2為0.938 7 和預測R2為0.750 2，差異值小于0.2，說明該模型預測情況與實際情況相一致。變異系數為1.81，該系數數值偏低，表明實驗值的精度高，可靠性強。因此，該模型對試驗的擬合較好，可以預測雞蛋參多糖不同提取條件下的評價指標。模型一次項A、B、C以及二次項A2、C2差異均極顯著（P< 0.01），表明3 個因素對雞蛋參多糖提取過程具有重要影響，二次項A2、C2對結果也有顯著影響，而交互作用系數均大于0.05，表明交互作用對最終結果的影響作用較弱。

表3 Box-Behnken回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of Box-Behnken response surface regression model

3.4.3 響應面分析及優化

對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，3個因素之間交互作用對雞蛋參多糖提取率的影響如圖1所示?？筛鶕憫鎴D坡度陡峭程度、等高線密集度以及等高線形狀判斷因素間交互作用的影響程度，3 個因素之間的交互作用響應面圖有一定坡度，但等高線分布較稀疏，等高線形狀接近圓形，表明各因素間交互作用對雞蛋參多糖提取率的影響均不顯著，這與方差分析結果相一致。利用Design-Expert 13 軟件進行最佳條件預測，可得出雞蛋參多糖最佳提取工藝參數，液料比為24.50 mL/g，提取時間為88.79 min，提取溫度為62.66℃，多糖提取率為53.11%。為了便于實際操作，將雞蛋參多糖提取工藝微調為液料比25 mL/g，提取時間為90 min，提取溫度為63℃。在此提取工藝參數下，重復5 次提取雞蛋參多糖，最終得多糖提取率為（52.43 ± 1.61）%，與預測值接近，表明用響應面來優化雞蛋參多糖的提取工藝條件可行。

圖1 因素間交互作用對雞蛋參多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot of the interaction between factors on extraction rate of CCP

3.5 雞蛋參多糖體外抗氧化活性

雞蛋參多糖體外抗氧化活性結果見圖2 ~ 4，其對DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥基自由基均具有一定的清除能力，清除ABTS 自由基和羥基自由基的效果較好，DPPH 自由基較弱。在質量濃度范圍0.13 ~ 4 mg/mL 內，雞蛋參多糖溶液對3 者自由基的清除能力呈現非線性依賴性，濃度為4 mg/mL時，羥基自由基清除率為（54.89 ± 2.26）%，ABTS 自由基清除率為（54.37 ± 0.42）%，DPPH 自由基清除率為（38.13 ± 2.56）%，表明雞蛋參多糖具有一定抗氧化活性。

圖2 雞蛋參多糖對羥基自由基的清除曲線Fig.2 Hydroxyl radical scavenging curve of CCP

圖3 雞蛋參多糖對ABTS自由基的清除曲線Fig.3 ABTS radical scavenging curve of CCP

圖4 雞蛋參多糖對DPPH自由基的清除曲線Fig.4 DPPH radical scavenging curve of CCP

4 討論

雞蛋參為桔?？泣h參屬多年生草本植物，塊莖具有補養氣血、健脾、生津清熱的功效，主要分布在我國西南部。雞蛋參是一種常用的藏藥，《衛生部藥品標準藏藥分冊》和《青海省藏藥炮制規范（2010年版）》均有收錄，其藏藥名為“尼哇”，藏成藥“十味龍膽花顆?！焙汀笆洱埬懟z囊”組方中均含有雞蛋參。雞蛋參野生資源并不豐富，甚至多次被列為瀕危藏藥材，為了保障雞蛋參藥材資源的供給，目前關于雞蛋參的研究多集中在人工繁育技術方面，而關于雞蛋參多糖提取及其活性的研究較少，本文對雞蛋參多糖的提取及抗氧化活性開展了研究。

多糖的提取有多種方法，如超聲、微波等，雖然這些方法各具特點，但熱水提取法作為一種傳統方法，具有易于擴大生產的優勢，然而熱水提取法存在提取率較低的缺陷。前期實驗發現雞蛋參多糖含量高，即使采用熱水浸提法多糖的提取率仍然較高，因此本文選擇傳統的熱水浸提法作為提取雞蛋參多糖的方法。不同的提取工藝所得到的多糖，其結構及活性都存在一定差異，因此有必要開展多糖提取工藝考察，確保得到穩定的多糖。本文在單因素的基礎上綜合成本、穩定性等實際情況，采用響應面優化雞蛋參多糖水提工藝，確定最佳提取條件為：提取時間90 min，提取溫度為63℃，液料比25 mL/g，在此條件下雞蛋參多糖提取率達到52.43%。雞蛋參多糖的制備需由水提液經過離心、濃縮、醇沉、洗滌而得，在這些制備過程中難免多糖損失，本研究以水提液中多糖提取率為指標考察提取工藝，避免了制備過程中因多糖損失而引起的誤差。經優選出的提取工藝所提取的雞蛋參多糖對自由基具有一定清除能力，表明其具有一定抗氧化活性，且抗氧化作用隨著濃度的增大而增強。雞蛋參多糖含量高、制備簡單且具有一定活性，值得進一步開發利用。