壯醫經筋推拿對神經病理性疼痛大鼠去泛素化酶BRCC3介導NLRP3去泛素化修飾的影響及鎮痛機制

王天翊,唐宏亮,梁英業,龐 軍,盧棟明,唐業妮,鄭玉嬌,何育風

(1. 廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530000;2. 防城港市中醫醫院,廣西 防城港 538000;3. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530000)

神經病理性疼痛(NPP)臨床癥狀復雜多樣且發病率高,以自發性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為主要特征[1-3],我國NPP患者達數千萬人,并呈現逐年上升的發展趨勢。壯醫經筋推拿療法是在中醫十二經筋理論結合壯醫學“三道兩路”理論及“筋結”致痛學說指導下的一種民族療法,其特色技術是“查灶術”和“松筋術”。前期研究證明,壯醫經筋推拿可通過減少炎癥因子釋放起到鎮痛效果[4-6],但其具體起效機制研究尚不明確。相關研究發現,在NOD樣受體家族熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)活化的啟動過程中發生了去泛素化,泛素標記NLRP3翻譯后的狀態導致NLRP3不能寡聚化,只有啟動信號激活去泛素化酶BRCC3,作用于NLRP3使其去泛素化后才可激活炎癥因子[7-8]。故本實驗觀察了壯醫經筋推拿對去泛素化酶BRCC3介導NLRP3去泛素化修飾的影響,從泛素化角度探討推拿鎮痛的機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 45只健康雌性SD大鼠,SPF級,6～8周齡,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產許可證號:SCXK(湘) 2019-0004,使用許可證號:SYXK(桂)2019-0001。大鼠單籠適應性飼養7 d,室溫保持20～25 ℃,濕度35%～45%,自由飲用自來水,飼用普通清潔鼠飼料,每日更換籠具與墊料。所有的實驗操作嚴格參照廣西中醫藥大學規定的關于實驗動物的飼養與使用的規定以及清醒狀態下的動物進行疼痛實驗的操作指南進行,且實驗經廣西中醫藥大學實驗動物倫理審查并批準(DW20230302-017)。

1.2試劑與儀器 Life TRIzol Reagent RNA提取試劑(美國Life Invitrogen公司,貨號:15596026),GoScriptTMReverse Transcriptase[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd,貨號:A5000],GoTaq?qPCR Master Mix[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd,貨號:A6001],白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,48T,貨號:E-EL-R0567c)。 YI-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠),高速冷凍離心機(美國Thermo公司,型號:ST16R),全波長多功能酶標儀(北京龍躍生物科技發展有限公司,型號:Infinite M200 PRO),NanoDrop儀器(美國賽默飛公司,型號:ND-ONE-W),熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號:Roche Light Cycler 96),按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發明專利號:ZL 200710187403.1),Von Frey機械刺痛測試包(上海軟隆科技發展有限公司,型號:BW806),熱板痛覺測試儀(美國IITC公司)。

1.3實驗方法 采用隨機數字表法將大鼠隨機分為5組,每組9只。模型組、假推拿組、壯醫經筋推拿組大鼠參照文獻[6]方法建立神經病理性疼痛模型:術前12 h禁食,采用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉后,將大鼠俯臥固定頭和四肢,定位兩側髂后上嵴,在左側髂后上棘與脊柱之間且平行于脊柱方向做一長約2 cm縱向切口,鈍性分離各層組織,用咬骨鉗夾斷橫突,鈍性分離L5脊神經,用5-0的可吸收性羊腸線雙層結扎,清洗后縫合傷口,對側不進行任何處理。假手術組手術步驟同上,但僅暴露脊神經而不結扎;正常組僅進行日常飼養。于術后第1天開始,壯醫經筋推拿組用布袋束縛大鼠后,采用按摩推拿手法模擬儀依次刺激脊神經結扎節段相應體表部位及所結扎神經支配區域(以1 cm為間隔),再選擇腰部及下肢2個治療點(模擬腰椎間盤突出癥疼痛部位),以臨床常用松筋解結手法的點、撥、揉法,采用按摩推拿手法模擬儀并用4N的按摩力量以直徑10 mm的圓形光滑接觸面按摩頭進行推拿,每法每處各推拿1 min,每只大鼠每天共治療9 min,連續干預14 d;假推拿組大鼠每天采用布袋束縛后輕輕撫摸其雙側后肢9 min,連續干預14 d;其他3組都不進行干預,只觀察14 d。

