基于Caspase-3/PARP通路探究龜鹿二仙膠及拆方對IL-1β誘導的退變軟骨細胞凋亡及細胞外基質的影響

吳偉欣,鄭珍萍,顧富城,楊美鑫,王和鳴,李 楠,3

(1. 福建中醫藥大學中醫學院,福建 福州 350122;2. 福建中醫藥大學,福建 福州 350122;3. 中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室,福建 福州 350122)

膝骨關節炎是一種以關節軟骨退變為特征的慢性退行性骨關節疾病,其發生后,軟骨細胞的穩態環境受到破壞,繼而發生軟骨細胞凋亡、軟骨下骨硬化,而軟骨退變又與軟骨細胞凋亡程度及細胞外基質(ECM)分解合成密切相關,因此,如何減少軟骨細胞凋亡及調節ECM分解合成平衡成為治療膝骨關節炎的關鍵[1-4]。王和鳴教授從“腎主骨生髓”理論出發,在臨床上運用龜鹿二仙膠填精補髓治療膝骨關節炎取得良好療效[5]。課題組前期研究證實,龜鹿二仙膠及拆方均能有效抑制軟骨細胞凋亡,對軟骨ECM也有一定調控作用[6-7]。但龜板膠和鹿角膠對ECM分解合成平衡的影響還有待進一步觀察。此外有研究表明半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)信號通路參與細胞凋亡[8],但目前國內外研究尚未見中藥治療膝骨關節炎的作用機制是否與該信號通路有關。因此本研究基于該信號通路,探究了龜鹿二仙膠及拆方對白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的退變軟骨細胞凋亡及ECM的作用及可能保護機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 2月齡清潔級SD大鼠40只,體重(200±20)g,雌雄各半,委托福建中醫藥大學動物實驗中心代購和飼養(動物使用許可證號:[SYXK(閩)2019-0007]),用于含藥血清的制備;4周齡清潔級C57BL/6小鼠60只,體重(90±10)g,雌雄不限,用于原代野生型軟骨細胞提取。動物均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,實驗動物合格證號:SCXK(滬)2017-0005。

1.2藥物 龜鹿二仙膠由龜板膠9 g、鹿角膠6 g、人參6 g、枸杞9 g構成,各味藥物批號分別為1175,951,448,203,均購自閩侯縣上街致誠醫藥商店。

1.3主要設備 ChemiDocXRS化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司),9600 PCR擴增儀(美國PE公司),ABI7500 7500 Real-Time PCR儀(美國ABI公司),E163302 CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司),熒光顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司),DG5033A酶聯免疫檢測儀(上海繼錦化學科技有限公司)。

1.4主要試劑 IL-1beta protein[亞科因(武漢)生物技術有限公司,批號:prp1119-5μg];CCK-8試劑盒(北京全式金生物技術有限公司,批號:fc101-03);基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)Rabbit PolyClonal antibody[美國proteintech(PTG)公司,批號:18165 -1-AP];Mouse anti GAPDH Monoclonal antibody[美國proteintech(PTG)公司,批號:60004-1-Ig];PARP-1 Mouse Monoclonal Antibody[美國proteintech(PTG)公司,批號:66520-1-Ig];Anti-聚集蛋白聚糖(Aggrecan) antibody(美國abcam公司,批號:ab36861);Anti-Caspase-3 antibody(美國abcam公司,批號:ab13847);HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(美國lablead公司,批號:R123-01);Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美國lablead公司,批號:SA00001-1);熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green qPCR Mix,美國biosharp公司,批號:BL698A);TUNEL試劑盒(上海翊圣生物有限公司,批號:40306ES50)。

1.5實驗方法

1.5.1空白血清和含藥血清的制備 將SD大鼠按照隨機數字表法分為4組各10只:空白血清組按10 mL/kg的量給予生理鹽水灌胃;龜鹿二仙膠含藥血清組、龜甲膠含藥血清組及鹿角膠含藥血清組按人與動物等效劑量比值換算給藥量[9],分別灌胃2.7 g/kg龜鹿二仙膠、0.81 g/kg龜甲膠、0.54 g/kg鹿角膠;均2次/d,連續7 d。末次灌胃2 h后,采用1.25 g/kg烏拉坦麻醉大鼠[10],腹主動脈采血,室溫靜置2 h,3 000 r/min離心15 min,吸上清,滅活后0.22 μm濾膜過濾,-20 ℃冰箱保存備用。

1.5.2軟骨細胞的培養 參考文獻[11]方法進行小鼠軟骨細胞提取,無菌操作,用刀片刮取雙側膝關節透明的軟骨組織,更換新刀片將軟骨組織切碎至約1 mm3大小,經消化后獲得軟骨細胞懸液,用含10% FBS及1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基重懸軟骨細胞,接種于T25細胞培養瓶中,置于培養箱中培養(5%CO2、37 ℃),標記為原代,待細胞融合約90%后進行傳代培養。采用Ⅱ型膠原免疫熒光染色對第1代軟骨細胞進行鑒定[12]。

1.5.3細胞分組及干預培養 將軟骨細胞分為空白組、模型組、龜鹿組、龜板組、鹿角組,每組各1塊6孔板。除空白組外,其余組均給予10 ng/mL IL-1β干預24 h,之后空白組、模型組加入10%空白血清培養,龜鹿組加入10%龜鹿二仙膠含藥血清培養,龜板組加入10%龜板膠含藥血清培養,鹿角組加入10%鹿角膠含藥血清培養。培養24 h后,倒置相差顯微鏡觀察,進行相應指標檢測。

1.5.4檢測指標及方法

1.5.4.1軟骨細胞活性 各組細胞培養24 h后,向每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h,酶標儀檢測細胞在450 nm下的光密度(OD)。

1.5.4.2軟骨細胞凋亡情況 采用TUNEL法檢測:各組細胞培養24 h后,棄培養液,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,配制Proteinase K工作液,1×Equilibration Buffer室溫孵育,TdT孵育緩沖液避光孵育,DAPI染核封片,熒光顯微鏡觀察。

1.5.4.3軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1表達情況 采用免疫熒光染色法檢測:各組細胞培養24 h后,棄培養液,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,常規通透、封閉,Caspase-3及PARP-1抗體孵育過夜,加入熒光二抗,DAPI染核封片,熒光顯微鏡觀察,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析檢測數據,計算平均熒光強度。

1.5.4.4軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:各組細胞培養24 h后,加入含有RIPA裂解液的蛋白酶抑制劑混合液提取總蛋白并定量,每組按50 μg總蛋白在恒壓條件下進行電泳,然后采用濕轉法進行轉膜,封閉,加入GAPDH及Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan一抗(抗體稀釋比例分別為1∶10 000,1∶1 000,1∶1 000,1∶1 000,1∶3 000)孵育過夜,洗膜后加二抗(1∶10 000),37 ℃孵育1 h,洗膜,滴加超敏ECL化學發光劑凝膠顯影。采用Image Lab軟件對條帶進行成像,選取曝光恰當的圖片保存,分析并計算相應條帶的灰度值。

1.5.4.5軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA表達情況 采用qRT-PCR法檢測:各組細胞培養24 h后,以Simply P總RNA提取試劑盒提取軟骨細胞的總RNA,使用紫外分光光度計測量細胞的總RNA濃度和純度。根據所測得的濃度計算含有500 ng的總RNA所需體積,按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒說明進行反轉錄,最后按照SYBR Green qPCR Mix說明進行qRT-PCR反應,采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan引物均由上海博尚生物工程技術有限公司進行合成,引物序列見表1。

表1 Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan及GAPDH基因的引物序列

1.6統計學方法 通過SPSS 23.0統計軟件對本

2 結 果

2.1軟骨細胞形態 倒置相差顯微鏡下見原代軟骨細胞培養至第3天細胞貼壁完成,進入快速增殖階段;培養至第11天,軟骨細胞均勻鋪滿瓶底,呈典型的“鋪路石”狀。第1代軟骨細胞形態結構與原代一致,增殖速度較快,隨著傳代次數的增加,ECM減少,COL2A1結構發生改變,細胞增殖速度減慢,逐漸表現為長梭形或形態不規則,因此選用第1代軟骨細胞進行后續實驗。見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下小鼠軟骨細胞形態

2.2軟骨細胞鑒定 熒光顯微鏡下,在不同吸收光波及發射光波激發下,COL2A1染色陽性為紅色熒光;經DAPI試劑復染后,細胞核出現清晰藍色熒光,細胞質及胞膜均出現清晰的紅色熒光,表明軟骨細胞表達COL2A1,具有軟骨細胞特性。見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下小鼠第1代軟骨細胞形態

2.3軟骨細胞活性及凋亡情況 與空白組比較,模型組軟骨細胞活性明顯降低(P<0.05),軟骨細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組軟骨細胞活性均明顯升高(P均<0.05),軟骨細胞凋亡率均明顯降低(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組軟骨細胞活性更高(P均<0.05),軟骨細胞凋亡率更低(P均<0.05);龜板組軟骨細胞活性和軟骨細胞凋亡率均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見表2及圖3。