1.4檢測指標及方法

1.4.1痛覺閾值 分別于術前及術后1 d、3 d、14 d進行測定。機械性痛閾值測定參考文獻[9]:設定室溫為25 ℃,將大鼠置于四周粘上紅紙、底層為鐵絲網的籠子內,待大鼠適應15 min后,采用VonFrey纖維絲依次加大力度刺激手術側后肢足底中部,每次持續刺激3～4 s,記錄大鼠最小的后足收縮閾值。熱痛覺閾值測定方法參考文獻[10]:設定室溫為25 ℃,熱板痛覺測試儀調至(55±0.2)℃,將大鼠放置于測試儀的封閉且透明玻璃盒內并啟動計時器,當觀察到大鼠出現快速抬足、頻繁舔足等現象時停止計時并做記錄。2種測定方法均連續測定3次,每次間隔5 min,取平均值。

1.4.2脊髓背角中BRCC3和NLRP3 mRNA表達情況 術后14 d處死各組大鼠,迅速取出L4-6脊髓背角組織,立即放入液氮冷卻后轉移至-80 ℃保存。運用TRIzol法提取大鼠脊髓背角組織中總RNA,加入1 mL TRIzol試劑將組織研磨成勻漿后,按試劑說明書提取RNA,使用 NanoDrop儀器測定RNA濃度和純度,采用GoScriptTMReverse Transcriptase將RNA反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增。以β-actin為內參,于NCBI數據庫中查詢BRCC3、NLRP3的引物序列,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成并純化,引物序列見表1。PCR擴增反應的總體積為20 μL,包括Nuclease-Free Water 7.2 μL、上下游引物各0.4 μL、GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 2 μL。反應條件:預變性95 ℃ 10 min;變性擴增95 ℃ 15 s、退火60 ℃ 1 min,共40個循環。實驗重復3次,采用2-ΔΔCT法計算BRCC3、NLRP3 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.4.3血清IL-1β水平 取各組大鼠腹主動脈血,在4 ℃下以3 000 r/min的速度離心15 min,收集上層血清,采用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β水平。

2 結 果

2.1各組大鼠機械性痛覺閾值比較 術后1 d、3 d,各手術組大鼠的機械性痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),模型組、假推拿組、壯醫經筋推拿組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05);術后14 d,正常組、假手術組和壯醫經筋推拿組大鼠的機械性痛覺閾值均明顯高于模型組和假推拿組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠機械性痛覺閾值比較

2.2各組大鼠熱痛覺閾值比較 術后1 d,各手術組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),各手術組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05);術后3 d,各手術組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),假手術組和壯醫經筋推拿組均明顯高于模型組和假推拿組(P均<0.05),壯醫經筋推拿組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05);術后14 d,假手術組、模型組、假推拿組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),假手術組明顯高于模型組(P<0.05),壯醫經筋推拿組明顯高于模型組、假推拿組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠熱痛覺閾值比較

2.3各組大鼠脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較 術后14 d,正常組與假手術組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05);模型組和假推拿組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量均明顯高于正常組和假手術組(P均<0.05),壯醫經筋推拿組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量均明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05)。見表4。

表4 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠術后14 d脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較

2.4各組大鼠血清IL-1β水平比較 正常組、假手術組、模型組、假推拿組、壯醫經筋推拿組血清IL-1β水平分別為(50.50±2.39)pg/mg、(57.46±1.42)pg/mg、(71.03±0.96)pg/mg、(63.38±1.25)pg/mg、(53.41±1.72)pg/mg,模型組明顯高于正常組和假手術組(P均<0.05),壯醫經筋推拿組明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05)。