圖3 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞凋亡情況(TUNEL檢測)

表2 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞活性及凋亡情況比較

2.4軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1陽性表達情況 模型組Caspase-3、PARP-1平均熒光強度均明顯高于空白組(P均<0.05);龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1平均熒光強度均明顯低于模型組(P均<0.05),且龜鹿組Caspase-3、PARP-1平均熒光強度均明顯低于龜板組及鹿角組(P均<0.05),龜板組Caspase-3、PARP-1平均熒光強度均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見圖4、圖5及表3。

圖4 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中Caspase-3表達情況(免疫熒光染色)

圖5 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中PARP-1表達情況(免疫熒光染色)

表3 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1陽性表達平均熒光強度比較

2.5軟骨細胞中 Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達情況 與空白組比較,模型組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對表達量均更低(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對表達量更高(P均<0.05);龜板組Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白相對表達量均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見圖6及表4。

圖6 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達免疫印跡

表4 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白相對表達量比較

2.6軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA表達情況 與空白組比較,模型組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對表達量均更低(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對表達量更高(P均<0.05);龜板組Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA相對表達量均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見表5。

表5 空白組和白細胞介素-1誘導各組小鼠軟骨細胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA相對表達量比較

3 討 論

膝骨關節炎屬于中醫“痹證”范疇,其中辨證為肝腎虧虛證者多表現為腰膝酸軟、倦怠乏力,甚或肌萎無力,不耐久行[13]。龜鹿二仙膠出自《醫方考》,具有填補精髓、益氣壯陽之功,正是針對膝骨關節炎肝腎虧虛而設。

目前認為關節局部長期存在的炎癥環境在膝骨關節炎軟骨退變中發揮著至關重要的作用,其中IL-1β起到尤為關鍵的作用[14-15]。IL-1β激活能夠引起ECM降解,誘導軟骨細胞凋亡[16-17]。關節軟骨由軟骨細胞和ECM組成,而軟骨細胞是關節軟骨的主要組成部分,軟骨細胞凋亡是膝骨關節炎發生的主要原因[18-19]。因此,抑制軟骨細胞凋亡可能是防治膝骨關節炎的有效途徑。本實驗結果表明,IL-1β誘導的軟骨細胞活性明顯降低,細胞凋亡率升高;給予龜鹿二仙膠及拆方干預后,軟骨細胞活性升高,細胞凋亡率降低,其中龜鹿二仙膠抑制凋亡的作用優于龜板膠及鹿角膠,龜板膠優于鹿角膠,這與前期研究報道一致[6-7];而鹿角膠提高軟骨細胞活性的作用強于龜板膠。

ECM分解代謝大于合成代謝是膝骨關節炎發生的另一重要機制[20]。相關研究表明,IL-1β在誘導ECM降解過程中也發揮了重要作用[21],其既可抑制軟骨細胞Aggrecan合成,又能促進MMP-13的表達以促進ECM的降解,從而加速軟骨組織的破壞[22]。本研究結果也發現,IL-1β能顯著上調軟骨細胞MMP-13蛋白及mRNA表達,下調Aggrecan蛋白及mRNA表達;在龜鹿二仙膠及拆方作用下,MMP-13 蛋白及mRNA表達下調,Aggrecan蛋白及mRNA表達上調,從而維持ECM合成與分解代謝之間的平衡,且龜鹿二仙膠藥效強于龜板膠及鹿角膠。

為了進一步探究龜鹿二仙膠及拆方抑制IL-1β誘導軟骨細胞凋亡及ECM降解的作用機制,本研究對Caspase-3通路相關因子進行檢測。Caspase屬于IL-1轉化酶家族,Caspase-3是凋亡通路的關鍵基因,可通過激活下游靶基因PARP,促進細胞凋亡[23]。本實驗結果表明,龜鹿二仙膠及拆方各組IL-1β誘導的軟骨細胞中Caspase-3及PARP-1平均熒光強度、蛋白及mRNA表達均明顯下調,說明龜鹿二仙膠及拆方可抑制Caspase-3/PARP信號通路的激活。

綜上所述,龜板膠可抑制軟骨細胞凋亡及ECM降解,鹿角膠可促進軟骨細胞增殖和ECM合成代謝,龜鹿二仙膠作用效果優于龜板膠及鹿角膠,其作用機制可能與抑制Caspase-3/PARP信號通路的激活有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。