3 討 論

壯醫是認識人體的基本理論,可以統稱為“三道兩路”,其內涵是指“水道”“谷道”“氣道”以及“火路”“龍路”。龍路在人體內指血液運行的通路,火路則可與現代醫學中人體的神經系統相對應?；谝陨险J識,壯醫提出“因結致痛”:各種病理性因素的作用下,導致局部組織受力不平衡,產生病理性損傷,形成“橫絡”“條索”與“結節”等局部病灶即筋結,筋結在龍路中積聚進而造成龍路的血液循環障礙,同時又因為龍路血液循環的異常,對火路產生作用,產生相關疼痛信號并通過火路傳入大腦(“巧塢”),最終導致龍路不通、火路失調而發病。壯醫經筋手法以松結、解結、破結為治療原則。在手法操作過程中,壯醫注重“以灶為腧的原則”,治療前先沿著經筋的尋行路線探索結節部位,以方便治療中著重施術[11],以充分發揮松解經筋循行之處的緊繃狀態,恢復經筋氣血循行的作用。

泛素化主要是指泛素在多種酶的作用下,識別細胞內靶蛋白,并結合至靶蛋白的過程。去泛素化指泛素分子通過去泛素化酶水解C-端羧基與靶蛋白賴氨酸側鏈ε-氨基或α-氨基之間的異肽鍵,即將蛋白底物中的泛素鏈水解開,從而使26S蛋白酶體途徑和溶酶體途徑無法水解底物[12]。NLRP3的活化過程中,首先是泛素標記NLRP3翻譯產物使其不能寡聚化,直到去泛素化酶BRCC3被其他因子激活,才使NLRP3去泛素化從而具有活性[7-8]。

炎癥小體是由多種蛋白質組成的復合體,主要由炎性蛋白傳感器分子、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和 酶原pro-Caspase-1組成,其進一步介導pro-IL-1β的成熟和分泌,作為該炎癥小體活化的必要條件[13],它在炎癥及NPP中發揮重要作用[14]。NLRP3是NOD樣受體家族中的重要成員,ASC介于NLRP3與 pro-Caspase-1之間,NLRP3與ASC相互作用從而激活pro-Caspase-1使其自我切割形成Caspase-1,NLRP3進一步使具有生物活性的Caspase-1裂解GasderminD,從而導致細胞焦亡。1L-1β在炎癥疾病過程中發揮重要作用[15],其前體形式為無活性的 pro-IL-1β,NLRP3炎癥小體可以介導其成熟,使其成為具有生物學活性的IL-1β[16],然后分泌到細胞外,產生局部或者全身的炎癥反應。

本實驗結果顯示,短時間的推拿干預對NPP大鼠機械性痛覺閾值影響并不明顯;壯醫經筋推拿組術后3 d的熱痛覺閾值和術后14 d的機械性痛覺閾值、熱痛覺閾值均明顯升高,提示推拿一段時間后降低了NPP大鼠的痛敏反應,大鼠對于熱刺激的反應較機械性刺激的反應更為敏感。術后14 d,模型組脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA表達上調,血清IL-1β水平增高,提示脊神經損傷促使脊髓部位去泛素化酶BRCC3、NLRP3及炎癥因子過表達;壯醫經筋推拿組脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量及血清IL-1β水平均較模型組降低,表明壯醫經筋推拿能夠抑制NPP大鼠脊髓背角去泛素化酶BRCC3的表達,抑制NLRP3的去泛素化修飾,從而阻止NLRP3的活化,阻礙IL-1β的成熟和分泌。假推拿組各指標較模型組有改善,但差異均無統計學意義,提示假推拿可以使大鼠情緒得到安撫,疼痛狀態有所緩解,但效果非常有限。

綜上所述,壯醫經筋推拿可能通過抑制去泛素化酶BRCC3的表達,抑制NLRP3的去泛素化修飾,從而阻止了NLRP3的活化,進而阻礙炎癥因子IL-1β的成熟和分泌,起到鎮痛作用,為壯醫經筋推拿治療NPP提供了新思路。但因NPP發病機制復雜,壯醫經筋推拿的鎮痛靶點及途徑還需進一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。